Montagem e uso de um sistema de crescimento gnótico vegetal para estudos de interação planta-microrganismo em cereais

Resumo

Este protocolo descreve a montagem e uso de um novo sistema de crescimento gnotobiótico vegetal, projetado para acomodar cereais e validado em trigo e milho. Esse sistema gnotobiótico vegetal possibilita experimentos controlados planta-microrganismo ao fornecer condições de crescimento estéreis, manejo da irrigação e compatibilidade com substratos diversos de base no solo.

Resumo

O desenvolvimento de emendas agrícolas baseadas em microbianos que funcionem de forma consistente em campo requer compreensão dos mecanismos moleculares das interações planta-microrganismo. Estudar esses mecanismos subjacentes de interação exige a capacidade de cultivar plantas sob condições ambientalmente controladas e gnotobióticas (ou seja, todos os microrganismos que interagem com a planta são conhecidos, seja comunidades microbianas definidas livres de germes ou naturais). Os sistemas gnotobióticos vegetais atualmente disponíveis não são adequados para estudar plantas grandes de relevância agrícola, como cereais. Além disso, a maioria desses sistemas não tem capacidade para gerenciar a irrigação. Aqui, apresentamos o GNOVA, um novo sistema gnotobiótico projetado para acomodar plantas de cereais com capacidade de gerenciar a irrigação. Esse novo sistema é uma plataforma acessível composta por uma base impressa em 3D e materiais comercialmente disponíveis. Este protocolo fornece um guia passo a passo para montar o sistema e montar o experimento. Além disso, apresentamos uma comparação de desempenho do GNOVA com um sistema de bolsas gnotobióticas. O GNOVA estendeu o crescimento das plantas de duas semanas no sistema de sacos para 17 semanas para trigo e 4 semanas para milho. A taxa de germinação de ambas as culturas também aumentou dentro da GNOVA de 66% para 100% para trigo e de 75% para 100% para milho. O trigo cultivado dentro do GNOVA desenvolveu cultivadores, que estavam ausentes em plantas da mesma idade dentro do sistema de sacos. O peso fresco do milho cultivado na GNOVA foi 594% maior do que no sistema de saco. Além disso, a altura dos brotos e o comprimento das raízes do milho foram 89% e 57% maiores dentro do sistema GNOVA do que nos sacos, respectivamente. O sistema GNOVA amplia a caixa de ferramentas disponível para cientistas para a exploração das interações planta-microbiota além da fase de muda em cereais, proporcionando maior espaço de crescimento e manejo da irrigação.

Introdução

Tratamentos agrícolas baseados em micróbios despertaram grande interesse nas últimas décadas devido ao seu potencial de melhorar a produtividade das culturas ao aumentar o crescimento das plantas e a resiliência ao estresse ambiental. Ao mesmo tempo, os mecanismos moleculares de ação desses bioestimulantes permanecem pouco compreendidos, o que pode contribuir para seus resultados inconsistentes entre solos, locais e condições^{ambientais 1,2}. Promover a maior eficácia dos tratamentos existentes baseados em microrganismos e o desenvolvimento de novas tecnologias exige uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares da interação^{planta-microrganismo 3,4}. No entanto, dissecar esses mecanismos continua sendo desafiador devido à complexidade das comunidades microbianas^{naturais 5,6}. Para identificar os efetores microbianos e as interações que impulsionam os benefícios para as plantas, podemos reduzir a complexidade dos sistemas naturais empregando comunidades microbianas sintéticas (SynComs) dentro de sistemas de crescimento que permitem o controle das condições ambientais e da comunidade microbiana. A notobiologia, o estudo de hospedeiros associados a comunidades microbianas^{definidas 7}, permite aos pesquisadores comparar hospedeiros livres de germes com aqueles colonizados com comunidades microbianas conhecidas, a fim de relacionar a função microbiana ao fenótipo⁸ da planta.

Os primeiros sistemas gnotobióticos foram construídos usando tubos de ensaio de vidro^{9, 10, 11 e} frascos¹³. Desde então, vimos uma rápida expansão de novos sistemas desenvolvidos para estudar plantas de forma gnotobótica. Os sistemas mais comuns empregados hoje incluem o uso de placas de Petri¹⁴, tubos de^{ensaio 15, 16}, potes de vidro¹⁷, caixas^{magenta 18}, sacos lacrados¹⁹, hidroponia²⁰, FlowPot e GnotoPot²¹, sistemas microfluídicos²² e EcoFABs²³. Apesar desse progresso, a maioria dos sistemas é otimizada para imagens²² ou coleção de^{exsudatos 17, 20} ou projetada para pequenas espécies^{modelo 14, 18 e 21}. Muitos são sistemas fechados que limitam o controle da irrigação e a duração dos experimentos. Essas limitações representam desafios para o estudo de culturas agrícolas maiores, como cereais, que exigem espaço adicional, fluxo de ar e gestão da água.

Reconhecendo a necessidade de um sistema que possa acomodar plantas maiores e estudos mais longos, o EcoFAB 3.0 foi recentemente desenvolvido para expandir o cultivo gnotobiótico para plantas^{maiores 24}. O EcoFAB 3.0 oferece maior volume radicular e de espaço de cabeça, o que apoia o crescimento do Sorghum bicolor por até 4 semanas, e permite a coleta de exsudato e a imagem radicular²⁴. Embora esse novo sistema seja um exemplo promissor de extensão dos sistemas gnotobióticos para culturas agrícolas, ainda existe a necessidade de uma plataforma acessível e versátil que possa ser facilmente adotada em laboratórios e compatível com uma ampla gama de fluxos de trabalho experimentais. Por essa razão, desenvolvemos o GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), um sistema projetado para acomodar culturas de cereais sob condições gnotobióticas. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para montar e operar o GNOVA e demonstramos seu desempenho em relação a um sistema de bolsas gnotobióticas rotineiramente usado em nosso laboratório. Com o desenvolvimento desse novo sistema, melhoramos a capacidade de cultivar trigo e milho em condições estéreis, proporcionando um espaço de crescimento maior e irrigação embutida em comparação com sistemas fechados anteriores. O desempenho do GNOVA é comparável ao do EcoFAB 3.0, ampliando assim o repertório de ferramentas para dissecar interações planta-microbioma em culturas cereais não modelo. Além disso, a versatilidade e adaptabilidade da gnobiótica vegetal são aprimoradas pelo design simples do GNOVA, uso de materiais comercialmente disponíveis e arquivos de objetos 3D disponíveis, que permitem aos pesquisadores alterar materiais e projetos para ajustar suas necessidades de pesquisa e orçamento.

Protocolo

NOTA: Arquivos de impressão 3D para a base podem ser encontrados nos materiais suplementares e estão disponíveis publicamente em Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Para rapidez e eficiência de custos, recomendamos imprimir em grande quantidade em fornecedores locais de serviços comerciais de impressão 3D.

1. Montagem do sistema gnomiótico

1. Inicie a montagem do potenciômetro (execute uma vez antes do uso experimental repetido).
   1. Feche o fundo do vaso colocando o círculo de malha de aço inoxidável sobre uma das extremidades do tubo de policarbonato e fixando o círculo usando a braçadeira de mangueira (Figura 1A).
   2. Perfure aberturas de irrigação criando uma abertura de irrigação de 1/4 de polegada (6,35 mm) a 1,5 cm da borda superior da extremidade aberta do tubo de policarbonato. Fure duas ranhuras de 1/8 de polegada (3,18 mm) a 3 cm da primeira abertura, com uma ranhura a 1 cm da borda e a outra a 2 cm da abertura superior.
      NOTA: Se necessário, podem ser adicionadas linhas de tubo adicionais ao redor da borda superior do vaso seguindo os mesmos passos.
   3. Instale o tubo de irrigação inserindo um pequeno trecho de tubo de silício pela abertura de 1/4 de polegada.
   4. Fixe o tubo passando a abraçadeira pelas duas ranhuras de 1/8 de polegada (Figura 1B). Insira o luer macho de encaixe 1 no tubo de silicone que se estende para fora do potenciômetro (Figura 1C).
      NOTA: A barbilha da mangueira do encaixe 1 deve estar exposta.
   5. Prepare os canos da seringa enchendo um barril vazio com lã de vidro e fechando a extremidade com um pequeno pedaço de papel alumínio (Figura 1C).
   6. Prenda um pequeno pedaço de tubo de silicone na extremidade do luer lock do barril da seringa (Figura 1C).
   7. Prepare dois canos de seringa idênticos. Prenda um dos canos preparados da seringa à espiga exposta da mangueira do encaixe 1 no tubo que se estende para fora do pote (Figura 1D).
   8. Pausa: Potenciômetros montados podem ser armazenados para uso experimental posterior.

Figura 1: Montagem do pote. A) Fundo do pote fechado com malha metálica e braçadeira de mangueira. (B) Porto de irrigação na borda superior do vaso. (C) A linha de irrigação termina com a mangueira exposta do Fitting 1 com cano de seringa preparado. (D) Vaso montado com linha de irrigação fechada Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação de vasos para o experimento (realizada antes de cada novo experimento)
   1. Forre o fundo do pote com dois círculos pré-cortados de tubos de fibra de vidro (Figura 2A).
   2. Prepare o substrato do solo misturando duas partes de argila com uma parte de areia. Adicione 840 mL de substrato ao vaso.
   3. Cubra os potenciômetros com uma tampa plástica e prenda com fita adesiva (Figura 2B).
   4. Panelas cheias de autoclave em ciclo seco a 121 °C por 30 minutos. Deixe esfriar durante a noite com tampas plásticas nos vasos. Re-autoclave no ciclo seco a 121 °C por 30 minutos. Deixe esfriar completamente. Mantenha os vasos cobertos com a tampa plástica.
      NOTA: Outros substratos de solo podem ser usados, mas a quantidade necessária por vaso deve ser otimizada com antecedência. O GNOVA também foi testado com 800 mL de argila 100% e 1 L de areia 100%. Outros substratos do solo podem exigir mais ciclos de autoclave ou diferentes configurações para esterilização completa.
      CUIDADO: Cuidado deve ser tomado ao remover potes do autoclave, pois o material ficará quente e as braçadeiras podem afrouxar. Certifique-se de que as braçadeiras da mangueira estejam bem apertadas depois de esfriadas antes de pegar os potencieros.
   5. Insira potenciômetros resfriados na base impressa em 3D. Coloque o vaso cheio de terra dentro da base impressa em 3D. Segure o vaso pela base, não pelos pilares de abertura, pois eles são a parte mais frágil.
   6. Passe o tubo de irrigação por uma das aberturas inferiores da base impressa em 3D (Figura 2C).
      NOTA: Não faça autoclave na base de suporte impressa em 3D, pois isso pode derreter a peça. Experimentos que exigem temperaturas acima de 60 °C podem precisar de um filamento alternativo resistente ao calor (veja a Tabela de Materiais).
   7. Mantenha os potes em temperatura ambiente após o autoclav e não remova a tampa plástica nem a seringa preparada até a montagem final do experimento.

Figura 2: Ilustração do pote preparado. (A) Fundo do pote forrado com um wrap de tubo de fibra de vidro. (B) Tampa da panela fechada com tampa plástica. (C) Vaso vazio encaixado dentro do design final da base impresso em 3D. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Preparação do cilindro de vidro (realizada antes de cada novo experimento)
   1. Cubra uma extremidade do cilindro de vidro com um filtro DW4 pré-cortado e prenda-o usando a fita de vinil (Figura 3A).
   2. Vire o cilindro de vidro para ficar de frente para a outra ponta aberta e prenda um anel de algodão dentro do tubo, a 14 cm da borda. Fixe o anel de algodão usando fita cirúrgica (Figura 3B).
   3. Feche a extremidade inferior do cilindro com uma faixa de esterilização usando dois elásticos (Figura 3B).
   4. Autoclave os cilindros de vidro preparados em um ciclo seco a 121 °C por 30 minutos antes do uso. Uma vez autoclave, armazene os cilindros de vidro estéreis em temperatura ambiente até que seja necessário, sem remover o envoltório.

Figura 3: Conjunto do cilindro de vidro. (A) Extremidade superior do cilindro de vidro fechada com meio filtrante DW4 e fita vinílica. (B) Extremidade inferior do cilindro de vidro equipada com anel de algodão e fechada com envoltura de esterilização e elásticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Preparação do filtro de irrigação (realizada antes de cada evento de rega, com exceção das etapas 1.4.4–1.4.6, que devem ser feitas apenas uma vez)
   1. Montar o suporte do filtro colocando a membrana do filtro PES (Figura 4A.4) entre o suporte do filtro (Figura 4A.5) e o disco do filtro (Figura 4A.3).
   2. Oriente o lado liso da membrana do filtro em direção à saída, garantindo que ela fique voltada para o topo do suporte do filtro (Figura 4A.1).
   3. Encaixe o anel de vedação (Figura 4A.2) no topo do suporte do filtro (Figura 4A.1). Prenda a tampa do filtro ao suporte do filtro. Só aperte à mão.
   4. Conecte os conectores. Insira o deslize macho do encaixe 2 na porta superior do suporte do filtro.
   5. Prenda um pequeno pedaço de tubo de silicone na extremidade da mangueira do filtro (Figura 4B). Insira o luer macho de uma conexão 1 na extremidade do outro cano preparado da seringa do passo 1.1.6 (Figura 4B).
   6. Conecte o filtro ao encaixe da espiga da mangueira no cano da seringa preparado.
   7. Autoclave os filtros montados em ciclo seco a 121 °C por 30 minutos. Aperte os filtros depois que esfriarem e antes do uso.
      NOTA: Recomenda-se preparar todos os filtros necessários e autoclá-los em uma caixa fechada de polipropileno. Uma vez autoclavados, os filtros de irrigação podem ser mantidos estéreis em temperatura ambiente até o uso, desde que a seringa preparada não seja removida.

Figura 4: Montagem do suporte do filtro. (A) Parte do suporte do filtro desmontada: 1. Topo do suporte do filtro, 2. O-ring, 3. Disco do filtro, 4. Membrana do filtro e 5. Suporte do filtro. (B) Suporte de filtro montado com um cano de seringa preparado correspondente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Configuração do experimento

1. Prepare e esterilize soluções e materiais pelo menos um dia antes de montar o experimento.
   1. Prepare meio de cultivo de plantas Murashige e Skoog 0,5X seguindo as instruções do fabricante. Meio autoclave em ciclo líquido a 121 °C por 30 minutos.
   2. Autoclave do dispenser desmontado com tampa de garrafa em ciclo seco a 121 °C por 30 minutos. Autoclave 1 L de água desionizada em ciclo líquido a 121 °C por 30 minutos.
   3. Placa de Petri de vidro autoclave, béqueres de 500 mL, peneiras de chá e pinças em ciclo seco a 121 °C por 30 minutos ao dia de antecedência.
      NOTA: Salvo indicação em contrário, os seguintes passos devem ser realizados em uma capela de fluxo laminar usando técnica asséptica.
2. Esterilize sementes na superfície.
   NOTA: O protocolo de esterilização de sementes na superfície dependerá da espécie de planta a ser utilizada. O sistema gnotobiótico foi testado tanto com trigo quanto com milho usando os seguintes protocolos de esterilização de sementes.
   ATENÇÃO: Use jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear água sanitária e hipoclorito de sódio, pois esses produtos químicos podem ser irritantes ou corrosivos para pele e olhos. O etanol é inflamável; Não use perto de chama aberta.
   1. Esterilização de sementes de^{trigo 25}
      1. Encher dois béqueres com 150 mL de etanol 95% v/v, um béquer com 150 mL de água sanitária doméstica não diluída e dois béqueres com 150 mL de água.
      2. Coloque sementes de trigo no coador de chá. Agite suavemente o coador de chá com sementes em um dos béqueres com etanol 95% v/v por um minuto.
      3. Transfira as sementes para um novo coador de chá. Agite suavemente os coadores de chá com sementes em água sanitária por 10 minutos.
      4. Transfira as sementes para um novo coador de chá. Agite suavemente os coadores de chá com sementes no outro béquer com etanol 95% v/v.
      5. Agite suavemente os filtros de chá com sementes em água estéril deionizada por 30 segundos. Agite suavemente os coadores de chá com sementes no outro béquer com água estéril desionizada por 2 minutos. Coloque sementes estéreis em uma placa de Petri estéril vazia.
   2. Esterilização de sementes de^{milho 26}
      1. Coloque sementes de milho em um tubo cônico de 50 mL. Encha o tubo cônico com etanol 70% v/v. Inverta suavemente o tubo cônico por 3 minutos.
      2. Decante etanol a 70% e encha o tubo cônico com sementes com hipoclorito de sódio 2% v/v. Inverta suavemente o tubo cônico por 3 minutos.
      3. Faça uma redução de hipoclorito de sódio a 2% e enxágue as sementes com água desionizada estéril. Dilua a água e enxágue as sementes com água quatro vezes. Coloque sementes de milho em uma placa de Petri estéril.
3. Adicione o inóculo microbiano ao meio quando aplicável.
   NOTA: Nenhum inóculo microbiano foi aplicado durante a otimização e testes de esterilidade do sistema gnotobiótico.
4. Monte os dispensers com tampa de garrafas e conecte-os aos frascos de mídia.
   NOTA: Como este é um sistema aberto, recomendamos que você tenha um recipiente para coletar o meio de fluxo. Descobrimos que usar uma assadeira funciona bem e permite movimentação fácil, mas exige esvaziar com frequência.
5. Remova a tampa plástica da panela e dispense 378 mL de médio na panela.
   NOTA: Isso corresponde a aproximadamente 70% de espaço poroso preenchido com água (WFPS), que deve ser ajustado ao usar outros substratos do solo. Use 360 mL para argila e 358 mL para areia.
   1. Semeie a semente esterilizada na profundidade adequada usando uma pinça estéril.
   2. Semeie trigo a uma profundidade de 1/2 polegada e milho a uma profundidade de 1 polegada. Alternativamente, semeie mudas pré-germinadas estéreis em GNOVA. Use sementes pré-germinadas para testes de crescimento do milho.
   3. Coloque a tampa plástica em cima da panela.

3. Montagem final e operação experimental

1. Transfira o vaso e o cilindro de vidro para uma câmara de crescimento. Segure o cilindro de vidro com o fundo virado para baixo, perto do pote.
2. Remova rapidamente a tampa plástica do pote e a película de esterilização do cilindro de vidro. Abaixe o cilindro de vidro sobre o topo, colocando-o na beirada da base impressa em 3D.
   NOTA: Uma chama (por exemplo, um queimador portátil de Bunsen) também pode ser colocada ao lado da panela durante a montagem final do sistema de crescimento para diminuir ainda mais o risco de contaminação.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que, ao trabalhar com chama aberta, não haja outros materiais inflamáveis nas proximidades. Preste atenção à posição da chama em relação ao seu corpo para evitar queimaduras.
3. Cultive plantas entre 4 e 17 semanas, dependendo da espécie, utilizando condições de crescimento específicas para cada espécie.
4. Cultive trigo em temperaturas diurnas/noturnas de 22 °C/16 °C e milho em 27 °C/23 °C. O fotoperíodo para ambas as plantas é de 12 horas apenas sob luzes fluorescentes.

4. Irrigação

1. Prenda um tubo longo de silicone no dispenser de tampa da garrafa.
2. Mantenha a esterilidade durante a rega usando uma chama portátil. Se uma chama portátil não for uma opção, faça a irrigação com água sanitária para manter a esterilidade.
3. Irrigação usando uma chama portátil.
   ATENÇÃO: Trabalhe cuidadosamente ao redor de chamas abertas para evitar lesões corporais e danos à instalação.
   1. Coloque a chama perto da linha de irrigação. Remova o cano da seringa da linha de irrigação e do suporte do filtro. Mantenha todas as extremidades dos tubos dentro da zona de chama.
   2. Prenda o suporte do filtro à linha de irrigação. Conecte os dois canos das seringas entre si. Conecte a outra peça longa de tubo de silicone no dispenser com tampa da garrafa à porta inferior do suporte do filtro.
   3. Dispense 150 mL de mídia Murashige e Skoog 0,5X. Separe os dois canos da seringa.
   4. Desconecte o tubo de silício do suporte do filtro e substitua por um único cano de seringa.
4. Irrigação usando água sanitária a 10%
   NOTA: Recomendamos o uso dessa estratégia de irrigação em grandes experimentos (n > 50) para aumentar o rendimento durante a irrigação.
   ATENÇÃO: Use jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear água sanitária.
   1. Dispense solução de água sanitária V/V a 10% em dois pequenos béqueres plásticos e coloque-os perto da linha de irrigação. Remova o cano da seringa da linha de irrigação e do suporte do filtro.
   2. Submerga todas as extremidades do tubo na solução de água sanitária a 10% até que seja necessário. Sacuda o excesso de água sanitária. Prenda o suporte do filtro à linha de irrigação do vaso.
   3. Conecte a outra peça longa de tubo de silicone do dispenser com tampa da garrafa à porta inferior do suporte do filtro.
   4. Dispense 150 mL de mídia Murashige e Skoog 0,5X. Desconecte o tubo de silicone do suporte do filtro.
      NOTA: O volume de irrigação é de 120 mL para areia e 360 mL para argila.
   5. Troque o filtro da linha de irrigação por um barril de seringa após sacudir o excesso de água sanitária.
      NOTA: Se o volume de irrigação mudar, espere aproximadamente 20 mL de meio para preparar a linha de irrigação.
5. Irrige vasos uma vez por semana. Ajuste o volume e a frequência da irrigação com base no objetivo do experimento e no substrato do solo utilizado. Se for usada 100% de areia, aumente a frequência da irrigação para duas vezes por semana.

5. Colheita

NOTA: Este protocolo de colheita foi seguido durante os testes e otimizações do sistema gnotobiótico. O protocolo de colheita deve ser modificado para acomodar objetivos específicos de pesquisa e o volume de amostras processadas.

1. Prepare e esterilize todas as soluções e materiais pelo menos um dia antes da colheita.
   1. Autoclave 4 L de água desionizada e 500 mL de 0,145 M NaCl, em ciclo líquido a 121 °C por 30 minutos por dia com antecedência.
   2. Tesoura e pinça de autoclave em ciclo seco a 121 °C por 30 minutos por dia antes.
      NOTA: Salvo indicação em contrário, os seguintes passos devem ser realizados em uma capela de fluxo laminar usando técnica asséptica. Se a esterilidade não for necessária para a coleta da amostra, todas essas etapas podem ser realizadas fora de um exaustor de fluxo laminar.
2. Transfira os sistemas gnotobióticos da câmara de crescimento para o laboratório e posicione-os próximos ao capuz de fluxo laminar.
3. Remova o cilindro de vidro do vaso e coloque rapidamente o recipiente na capela de fluxo laminar. Tire o potenciômetro da base impressa em 3D.
4. Segure a planta na base e despeje o substrato do solo em um vaso. Sacuda suavemente grandes tufos de substrato do solo das raízes.
   NOTA: Amostras de substrato do solo podem ser coletadas e processadas de acordo com o objetivo específico da pesquisa nesta etapa da colheita. O protocolo brevemente descrito aqui foi usado para testar a esterilidade dos solos.
5. Colheita do solo para contagem de bactérias^{do solo 27} usando diluição serial de placa única com^{mancha 28}.
   1. Encha os poços de uma placa de 96 poços com 270 μL de 0,145 M NaCl. Deixe a primeira fileira vazia. Adicione 1 g de substrato de solo a um tubo cônico de 15 mL com 9 mL de 0,145 M de NaCl.
   2. Vórtice na velocidade máxima por 5 minutos. Transfira 30 μL da amostra para um poço vazio da placa de 96 poços.
   3. Prepare sete diluições em série de cada amostra pipeteando 30 μL de cada amostra no poço abaixo contendo 270 μL de solução de NaCl.
   4. Misture bem pipetando para cima e para baixo entre cada transferência.
   5. Prepare a manchagem de diluição serial de placa única de cada amostra, banhando 10 μL de cada diluição serial em uma única placa R2A.
   6. Incline as placas para espalhar as gotas. Incube as placas em temperatura ambiente.
   7. Conte as unidades formadoras de colônias (CFU) e calcule CFU/g do solo.
6. Separe os brotos das raízes usando tesoura estéreis. Registre o peso do brote fresco.
7. Limpe as raízes sacudindo-as suavemente em um béquer com água desionizada. Sece as raízes com um secador e registre o peso fresco.
   NOTA: Material acima e abaixo do solo pode ser coletado neste ponto e processado de acordo com a metodologia mais adequada para a análise a jusante de interesse.

Resultados

Desenvolvemos o GNOVA, um novo sistema gnotobiótico para plantas, que permite o ambiente estéril e controlado necessário para examinar as interações planta–microrganismo. Esse novo sistema oferece 24,4 polegadas (62 cm) de espaço vertical para os brotos e um vaso de 1,3 L compatível com vários substratos de solo. O sistema totalmente montado tem cerca de 3 pés de altura (92,4 cm) e 4,57 polegadas (11,6 cm) de largura (Figura 5A–C). Comparado a outros sistemas, possui a maior capacidade vertical para crescimento de brotos e a segunda maior câmara radicular (Tabela Suplementar 1). O GNOVA requer apenas 0,0135^m2 de área de superfície na câmara de crescimento, tornando esse sistema compacto e manobrável. Esse sistema pode ser usado em câmaras de crescimento de alcance com folga vertical de 1,22 m. Todos os componentes desse sistema, exceto a base impressa em 3D, são autoclaváveis e compatíveis com autoclaves com dimensões de 24 polegadas × 24 polegadas × 36 polegadas (largura × comprimento × altura; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Isso simplifica o sistema experimental ao evitar a esterilização manual de peças individuais. Além disso, a maioria dos componentes desse sistema é reutilizável, o que mantém o custo de uso por experimento em aproximadamente 6 USD após o custo inicial de instalação de 54 USD por unidade (Tabela Suplementar 2). As condições ambientais dentro do GNOVA foram determinadas acompanhando a temperatura e a umidade relativa do sistema com uma planta de milho de uma semana por três dias. A temperatura dentro da GNOVA era, em média, +1,3 °C maior que a da câmara de crescimento (Figura Suplementar 1). As diferenças de temperatura dentro do sistema e da câmara foram maiores durante o ciclo de luz (média +2,5 °C) do que durante o ciclo escuro (média de +0,4 °C). A umidade relativa dentro da GNOVA era, em média, de 63%, em contraste com 34% na câmara de crescimento.

Figura 5: Renderizações do sistema GNOVA. (A) Modelo 3D do design final da base de suporte (B) Seção transversal do modelo 3D da base de suporte (C) Seção transversal do modelo 3D do GNOVA totalmente montado Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para garantir a esterilidade do sistema, realizamos um teste de quatro semanas de sistemas não irrigados e irrigados sem plantas. A contaminação no cilindro de vidro foi determinada por amostragem acima e abaixo do anel de algodão através de placas de cotonete direta. Não foi observado crescimento microbiano detectável acima de três colônias (ou seja, uma única colônia por terço da área de superfície amostrada) acima do anel de algodão tanto para amostras não irrigadas (n=4) quanto irrigadas (n=6) (Figura Suplementar 2A). Abaixo do anel de algodão, foi observado crescimento em uma réplica não irrigada, enquanto nenhum crescimento foi detectado em sistemas irrigados (Figura Suplementar 2B). Isso sugere baixo potencial de contaminação do cilindro de vidro, já que o crescimento microbiano estava presente apenas em réplicas limitadas abaixo do anel de algodão, que não está em contato com a planta. A contaminação do solo foi avaliada ao detectar diluições em série nas placas R2A (Figura Suplementar 2C). Nenhum crescimento microbiano substancial foi detectado em nenhuma das condições, exceto por um único réplica irrigado com contagem de unidades formadoras de colônias não marcáveis provenientes de diluições seriadas (ou seja, < 30 colônias). Além dos testes de esterilidade, realizamos uma comparação de desempenho entre trigo e milho cultivados dentro do GNOVA com nosso protocolo padrão de crescimento gnotobiótico de duas semanas em um sistema^{de sacos 19}. Para entender o efeito do tamanho pequeno e da falta de irrigação no desempenho das plantas, estendemos os períodos de crescimento no saco para corresponder aos do GNOVA. Embora o teor inicial de água do solo usado durante a instalação de ambos os sistemas tenha sido igualado, o GNOVA recebeu fertigação semanal, enquanto os sacos não. Para todas as comparações, usamos o sistema de bolsas como referência, pois esse foi o setup gnotobiótico inicial do nosso laboratório. Tanto o trigo quanto o milho alcançaram 100% de germinação dentro do GNOVA, enquanto no sistema de sacos, o trigo atingiu apenas 67% (n = 3) e o milho 75% (n = 8) (Figura 6).

Figura 6: Germinação de trigo (n = 3) e milho (n = 8) dentro do sistema GNOVA (roxo) e do sistema de sacos (verde). O resultado da germinação de cada replicado é representado por pontos no eixo y, seja como Sem germinação ou Germinado para cada sistema gnotobiótico. As barras representam a taxa de germinação (%) de cada espécie de planta dentro de diferentes sistemas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Um teste de crescimento para trigo e milho também foi realizado para determinar o período máximo viável de crescimento e o desempenho da planta dentro do GNOVA. Embora nosso protocolo padrão de sacos preveja apenas duas semanas de crescimento, estendemos o período de crescimento dentro dos sacos para além de duas semanas para uma comparação melhor entre os dois sistemas. Após duas semanas, o trigo cultivado dentro do GNOVA (n=3) já havia alcançado o estágio de crescimento de Zadock (GS) 13 (Figura 7A), enquanto no saco permaneceu no GS11. Na quinta semana, as plantas haviam alcançado GS21 dentro dos sistemas GNOVA, conforme indicado pelo aparecimento dos cultivadores (Figura 7B). Em contraste, os cultivadores estavam ausentes nos sistemas de sacos, e as plantas permaneceram no GS13. Esse estagnação no crescimento e a falta de mudanças fenológicas dentro do sistema de sacos levaram à interrupção das plantas nesse sistema na sexta semana. Plantas de trigo continuaram a crescer por mais cinco semanas dentro do GNOVA, onde foi observado um aumento no número de folhas e na biomassa (Figura 7C). Embora a biomassa do trigo tenha aumentado visualmente após 12 semanas de crescimento dentro do GNOVA, as plantas também começaram a apresentar mais folhas cloróticas, e o volume do cilindro de vidro foi preenchido pela biomassa vegetal (Figura 7D). O trigo foi cultivado por mais duas semanas depois disso (Figura 7E,F). No entanto, não houve aumento visual na biomassa e, portanto, o teste de crescimento foi encerrado às 17 semanas de crescimento. O crescimento do milho também foi avaliado dentro do GNOVA por quatro semanas e comparado ao milho cultivado em sacos (Figuras 8A, B). Neste experimento, sementes de milho foram esterilizadas e pré-germinadas antes de serem semeadas dentro do sistema GNOVA ou do saco. O peso do broto fresco e das raízes do milho foram significativamente diferentes entre os dois sistemas (teste t de duas amostras, valor p < 0,05, Tabela Suplementar 3). O milho cultivado em GNOVA tinha brotos e raízes frescos pesando, em média, 11,2 g e 5,7 g, respectivamente (Figura 8C,D). Em contraste, os brotos e raízes do milho cultivados dentro do saco tinham pesos frescos de 1,29 g e 1,15 g, respectivamente. No geral, a biomassa fresca de milho cultivada dentro do GNOVA aumentou 593% em comparação com o milho cultivado no sistema de saco. Além disso, o comprimento do broto e da raiz foi significativamente maior dentro do GNOVA do que nos sacos, respectivamente em 89% e 57% (Figuras 8E,F).

Figura 7: Crescimento do trigo dentro do protótipo GNOVA. (A) Trigo em duas semanas no estágio de crescimento (GS) 13 de Zadock. (B) Comparação do trigo após cinco semanas de crescimento em saco e GNOVA. Os cultivadores estão presentes dentro do GNOVA (GS21) e ausentes no saco (GS13). (C) Aumento da biomassa de trigo após 10 semanas de crescimento. (D) Aumento da biomassa de trigo após 13 semanas de crescimento com o aparecimento de folhas cloróticas. (E) Aumento adicional da biomassa de trigo após 15 semanas de crescimento. F) A biomassa de trigo ocupa a maior parte do volume de crescimento disponível após 17 semanas de crescimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Crescimento do milho dentro do protótipo GNOVA (roxo) em comparação com o sistema de sacos (verde). Barras indicam valores médios ± erro padrão (n=4) (A) Milho cultivado por quatro semanas em GNOVA e sistema de sacos. (B) Comparação de tamanho das plantas colhidas cultivadas em GNOVA e sistema de sacos. (C) Peso de broto recente (Médio±SE). (D) Peso de raízes frescas (Médio±SE). (E) Comprimento do disparo (Mean±SE). F) Comprimento da raiz (Média±SE). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Dinâmica temporal da umidade relativa e temperatura medida dentro da GNOVA (roxa) e da câmara de crescimento (laranja). Os dados eram registrados em intervalos de cinco minutos durante três dias. Dados dentro do GNOVA foram registrados com uma planta de milho de sete semanas. Áreas sombreadas em azul claro correspondem a períodos noturnos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Crescimento microbiano resultante do teste de esterilidade da GNOVA sem que as plantas não recebam irrigação (Controle) e com irrigação (Irrigado). (A) Amostras de cilindro de vidro acima do anel de algodão. (B) Amostras de cilindro de vidro abaixo do anel de algodão. (C) Placagem de diluição em série de placas únicas de amostras de solo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Comparação de características do GNOVA com outros gnotobióticos vegetais existentes (EcoFAB, caixas magenta, sacos, FlowPot, GnotoPot e EcoFAB 3.0). Os sistemas são comparados entre parâmetros-chave relevantes para o desenho experimental, como capacidade de altura da planta, capacidade de volume radicular e controle da irrigação. As informações foram compiladas a partir da literatura publicada e das descrições disponíveis dos sistemas; quando os dados não foram explicitamente reportados, estimativas são indicadas. † Melhor aproximação quando não especificada na literatura; ‡ O sistema não precisa ser desmontado ou movido para uma capela de fluxo laminar para realizar a tarefa; * Possível com modificações no sistema; Categorias de custo definidas como: baixo (< USD 30 por unidade), médio (USD 30-100 por unidade), alto (> USD 100 por unidade) Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Lista de materiais (BOM) e custos estimados para montagem e operação de uma única unidade GNOVA. Os materiais são categorizados como componentes reutilizáveis ou de uso único, com custo unitário correspondente, quantidades necessárias por sistema e custo total por sistema. Componentes reutilizáveis contribuem para o custo inicial de montagem, e materiais descartáveis representam o custo consumível por experimento. * calculado a partir de preços negociados em volume para tarifas econômicas; ** A quantidade necessária varia conforme o tempo do experimento, substrato do solo utilizado e objetivo de pesquisa. Vale a pena um experimento de quatro semanas com um cronograma semanal de irrigação usando a mistura de argila e areia; † Custo aproximado da quantidade de material necessário por sistema; ‡ Não inclui o preço da solução nutritiva nem do substrato do solo, pois isso varia conforme o objetivoexperimental. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Os valores p resultantes do teste t de duas amostras para crescimento do milho mediram variáveis cultivadas dentro do GNOVA e do sistema de sacos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O sistema gnotobiótico vegetal apresentado aqui, GNOVA, oferece uma ferramenta acessível e versátil para estudar as interações planta-microrganismo em culturas de cereais. Suas principais características incluem maior capacidade de crescimento e irrigação incorporada, estendendo o crescimento dos cereais além da fase de muda em condições estéreis. O desempenho desse sistema é comparável ao EcoFAB 3.0 e oferece um sistema gnomiótico alternativo vegetal acessível. O sistema é construído a partir de componentes comercialmente disponíveis, selecionados por custo, simplicidade e compatibilidade com autoclaves de porte médio, facilitando a adoção em laboratórios. Montagem e operação são simples e não exigem equipamentos especializados, reduzindo assim as barreiras para a implementação. O GNOVA pode ser adaptado para atender a diferentes objetivos de pesquisa devido à sua compatibilidade com uma ampla variedade de substratos do solo, protocolos de esterilização de sementes, inoculantes microbianos (livres de germes, SynCom ou comunidade natural) e diversas análises a jusante.

A contaminação mínima é essencial em experimentos gnotobióticos de plantas para garantir que os efeitos observados possam ser atribuídos a microrganismos de interesse e não a contaminantes. A operação simples da GNOVA reduz o risco de contaminação. A adesão rigorosa à técnica asséptica e as seguintes recomendações-chave garantirão a manutenção da esterilidade. Durante a montagem do experimento, recomendamos a desinfecção do exaustor de fluxo laminar entre inoculantes microbianos para minimizar a contaminação cruzada dos tratamentos. A ordem em que os tratamentos são aplicados também pode diminuir a contaminação cruzada. Aplicar tratamentos sem germes antes de qualquer tratamento com microbianos vivos é o ideal. Microbóbios estrangeiros também podem ser introduzidos por meio de sementes. Portanto, protocolos de esterilização superficial de sementes devem ser otimizados para cada espécie de planta ou fonte de semente, a fim de equilibrar esterilidade e^{germinação 26}. Protocolos de esterilização para cereais não modelo, como sorgo²⁴,^{cevada 29}, capim-switch e^{aveia 23} , podem ser facilmente implementados no GNOVA. Se a esterilização impactar negativamente a germinação, podem ser usadas sementes pré-germinadas. A irrigação representa uma fonte importante de contaminação em sistemas gnotobióticos. O ponto mais crítico durante esse processo é a fixação dos filtros nas linhas de irrigação. As extremidades dos tubos das linhas de irrigação e filtros devem permanecer estéreis durante esse processo. A esterilização por chama requer destreza e pode ser trabalhosa, especialmente em grandes experimentos (n >50). Portanto, o método alternativo à base de água sanitária é recomendado para grandes experimentos ou quando a esterilização por chama não é prática. Também é recomendado manter filtros estéreis adicionais e ter água sanitária ou etanol disponível durante a irrigação, em caso de contaminação durante o manuseio dos materiais do sistema. Além disso, recomenda-se fortemente a inclusão de unidades de controle de contaminação (ou seja, sem planta, sem tratamento de microrganismos e irrigação receptora) para monitorar a esterilidade e identificar contaminantes.

Para superar o risco de contaminação por irrigação, os primeiros sistemas gnotobióticos das plantas estavam totalmente fechados e careciam de capacidade de irrigação, o que limitava a duração dos experimentos. O milho foi cultivado gnotobóticamente em^{sacos 19, 30}, tubos de vidro e^{placas de Petri 15} entre duas e quatro semanas. Para repor água e nutrientes durante o crescimento das plantas, sistemas alternativos como EcoFAB²³, FlowPot e^{GnotoPot 21} permitiram irrigação por desmontagem parcial dentro de exaustores laminares. Isso limitava seu tamanho e compatibilidade com plantas maiores. Como as linhas de irrigação são facilmente acessíveis fora do GNOVA, não é necessário desmontar e o sistema não está restrito aos tamanhos das capas de fluxo laminar. Isso não só permite um suprimento contínuo de nutrientes e água, como também aumenta o espaço disponível para crescer. A redução do espaço dos brotos pode diminuir a capacidade fotossintética e contribuir para a^{atrofiação 24}, e a restrição de volume radicular pode levar à ligação radicular e reduzir a absorção de água e^{nutrientes 31}. A combinação de espaço de crescimento reduzido e falta de irrigação no sistema de sacos pode explicar a diminuição da biomassa e a falta de progressão fenológica do milho e do trigo em comparação com o sistema GNOVA. Esse novo sistema permitiu o crescimento gnobibótico do milho por uma duração comparável à do sorgo no EcoFAB 3.0²⁴. Além disso, ela supera o crescimento gnotobiótico do trigo por quatro semanas em um sistema hidropônico (20) em um sistema de solo mais representativo. Além das limitações físicas, sistemas gnotobióticos frequentemente dependem de fluxo de ar restrito para manter a esterilidade. O fluxo de ar limitado pode levar ao aumento da temperatura e umidade, além de taxas de troca gasosas mais baixas, o que pode impactar a fisiologia da^{planta 32}. O crescimento melhorado foi relatado em sistemas com fluxo de ar aprimorado, como caixas magenta equipadas com filtros^{HEPA 33}, que operam de forma semelhante ao filtro DW4 usado no GNOVA. Da mesma forma, o EcoFAB 3.0 apresentou aumento de temperatura e umidade relativa, mas ainda era considerado uma plataforma robusta para o crescimento gnotobiótico do^{sorgo 24}. Isso sugere que, embora persistam restrições físicas e ambientais nos sistemas gnotobióticos, os avanços no design de sistemas apresentados aqui ainda proporcionam condições aprimoradas que apoiam de forma mais eficaz o crescimento gnotobiótico dos cereais.

A facilidade de modificação é outra característica fundamental do GNOVA. A modularidade de seu design permite que os usuários façam alterações em partes individuais para melhor atender às suas necessidades de pesquisa e orçamento. Esse sistema é compatível com qualquer substrato de solo, incluindo solos naturais. Modificações no volume de montagem, concentração de solução nutritiva e volume e frequência de irrigação devem ser baseadas nas propriedades físico-químicas do solo, pois influenciam diretamente a disponibilidade e distribuição de nutrientes e^{água 34}. A seca pode ser induzida monitorando o peso de todo o sistema GNOVA e determinando gravimetricamente o teor de água do solo³⁵. Os exsudatos radiculares podem ser coletados de forma destrutiva incubando plantas colhidas em água^{ultrapura 36} ou por meio da lavagem do sistema para obter lichates não estéreis³⁷. Se forem necessários exsudatos estéreis, o potenciômetro e a base de suporte impressa em 3D da GNOVA podem ser modificados para incorporar um recurso embutido de coleta de exsudatos semelhante ao do design do EcoFAB 3.0²⁴. Cientistas interessados em entender os efeitos^{prioritários 38} na montagem de comunidades microbianas podem instalar linhas de irrigação adicionais ao redor do vaso. Isso permite aplicações subsequentes de inoculantes microbianos, mantendo a esterilidade da linha principal de irrigação. As condições ambientais poderiam ser monitoradas instalando sensores de temperatura e umidade relativa sem fio desinfetados dentro do GNOVA. Alternativamente, substituir o cilindro de vidro por uma câmara de policarbonato e perfurar os portos de amostragem²⁴ permitiria medir o ambiente e amostrar gases. Isso poderia permitir a quantificação de gases e compostos voláteis, como CO₂,_O2 e etileno, com potencial para influenciar o desempenho da^{planta 33}. O fluxo de ar para o sistema também pode ser aumentado removendo o anel de algodão no cilindro de vidro. No entanto, qualquer uma dessas modificações pode aumentar o risco de contaminação e ainda não foi validada ou otimizada dentro do GNOVA.

Apesar das vantagens e versatilidade do GNOVA, algumas limitações devem ser consideradas. Deve-se notar que esse sistema é mais adequado para uso em câmaras de crescimento controlado, pois condições descontroladas na estufa ou no campo podem impactar seu desempenho. Embora o trigo tenha conseguido crescer no sistema por 17 semanas, sinais de estresse foram observados por volta das 12 semanas de crescimento. Portanto, o trigo não deve ser cultivado além de 12 semanas. Além disso, a manutenção da esterilidade só foi confirmada por meio de quatro eventos semanais de irrigação ao longo de um período de crescimento de quatro semanas; Experimentos mais longos acarretam um risco aumentado de contaminação. Embora a GNOVA tenha aumentado a capacidade de volume radicular, a restrição radicular ainda é possível, e uma avaliação temporal da morfologia radicular pode ajudar a determinar durações ideais de crescimento que minimizem a ligação radicular. Além disso, algumas modificações no sistema, como a substituição do cilindro de vidro por um cilindro de policarbonato, podem aumentar o custo de instalação para mais de 100 USD por unidade. Atualmente, o GNOVA permite apenas amostragem destrutiva de endpoints, o que aumenta os requisitos de trabalho de obra e replicação para estudos temporais de dinâmica microbiana, padrões de exudação ou monitoramento de esterilidade. Por fim, manter a esterilidade durante a instalação, irrigação e colheita é demorado, e até mesmo sistemas simplificados como o GNOVA exigem esforço dedicado, o que aumenta os custos operacionais totais. Coletivamente, essas limitações devem ser consideradas ao adotar esse sistema. Além disso, as restrições ambientais causadas pelo crescimento gnotobiótico precisam ser consideradas ao planejar experimentos e interpretar resultados, pois podem influenciar a fisiologia vegetal e, consequentemente, seu microbioma associado.

O GNOVA oferece uma plataforma gnotobiótica versátil compatível com culturas de cereais. O sistema permite a recuperação de sistemas radiculares quase intactos adequados para ferramentas de análise de arquitetura radicular como RhizoVision explorer³⁹ e ARIA⁴⁰, permitindo a caracterização da morfologia radicular em resposta a diversos inoculantes microbianos e condições ambientais. Quando combinada com análises SynComs e multi-ômicas, a GNOVA facilita a identificação de ligações mecanicistas entre efetores microbianos e respostas das plantas. SynComs maiores (>100 membros) combinados com análise metagenômica ^41,42,43 podem ser usados para examinar padrões de coocorrência e identificar microrganismos de relevância ecológica sob diferentes^{condições 5,44}. Em contraste, SynComs menores (<50 linhas) em combinação com metatranscriptômicos^45,46, metaproteômicos 19,47,48 e metabolômicos 49,50,51 permitem caracterização detalhada da resposta funcional tanto em plantas quanto em microrganismos ⁴⁴. Juntas, essas capacidades posicionam o GNOVA como uma ferramenta valiosa para a identificação de características microbianas chave que podem acelerar o desenvolvimento de novos bioinoculantes que aumentem a sustentabilidade dos sistemas agrícolas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Powerconnect cordless drill & Kit de 100 peças	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" e 1/8" brocas necessárias.
Fita de vinil, amarela, 1" de largura x 36 jardas	3M	471	Material consumível
Elásticos Sterling tamanho #32  (2 elásticos por sistema)	Amazon	B001I1QO00	Material consumível.
Semente de trigo			Cultivar usado neste experimento: Catawba
Isolamento de tubo de fibra de vidro, 3 " de largura x 1/2 " de espessura  (2 círculos pré-cortados por sistema)	Lowe's	28930	Cortar em 2 círculos de 7/8 " (7,3 cm) de diâmetro. Material consumível. Para produção de alto rendimento de círculos, desenrrole o isolamento de tubo e use a borda aberta do pote para cortar o círculo colocando o pote em cima do isolamento de tubo e aplicando pressão e torção.
Mídia de filtro DW4, pré-cortada para 15" x 75 jardas  (1 círculo cortado por sistema)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Cortar em círculos de 6,3 " (16,02 cm) de diâmetro. CBC tem outros tamanhos pré-cortados ou rolos padrão que podem ser comprados em vez disso, se desejado.  Material consumível. Corte um modelo do círculo em papelão e use-o para desenhar círculos por toda a área da mídia DW4 e corte com tesouras.
Tubulação de silicone, Versilon SPX-50 alta resistência, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" espessura da parede	Saint-Gobain	ABX00007	Cortado em duas peças longas (16" // 40,64 cm) e três peças curtas (2,5" // 6,35 cm)
Hipoclorito de sódio 5% de cloro disponível em solução aquosa	VWR	JT9416-1	Dilua para 2% v/v e use para o protocolo de esterilização de milho
Meio Murashige & Skoog, elementos micro e macro. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Dilua para 0,5x de força
Etanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Dilua para 95% v/v
Seringa 3 mL, trava luer não estéril  (2 por sistema)	Fisher scientific	14-817-117	Descarte o êmbolo e mantenha apenas o barril, encha com lã de vidro e tampe com papel alumínio.
Bicos de vidro, 250 mL	VWR	470191-150	Cinco são necessários para esterilização de sementes de trigo
Semente de milho			Genótipo usado neste experimento: Mexico 21–22 B73XMo17
Bandeja de alumínio para assar 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Certifique-se de que se encaixa nas dimensões da sua capela de fluxo
Cloreto de sódio	Fisher scientific	BP358-1	Prepare uma solução de 0,145 M.
Base impressa em 3D, filamento de ácido polilático (PLA) usado (1 por sistema)	Protolabs	NA	A impressão e os arquivos editáveis podem ser encontrados nos materiais suplementares. Arquivos disponíveis em Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. NÃO AUTOCLAVE se PLA foi usado como filamento para produzir a base. PLA derrete acima de 150 °C e pode ser deformado acima de 60 °C. Recomenda-se que a integridade da base 3D impressa em PLA seja testada se for usada em temperaturas acima de 40 °C. Para materiais de maior resistência ao calor, como PETG (polietileno tereftalato glicol) ou PC (policarbonato), podem ser usados; isso aumentará o custo da peça e ainda pode não ser autoclavável. A impressão 3D das protótipos da base foi realizada em uma impressora pessoal com volumes de construção de 256 × 256 × 256 mm (comprimento × largura × altura). Para eficiência em velocidade e custo, recomendamos a impressão em massa em provedores locais de serviços de impressão 3D comerciais.
Conexão macho luer para mangueira roscada 1/8 " ID, polipropileno livre de derivados animais  (2 por sistema)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Referido como encaixe 1 no protocolo
Conexão macho slip luer para mangueira roscada 1/8 " ID, polipropileno livre de derivados animais  (1 por sistema)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Referido como encaixe 2 no protocolo
Grampos de mangueira de engrenagem de minhoca de aço inoxidável 201, 1 1/2" -3 1/2" diâmetro de aperto (1 por sistema)	Grainger	5CZF2	Referido como grampos de mangueira no protocolo
Gabinete de fluxo laminar Airstream Gen 3 com interruptor simples, dimensões 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Referido como capela de fluxo laminar no protocolo. Qualquer capela de fluxo laminar com dimensões semelhantes funciona. Modificações podem ser necessárias em capelas de fluxo laminar menores.
Areia de brincar, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Referido como areia no protocolo
Arame tecido de aço inoxidável 304, 120 malha (1 por sistema)	Amazon	B09KRS5F7T	Referido como malha de arame de aço inoxidável no artigo. Corte em círculos de 4,7" (11,9 cm) de diâmetro. Para alta produção de círculos ou produção de círculos, corte um modelo do círculo em papelão e use-o para desenhar círculos em toda a área de malha tecida da malha tecida e corte com tesouras.
Argila (Montmorilonita), OIL-DRI Sorbente Solto, 50 lb de peso, não perfumado	Grainger	44Z111	Referido no protocolo como argila. Material consumível.
Tubo de vela de furacão transparente sem fundo 4" OD x 30" de comprimento (1 por sistema)	WCG International	HST0430	Referido no protocolo como cilindro de vidro
Tampa de plástico transparente, 3" (7,6 cm) diâmetro