Combinando injeções de colagenase com sobrecarga mecânica induzida pelo exercício: um modelo de camundongo simulando sobrecarga lesão por estresse e osteoartrite no joelho

Resumo

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo murino de osteoartrite no joelho induzida por sobrecarga de estresse, combinando injeções intraarticulares de colagenase com sobreesforço induzido pelo exercício, fornecendo uma plataforma minimamente invasiva para investigar a patogênese degenerativa.

Resumo

A osteoartrite do joelho (KOA) é uma doença degenerativa multifatorial das articulações, impulsionada pela complexa interação da degradação biológica dos tecidos e da sobrecarga mecânica sustentada. modelos cirúrgicos convencionais em animais frequentemente induzem destruição pós-traumática das articulações de gatilho, o que não replica com precisão a patogênese gradual e cumulativa da KOA degenerativa humana. Para preencher essa lacuna translacional, o presente estudo estabelece um modelo de camundongos novo e reproduzível que simula KOA induzida por sobrecarga e estresse, ao sinergizar a degradação leve da cartilagem enzimática com a carga mecânica sustentada. Especificamente, injeções intraarticulares padronizadas de colagenose tipo II foram combinadas com esforço mecânico excessivo diário por meio de um aparelho de fadiga do tipo rotador estritamente calibrado ao longo de um período de quatro semanas. A eficácia dessa intervenção de dois fatores foi validada por meio de análises comportamentais, histológicas e moleculares abrangentes. A análise automatizada da marcha revelou déficits locomotores severos no grupo combinado. Esses foram caracterizados por reduções significativas no comprimento da passada, largura da passada e área máxima da postura das patas. Avaliações histomorfológicas usando coloração verde safranina O-fast confirmaram esses déficits funcionais, mostrando danos estruturais progressivos na cartilagem, defeitos superficiais e escores significativamente elevados da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) que refletem fielmente as características patológicas dos KOA humanos em estágio inicial a médio. Além disso, avaliações imunohistoquímicas demonstraram marcada regulação para cima do canal mecanossensível Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) e redução concomitante na proteína matriz crucial Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) nos condrócitos articulares. Ao integrar instabilidade articular localizada com estresse mecânico controlado, essa estratégia minimamente invasiva evita o trauma agudo associado aos modelos cirúrgicos. Esse protocolo estabelece uma plataforma experimental clinicamente relevante para acompanhar mecanismos moleculares dinâmicos, avaliar fenótipos de dor crônica e testar intervenções terapêuticas de longo prazo para osteoartrite em estágio inicial.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma condição degenerativa multifatorial caracterizada por dor, inchaço, rigidez e função comprometida, decorrentes de fatores como obesidade, esforço mecânico e^{trauma 1}. A osteoartrite no joelho (KOA) é altamente prevalente e cada vez mais comum com o envelhecimento, porém os ensaios clínicos costumam ser limitados em escopo devido à diversidade de manifestações clínicas. Portanto, o desenvolvimento de tratamentos eficazes exige modelos animais^{adequados 2}. Dada a heterogeneidade intrínseca da OA, não existe um modelo universalmente aceito de "padrão-ouro", exigindo que os pesquisadores identifiquem modelos específicos que estejam alinhados com sua investigação científica.

Atualmente, a KOA é caracterizada na medicina moderna como uma condição que envolve a interação de fatores mecânicos e biológicos na cartilagem articular e no tecido pericondral. A consequência dessa interação intrincada é principalmente a deterioração progressiva da cartilagem articular e de sua matriz^{circundante 3}. O estresse mecânico atua como um sinal crucial de transdução que governa vários processos fisiológicos e patológicos nas células e tecidos^{articulares 4}. Manter a cartilagem articular em um estado saudável exigia carga mecânica adequada dentro da faixa fisiológica. Por outro lado, sobrecarga excessiva frequentemente resulta na degeneração da cartilagem e no subsequente aparecimento do KOA⁵. Modelos espontâneos são prejudicados por investimentos significativos de tempo e^{economia 6}, enquanto modelos induzidos cirurgicamente utilizam uma abordagem destrutiva que representa principalmente KOA em estágio intermediário a avançado, desviando-se da progressão degenerativa^{natural 7,8}. Por outro lado, modelos induzidos quimicamente têm como alvo a matriz de colágeno, mas não capturam as mudanças abrangentes da OA degenerativa humana quando usados sem estresse^{mecânico 9}. Combinar degradação enzimática com sobreesforço mecânico resolve essas lacunas ao recapitular de forma mais fiel a patogênese gradual da lesão por estresse por sobrecarga. O objetivo deste estudo é estabelecer e validar um novo modelo de camundongo de KOA combinando injeções intraarticulares de colagênase tipo II com sobreesforço usando um aparelho de fadiga da roda rotativa.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Os experimentos foram realizados sob uma licença de projeto (NO.: PZSHUTCM201016022) concedida pelo Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai, em conformidade com o Comitê de Atualização do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa (EUA).

1. Protocolo de Produção de Modelos Animais

1. Distribuir aleatoriamente 32 camundongos C57BL/6 de 10 semanas em quatro grupos: controle, colagênase, exercício excessivo e colagênase + exercício excessivo.
   1. Aclimate todos os camundongos por uma semana sob condições padrão de alimentação e alojamento antes de iniciar os procedimentos de modelagem.
2. Induza os modelos animais ao longo de um período de 4 semanas, de acordo com os grupos experimentais designados.
   1. Administrar colagenase tipo II por injeção intraarticular nos camundongos do grupo colagenase.
   2. Submeta os camundongos do grupo de exercícios intensos a treinamento usando um aparelho de roda giratória.
   3. Aplique tanto a injeção intraarticular de colagênase quanto o exercício com roda giratória nos camundongos do grupo colagênese + exercício excessivo.
   4. Mantenha a mesma frequência e duração de treino em todos os grupos de exercícios relevantes.

2. Protocolo de Injeção Intra-Articular de Colagenase Tipo II

1. Anestesia
   1. Induza anestesia usando isoflurano administrado por uma máquina calibrada de anestesia gasosa. Realize indução rápida em concentração de 2%–3% de isoflurano.
   2. Mantenha a anestesia entre 1,5% e 2% de isoflurano. Garanta o funcionamento adequado do sistema de limpeza de anestésicos para evitar exposição ocupacional.
   3. Monitore continuamente a frequência respiratória e os reflexos do camundongo durante todo o procedimento.
2. Preparação da Pele
   1. Aplique creme depilante na área ao redor da articulação do joelho esquerdo. Remova completamente os pelos usando um raspador.
   2. Limpe bem a pele exposta. Mantenha condições assépticas durante todo o preparo.
3. Preparação da Colanase Tipo II
   1. Equilibre o pó de colagênase tipo II à temperatura ambiente por 30 minutos em um armário de biossegurança estéril. Use soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS, pH 7,2–7,4) como solvente e tampão exclusivo para o processo de dissolução.
   2. Pese com precisão a massa necessária de pó de colagenase usando uma balança analítica. Adicione lentamente o PBS estéril ao pó para alcançar uma concentração final de trabalho de 0,04 U/μL.
   3. Misture a solução suavemente, pipetando a mistura para cima e para baixo até que fique clara e livre de partículas visíveis. Evite vórtices violentos durante essa etapa para evitar a perda da atividade enzimática.
   4. Centrifuge a solução preparada de 0,04 U/μL a 1.000 rpm por 5 minutos a 4 °C. Isso remove micropartículas não dissolvidas e previne o bloqueio da agulha durante a injeção subsequente.
   5. Aspire o sobrenadante em tubos estéreis e armazene-os em um banho de gelo a 4 °C para uso imediato. Prepare a solução de forma revigorante para cada sessão para garantir a máxima atividade enzimática.
4. Injeção Intra-Articular
   1. Segure a pele dorsal do camundongo usando o polegar e o indicador da mão não dominante. Fixe ambos os membros inferiores com o anelar e o mindinho para estender as articulações do joelho naturalmente e expor totalmente a área da injeção.
   2. Segure uma microseringa de 10 μL equipada com uma agulha de 30 G. Insira a agulha paralela à superfície da pele na camada superficial da pele por aproximadamente 0,2 cm no ponto de entrada.
   3. Ajuste a direção da agulha lentamente para uma orientação perpendicular em relação à pele quando a resistência do tecido diminuir.
   4. Continue avançando a agulha por aproximadamente 0,3–0,5 cm até que uma perda de resistência indique entrada na cavidade da articulação. Retire o êmbolo da seringa lentamente para confirmar a ausência de refluxo sanguíneo.
   5. Injete 5 μL da solução de colagênase tipo II (concentração: 0,04 U/μL) na cavidade articular a velocidade^{constante 10}.
   6. Mantenha a posição da agulha imediatamente após a injeção. Pressione suavemente a pele ao redor do local da injeção por 10–15 segundos.
   7. Retire a agulha devagar. Pressione levemente o ponto de entrada com uma gaze estéril por 30 segundos para evitar vazamento do medicamento.
   8. Coloque o rato em uma gaiola doméstica quente e seca. Deixe o animal se recuperar naturalmente da anestesia, o que normalmente leva de 5 a 10 minutos.
   9. Retome as condições padrão de alojamento e alimentação após o camundongo se recuperar totalmente.
   10. Realize essas injeções intraarticulares duas vezes por semana, com intervalos de 3 a 4 dias entre as injeções, exclusivamente durante o período de modelagem de 4 semanas (após a aclimatação inicial de 1 semana).
   11. Descarte todos os objetos cortantes imediatamente em recipientes aprovados para riscos biológicos.
       NOTA: Garanta que pessoal treinado realize todas as injeções para minimizar lesões nas articulações e a variabilidade experimental.

3. Protocolo de Superesforço Induzido por Roda Giratória

1. Preparação de Aparelhos e Verificação de Segurança
   1. Ajuste a velocidade do aparelho de fadiga do tipo rotador para 12 rpm (equivalente a aproximadamente 0,063 m/s) e a duração para 2 horas por sessão.
   2. Ligue o módulo de estimulação elétrica. Confirme que a saída de corrente está dentro da faixa segura pré-definida de 0,1–0,3 mA. Não aumente a intensidade da corrente manualmente.
      ATENÇÃO: Use o módulo de estimulação elétrica estritamente para guiar os ratos de volta à roda, não como um estímulo punitivo. Verifique a fiação do aparelho em busca de danos e garanta um bom contato com os eletrodos antes de operar para evitar curtos-circuitos e lesões por choque elétrico.
2. Treinamento de Aclimatação
   1. Certifique-se de que as câmaras giratórias das rodas do aparelho de fadiga estejam limpas, secas e livres de detritos. Desative os eletrodos de estimulação elétrica na entrada da roda para eliminar qualquer estresse potencial relacionado à estimulação.
   2. Manuseie cada camundongo com cuidado pela base da cauda ou retire-o usando tecido mole e estéril. Coloque os camundongos individualmente na região central da superfície de roda giratória.
   3. Posicione o rato em uma postura natural quadrúpede em pé sobre a superfície horizontal da corrida. Oriente o corpo paralelo ao eixo central de rotação da roda, com as patas dianteiras para frente e as traseiras um pouco para trás.
   4. Use uma barreira macia temporária e não restritiva para evitar que o mouse entre na zona estreita do eletrodo durante os primeiros 2 minutos. Remova a barreira após esse período para permitir que o camundongo explore livremente toda a câmara.
   5. Deixe os camundongos no aparelho fixo por 10 minutos por dia nos primeiros 3 dias. Não inicie a rotação da roda nem inicie nenhuma estimulação elétrica durante esse período.
   6. Monitore o rato em busca de sinais de estresse severo, como congelamento persistente ou encaramento excessivo. Reposicione o mouse suavemente na área central da roda se ele apresentar comportamento anormal para restaurar uma postura natural.
   7. Ligue o volante a uma velocidade de 5 rpm por um período de 30 minutos no quarto dia. Esse passo acostuma os camundongos ao ritmo de movimento do aparelho sem o uso de sinais elétricos.
   8. Guie os mouses manualmente de volta ao centro da roda se eles caírem ou pararem durante a fase de adaptação rítmica. Garanta que a estimulação elétrica permaneça desativada durante todo o período de aclimatação de 4 dias.
      ATENÇÃO: Evite usar estimulação elétrica durante a fase de aclimatação para evitar respostas de estresse induzidas pelo medo e garantir a conformidade com o treinamento futuro.
3. Execução Formal do Exercício
   1. Realize o treinamento formal em horário fixo todos os dias (por exemplo, 9:00–11:00). Use luvas isolantes para colocar os camundongos no aparelho de fadiga do tipo rotador.
   2. Feche a porta do aparelho. Inicie os parâmetros pré-definidos de 12 rpm (~0,063 m/s) para uma duração máxima de 2 horas por sessão (Veja a Figura 1).
      ATENÇÃO: Monitore os camundongos continuamente durante o treinamento. Pause o treinamento por 5 minutos se um camundongo cair continuamente (mais de 3 vezes em 1 minuto) para evitar exaustão severa e lesões causadas pelo estresse.
4. Determinação e Estimulação do Ponto Final de Fadiga
   1. Monitore os camundongos continuamente para avaliar seu estado de fadiga. Encerre a sessão de treinamento mais cedo, sem forçar a duração completa de 2 horas, se o camundongo atender a pelo menos dois dos quatro critérios específicos de fadiga para evitar excesso de estresse.
   2. Defina Critério 1 como a incapacidade de permanecer na roda de roda por mais de 5 segundos antes de cair. Defina o Critério 2 como um aumento significativo da frequência de queda de 3 ou mais vezes em um período de 1 minuto.
   3. Defina o Critério 3 como a ausência de intenção voluntária de retornar à roda, onde o rato permanece imóvel ou se move apenas brevemente apesar da estimulação elétrica.
   4. Defina o Critério 4 como a apresentação de posturas locomotoras anormais. Procure sinais óbvios, como membros arrastando ou um andar cambaleante.
   5. Permita que o aparelho acione automaticamente uma estimulação elétrica leve quando um rato cair na entrada do spinner. Certifique-se de que a estimulação elétrica pare imediatamente assim que o mouse retornar à^{roda 11}.
      ATENÇÃO: Encerre o treinamento imediatamente se o camundongo apresentar condições anormais como convulsões ou dispneia. Retire o rato do aparelho e ofereça tratamento sintomático, se necessário.
5. Processamento pós-treinamento e frequência
   1. Desligue a energia do aparelho após o fim do treinamento. Use luvas isolantes para remover os camundongos e devolva-os às gaiolas de casa.
   2. Forneça água potável adequada para os camundongos. Observe os animais para qualquer atividade anormal, estado mental ou problemas nos membros (por exemplo, claudicação ou tremores musculares).
   3. Registre quaisquer anomalias e ofereça tratamento em tempo hábil.
   4. Mantenha essa frequência de treinamento de uma vez ao dia, 2 horas por sessão, por 4 semanas consecutivas. Mantenha os parâmetros de treinamento e o monitoramento de segurança consistentes durante todo o período.
      NOTA: Verifique se o aparelho de fadiga e o módulo de estimulação elétrica estão funcionando corretamente antes de cada sessão diária de treinamento para garantir uma intensidade consistente da estimulação.

4. Análise da Marcha

1. Visão Geral do Sistema
   1. Realize a aquisição e análise da marcha usando um sistema automatizado de imagem da marcha.
   2. Realize todos os procedimentos de marcha em 32 camundongos C57BL/6 de 10 semanas após o período de modelagem de 4 semanas.
   3. Posicione a câmera de alta velocidade sob a esteira transparente para capturar imagens ventrais durante a locomoção.
2. Aclimatação e Configuração
   1. Aclimate todos os camundongos ao aparelho da esteira antes da coleta formal de dados para minimizar o estresse.
   2. Ajuste a velocidade da esteira para 20 cm/s para acompanhar o ritmo fisiológico dos ratos.
   3. Registre três ensaios válidos independentes por camundongo, com intervalo de descanso de 2 minutos entre os ensaios.
3. Gravação do Julgamento e Seleção de Passadas
   1. Permita que o mouse caminhe continuamente por um período de aquisição de 60 segundos durante cada teste.
   2. Realize um teste de substituição se uma gravação for inválida devido a "travamento", pulo ou giro.
   3. Inicie a coleta de dados somente após o mouse alcançar uma locomoção estável e consistente por pelo menos 10 segundos.
   4. Selecione no mínimo 4 passos completos consecutivos de cada ensaio de 60 segundos para análise.
   5. Garantir que dois observadores independentes e cegos realizem a seleção de passos para eliminar o viés subjetivo.
   6. Confirme que o mouse mantém uma postura quadrúpede natural sem pular ou flutuar bruscamente a velocidade.
   7. Verifique se a passada inclui tanto uma fase de apoio de peso quanto uma fase de balanço de propulsão para frente.
   8. Verifique imagens claras de contato com cintos de patas sem perda de rastreamento, borrão ou contaminação.
4. Processamento de Imagem e Extração de Parâmetros
   1. Use os algoritmos integrados ao software do sistema para digitalizar imagens capturadas e detectar pontos de contato com cintos de patas.
   2. Calcule a razão Swing/stance como a razão entre a duração da fase do swing e a duração da fase da postura.
   3. Meça o comprimento da passada (cm) como a distância linear percorrida durante uma única passada completa.
   4. Meça a largura da passada (cm) como a distância horizontal entre as bordas mediais das patas traseiras contralaterais na posição máxima.
   5. Determine a área da pata na postura máxima (cm²), representando a área total de contato no máximo de suporte.
   6. Calcule a variabilidade da área da pata (cm²) como o coeficiente de variação da área de contato ao longo de passadas consecutivas.
   7. Calcule o valor médio dos 3 testes válidos para cada mouse individual e exporte os conjuntos de dados finais.
      NOTA: Exclua os ensaios com comportamentos irregulares de paradas, pulos ou viradas da análise.

5. Histologia

1. Coleta e Fixação de Tecidos
   1. Eutanasie todos os camundongos humanamente por luxação cervical após o período de indução de 4 semanas. Dissece cuidadosamente a articulação do joelho esquerdo e remova o excesso de tecido mole ao redor.
   2. Imerga imediatamente a amostra em fixador pré-resfriado de paraformaldeído (PFA) (w/v). Certifique-se de que o volume do fixador seja de 10 a 15 vezes o volume da amostra para submergir completamente o tecido.
   3. Fixe o tecido em temperatura ambiente por 48 horas. Agite o recipiente de fixação suavemente a cada 8 horas para garantir uma penetração adequada do fixador.
2. Descalcificação de tecidos
   1. Enxágue a amostra fixa com água corrente devagar por 10 minutos. Repita esse processo de enxágue três vezes para remover o PFA residual.
   2. Transfira a amostra para uma solução de descalcificação de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) de 0,5 mol/L (pH 7,2–7,4). Mantenha o volume da solução de descalcificação em 20 vezes o volume da amostra e armazene-a a 4 °C.
   3. Descalcifique o tecido por 14 a 21 dias. Substitua o fluido antigo por uma solução nova de descalcificação com EDTA a cada 3 dias.
   4. Teste o ponto final da descalcificação perfurando suavemente o osso subcondral com uma agulha estéril. Conclua o processo de descalcificação quando a agulha penetrar suavemente, sem resistência.
   5. Lave a amostra completamente descalcificada em água corrente por 2 horas para remover o EDTA residual. Lave a amostra posteriormente com soro salino tamponado com fosfato (PBS) três vezes por 5 minutos cada.
3. Embedding e Seccionamento
   1. Desidrate a amostra descalcificada sequencialmente usando uma série graduada de etanol (70%, 80% e 90% por 2 horas cada; 95% por 1 hora; etanol absoluto duas vezes por 1 hora cada).
   2. Limpe o tecido desidratado em xileno duas vezes por 10 minutos cada. Imerga o tecido limpo na parafina.
   3. Corte o tecido embutido na parafina em seções sagitais contínuas de 5 μm de espessura usando um micrótomo. Monte as seções sobre lâminas de vidro revestidas a poli-L-lisina e asse-as em uma chapa elétrica de secagem a 60 °C por 2 horas.
4. Avaliação histomorfológica
   1. Tinga as seções com safranina O-fast verde para avaliar a histomorfologia da cartilagem articular.
   2. Avalie a degeneração da cartilagem usando o sistema de pontuação da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) em condições dupla-cegas¹².
5. Fluxo de Trabalho Central de Imunohistoquímica (IHC)
   1. Deparafinize as seções em xileno duas vezes por 10 minutos cada. Reidrate as seções sequencialmente através de uma série de etanol graduada até água deionizada.
   2. Imerga as seções em um tampão de citrato de 0,01 mol/L (pH 6,0) para recuperação de epítopos de calor induzida por micro-ondas. Aqueça o buffer até ferver em alta potência, depois mantenha um fogo brando suave em potência média por 15 minutos.
   3. Resfrie as seções naturalmente até a temperatura ambiente. Lave os slides com PBS três vezes por 5 minutos cada
   4. Incube as seções em uma solução de metanol de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 3% por 20 minutos em temperatura ambiente para bloquear a atividade endógena da peroxidase. Lave os slides com PBS três vezes por 5 minutos cada.
   5. Aplique uma solução bloqueadora de soro de cabra a 5% nas seções. Incube por 60 minutos em temperatura ambiente para bloquear os locais de ligação inespecíficos.
   6. Descarte a solução de bloqueio sem lavar. Aplique a solução primária específica de trabalho de anticorpos (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) em 1:100, Caspase-3 em 1:200, ou Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) em diluição 1:150).
   7. Incube as seções com o anticorpo primário em uma câmara umidificada a 4 °C durante a noite por 12–16 horas.
   8. Equilibre as seções à temperatura ambiente por 30 minutos no dia seguinte, depois lave com PBS três vezes por 5 minutos cada. Aplique um anticorpo secundário IgG anti-coelho ou anti-camundongo conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (diluição 1:500).
   9. Incube as seções com o anticorpo secundário por 60 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides com PBS três vezes por 5 minutos cada.
   10. Aplique uma solução de cromógeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e incube no escuro por 3–5 minutos em temperatura ambiente. Pare a reação imediatamente com água desionizada quando um sinal marrom claro aparecer sob observação microscópica.
   11. Contra-tinga as seções com uma solução de hematoxilina por 5 minutos. Enxágue sob água corrente por 10 minutos para deixar a mancha ficar azul.
   12. Diferencie as seções usando uma solução ácida ácida a 1% por 30 segundos. Enxágue os slides sob água corrente por 5 minutos.
   13. Desidrate rapidamente as seções através de uma série graduada de etanol e limpe o tecido em xileno duas vezes por 10 minutos cada.
   14. Monte os slides usando bálsamo neutro e cubra-os com lâminas de resina óptica. Deixe os slides montados secarem em temperatura ambiente.
6. Controles IHC e Análise de Imagem
   1. Estabeleça um controle negativo substituindo o anticorpo primário por PBS durante o procedimento de coloração. Inclua uma seção de tecido cartilaginoso conhecida como positivo como controle positivo para verificar a eficácia dos anticorpos.
   2. Adquira as imagens da seção manchada usando um scanner de lâminas inteira com ampliações de 40× e 100×.
      NOTA: Realize todas as avaliações histológicas de forma independente por pelo menos dois observadores cegos para reduzir o viés subjetivo.

6. Análise Estatística

1. Tratamento de Dados e Testes Gerais
   1. Realizar toda a coleta e análise de dados em condições cegas para minimizar o viés experimental.
   2. Analise as variáveis contínuas entre os quatro grupos experimentais usando uma análise unidirecional da variância (ANOVA) para testar as diferenças gerais.
   3. Aplique o teste H de Kruskal-Wallis a quaisquer variáveis que não atendam às suposições paramétricas necessárias.
2. Testes Post Hoc e Limiares de Significância
   1. Realize comparações post hoc por pares usando o teste de Tukey para identificar diferenças específicas de grupo se a ANOVA inicial indicar significância estatística.
   2. Confie apenas no teste de Tukey para controlar a taxa de erro por família. Não combine isso com métodos adicionais de correção por comparação múltipla.
   3. Defina significância estatística de forma uniforme como p < 0,05

Resultados

Análise da Marcha
Parâmetros do ciclo de marcha: A razão balanço/postura — definida como a razão entre a duração da fase de balanço sem apoio de peso e a fase de apoio de peso de uma única passada — foi avaliada para refletir o equilíbrio entre apoio de peso e propulsão. Comparados ao grupo controle (2,10 ± 0,06), camundongos que receberam injeção intraarticular de colagênase (1,45 ± 0,05) ou passaram por exercício excessivo (1,68 ± 0,05) apresentaram razões de oscila...

Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um modelo innovo de camundongo de KOA que imita os efeitos do estresse excessivo na articulação combinando injeção intra-articular de colagênase com treinos de exercícios indutores de fadiga baseados em rodas. Essas descobertas mais uma vez confirmam a noção de que a KOA surge da interação de fatores biológicos e mecânicos. Compreender e identificar esses fatores traz potencial para elaborar planos de tratamento individualizados e estratégias preventivas para ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fixador de paraformaldeído 4%	Beyotime	P0099
Ácido acético	Sinopharm	631-61-8
Sistema de imagem DigiGait para camundongos	Ciências da Vida RWD	MSI-DIG-MS
Solução EDTA	Procell	PB180320
Incorporação de fita cassete	Leica	IP C
Etanol	Sinopharm	64-17-5
Mancha verde rápida	Leyan	1085995
Creme depilador	Veet	G20161330
Hematoxilina	Adamas	61753A
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	Hermle	Z366K
Incubadora	TAITEC	M-210FN
Máquina de anestesia por inalação	Ranger	RZ-Viking
Isoflurano	Webio	W100
Microtome	Ted Pella	10180-220
Aparelho de fadiga do tipo rotador de camundongos	Tecnologia Biológica Zhishu Duobao de Pequim	YLS-10B
Bálsamo neutro	Sinopharm	96949-21-2
Mancha Safranin O	Bioss	S0062
Centro semiautomático de embedding de tecido	Thermo Fisher	HistoStar
Placa elétrica de secagem por deslizante	Ciências da Microscopia Eletrônica	XH-2002
Banho-maria de flutuação de tecidos	BIOBASE	BT-I
Colagénase tipo II	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Scanner de diapositivos inteiro	Leica	Aperio VERSA
Xylene	Sinopharm	1330-20-7