Artigo de método

Ensaio de Isolamento de Fibra Única para Avaliação do Comportamento da Miofibra Oxidativa

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DOI:

10.3791/70637

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31 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo descreve o isolamento de fibras musculares únicas intactas do sóleo oxidativo e o estabelecimento de culturas de mioblast altamente purificadas derivadas dessas fibras. O procedimento otimizado gera de forma confiável aproximadamente 300–500 miofibras intactas por camundongo, permitindo análises moleculares e celulares posteriores.

Resumo

O músculo esquelético é composto por miofibras multinucleadas cuja integridade e função são essenciais para o movimento e a saúde geral. Em distúrbios neuromusculares, os grupos musculares podem ser afetados de forma diferente entre os tipos e estágios da doença, tornando importante isolar fibras únicas viáveis de músculos representativos para estudos mecanicistas. O objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável para isolar um alto rendimento de miofibras simples intactas do músculo sóleo murino (SOL), que é difícil de dissociar devido ao comprimento e fragilidade das fibras. Ao otimizar a concentração de colagênese e o tempo de digestão, o protocolo minimiza a perda de fibras e preserva a viabilidade durante a dissociação. O fluxo de trabalho otimizado reduz significativamente a fixação residual do tecido em fibras isoladas, limitando assim a transferência de células não fibrosas e minimizando a contaminação entre células. Essa técnica é adequada para análises de fibra única, bem como para isolamento de células satélite e posterior expansão sob condições de contaminação mínima. Usando esse fluxo de trabalho otimizado, obtemos rotineiramente ~300–500 miofibras individuais integradas derivadas do SOL que podem ser imunomarcadas com alta eficiência e também geram uma população celular satélite de alta qualidade com contaminação mínima por fibroblastos. Utilizando análises comparativas com o músculo Extensor Digitorum Longus (EDL), destacamos o valor de uma abordagem personalizada e específica para cada músculo na avaliação de terapias em pesquisas em doenças neuromusculares, permitindo que intervenções farmacêuticas candidatas sejam testadas em pequenas janelas experimentais ajustáveis.

Introdução

O músculo esquelético é o tecido mais abundante do corpo humano, representando aproximadamente 40–50% da massa corporaltotal 1. O músculo esquelético serve como reservatório de energia na forma de glicogênio. Durante a exposição ao frio, ele fornece calor por termogênese e, o mais importante, proporciona locomoção. O músculo esquelético é composto por miofibras multinucleadas e pós-mitóticas. Para sustentar a maturação e reparação muscular, novos mionúcleos são gerados pela célula-tronco residente do nosso músculo esquelético, a célula satélite (SC). As células medulares são encontradas na periferia das fibras musculares esqueléticaspós-natais 2,3,4. As SCs são identificadas pelo fator de transcrição Pax7, que é expresso tanto em estados de repato quantoativado 3,5. Após lesão ou estimulação hipertrófica, os SCs ativam e regulam para cima a MioD, entram no programa miogênico, proliferam e, por fim, fundem-se com miofibras existentes ou recém-formadas para restaurar a função muscular 6,7,8. Os SCs são heterogêneos em sua capacidade de caule, origem embriológica (somitica vs não somitica), estágio do crescimento pós-natal (jovem vs velho) e composição muscular (fibras rápidas vs lentas)9,10,11.

Dependendo da região do corpo, o músculo esquelético é adaptado para atender às demandas energéticas e funcionais daquela região. Essa heterogeneidade nas fibras musculares é possível devido à sua contratilidade e capacidade oxidativa. De fato, as fibras musculares são compostas por fibras oxidativas de contração lenta (chamadas tipo I e IIa) e fibras glicolíticas de contração rápida (chamadas IIx, em roedores IIb)12,13. Esse belo e funcional mosaico de tipos de fibras nos permite nos mover livremente em nosso dia a dia. Por exemplo, músculos posturais como o sóleo (SOL) e a espinha espinhadora estão em um estado de ativação crônica e de baixo nível, conseguindo assim uma alta proporção de fibras musculares tipo I e tipo IIa oxidativas lentas. Em contraste, músculos curtos, porém de ação rápida, como o extensor dos dedos longos (EDL), são compostos principalmente por fibras glicolíticas tipo IIx e tipo IIb. A composição da fibra, no entanto, não é fixa; ao contrário, fibras musculares são estruturas dinâmicas capazes de mudar de rápidas para lentas e vice-versa, dependendo das necessidades funcionais impostas a elas. A diferença na contratilidade do tipo de fibra é possível devido ao conteúdo da proteína miosina. Esta é a principal proteína dentro do músculo esquelético, composta por isoformas de cadeias leves e pesadas demiosina 12,14.

Dentro de um sarcômero (a menor unidade funcional do músculo que gera força), as cabeças da miosina e a actina interagem para formar uma estrutura conhecida como ponte transversal. Por meio da hidrólise do ATP, a energia é liberada pelo ciclo das interações entre miosina eactina 15,16. A cadeia pesada de miosina (MyHC) é o marcador mais apropriado para identificação do tipo de fibra12,13. Dependendo da isoforma do MyHC expressa, a taxa de contratilidade muscular varia. Como mencionado, fibras tipo I são fibras oxidativas lentas, ao contrário das fibras tipo II. Os grupos musculares dominantes do tipo I contêm maior abundância de enzimas oxidativas, são mais ricos em mitocôndrias e possuem uma densa rede capilar para perfundir o músculo17,18 (pense em um corredor de maratona). Fibras do tipo I são codificadas pelo gene MYH7 13,19. Fibras tipo II são rápidas em fadiga, contêm alta proporção de enzimas glicolíticas e têm maior velocidade máxima de encurtamento, tornando-as ideais para rajadas curtas de potência ou movimento (pense em power lifter). Fibras tipo II para tipos IIa, IIx e IIb (em roedores) são codificadas pelos genes MYH2, MYH1 e MYH4, respectivamente20,21. Não surpreendentemente, qualquer ofensa fisiopatológica que afete a integridade muscular alterará a composição dos tipos de fibras e causará efeitos prejudiciais na função muscular, potencialmente reduzindo a qualidade de vida. Na verdade, muitas distrofias musculares começam tanto na célula satélite (opatias celulares satélite) quanto na fibra muscular (derivadas de neurônio motor ou tecido muscular), e podem causar uma mudança na composição dos tipos defibras 22,23,24,25. Por exemplo, lesão medular, estudos de repouso absoluto e voos espaciais (microgravidade) mostram que a inatividade prolongada pode desencadear músculos posturais para o fenótipo de fibra lenta pararápida 26,27,28,29,30. Por outro lado, na distrofia muscular de Duchenne, tanto em modelos humanos quanto em camundongos (mdx), fibras glicolíticas rápidas são afetadas em maior grau e com maior gravidade do que suas contrapartes maislentas 31,32,33,34. De forma semelhante, na distrofia muscular facioscapulohumeral (FSHD), uma transição de contração rápida para lenta é observada com uma maior proporção de fibras tipo I, juntamente com menor produção de força nas fibras tipoII 24,35,36.

Ainda não está claro por que certos tipos de fibras musculares são seletivamente afetados ou poupados em diferentes doenças. O fato de esses padrões serem não aleatórios ressalta a importância de dissecar os mecanismos subjacentes, para os quais o isolamento de fibra única se tornou uma técnica poderosa e amplamente utilizada. De fato, desde que foi introduzida pela primeira vez em meados dos anos 80 por Bischoff37, essa ferramenta indispensável tem sido continuamente refinada e adaptada, permitindo uma investigação cada vez mais precisa da biologia muscular 38,39,40. Importante, o isolamento de fibra única mantém os SCs o mais próximos possível de seu nicho fisiológico, permitindo um escrutínio adequado de sua atividade molecular. Embora grupos musculares como os do flexor dos dedos curtos (FDB) e EDL possam ser extraídos com relativafacilidade 41,42,43, o músculo SOL continua sendo um dos músculos mais difíceis para obter uma população rica de fibras intactas. Isso se deve à sua rigidez, comprimento longo das fibras e suscetibilidade a danos. Para resolver isso, uma técnica foi otimizada no presente estudo que produz robustamente uma população viável e de alta qualidade de fibras do músculo SOL, notoriamente difícil de isolar. Quando combinada com o isolamento de fibras de EDL, essa abordagem possibilita a cultura de fibras e células derivadas (células satélite, mioblastos e miotubos) a partir de grupos musculares distintos. De forma crucial, essa plataforma permite a investigação sistemática dos fatores moleculares que podem contribuir de forma diferencial para diversas patologias musculares e oferece um meio poderoso de testar intervenções farmacêuticas de forma a revelar respostas específicas do tipo muscular e, em última análise, apoiar o desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças musculares esqueléticas.

Protocolo

Todos os animais eram alojados na instalação animal da Universidade Metropolitana de Tóquio (Números de Permissão: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Todos os animais foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos (FPS). O manuseio de animais e os procedimentos experimentais empregados neste estudo seguiram rigorosamente as diretrizes do Comitê de Segurança e Ética da Universidade Metropolitana de Tóquio.

1. Preparação do Reagente

  1. Use luvas durante todo o processo. Em um tubo centrífugo de 25 mL, prepare 0,5% da solução de colagênase tipo I em alta glicemia, o Meio Eagle Modificado (DMEM) + GlutaMAX de Dulbecco, com suspensão de 1% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (AB). Depois que a colagênase estiver bem dissolvida (toque leve no tubo se necessário), esterilize a solução filtrando através de um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,22 μm.
    NOTA: 2,5 mL de solução de colagênase são suficientes para dois soléus (um camundongo).
  2. Prepare 10 mL de albumina sérica bovina (BSA) a 5% em soro salino tamponado com fosfato (PBS). Inative térmicamente a 60 °C por 30 minutos e depois filtre a solução através de um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,22 μm.
    NOTA: Os 5% de BSA na solução de PBS podem ser armazenados a 4 °C por até 10 dias.

2. Dissecação dos músculos do sóleo

  1. Equipamentos de layout para dissecação muscular (Figura 1A).
  2. Anestesiar camundongos C57BL/6 por injeção intraperitoneal de uma mistura tripla de anestesia (0,5 mL/g de peso corporal) contendo 1 mg/mL de medetomidina cloridrato, 5 mg/mL de midazolam e 5 mg/mL butorfanol tartrato, depois eutanasiar os camundongos por luxação cervical.
  3. Faça incisões sequenciais na pele no membro traseiro e retire a pele. Remova a fáscia superficial.
  4. Separe o tendão plantar (PLA) dos feixes de tendões gastrocnêmio (GAS) e sóleo (SOL). Remova suavemente o PLA puxando do tendão (Figura 1B).
  5. Corte os feixes de tendões GAS e SOL e exponha os músculos. Insira um pino no espaço entre o tendão proximal do GAS e o SOL (Figura 1C).
  6. Deslize cuidadosamente a agulha em direção à extremidade distal para separar o músculo SOL e o GAS (Figura 1D).
  7. Corte os fibrados de tendões do lado do GAS (Figura 1E).
  8. Descanse o prazo de prescrição sobre o GAS. Ajuste cuidadosamente a posição do SOL para expor o tendão proximal e corte-o com uma micro tesoura (Figura 1F).
  9. Posicione o SOL sobre a mesa de dissecação e remova o tendão restante (Figura 1G).
    NOTA: Esta etapa é opcional; o tendão restante não afeta o resultado.

3. Digestão dos músculos sóleo

  1. Transfira o sóleo intacto para um tubo centrífugo de 25 mL contendo a solução preparada de colagenase a 0,5%. Incube a 37 °C por 130 minutos.
    NOTA: A cada 15–20 minutos, é possível agitar manualmente a amostra para separar levemente as fibras e apoiar a atividade da colagenase.

4. Isolamento de fibras individuais sob um estereomicroscópio

  1. Corte duas pipetas Pasteur para criar uma com cano largo e outra com abertura estreita (Figura 2A). Sob chamas, esterilize e suavize os furos para evitar danos musculares durante a trituração.
  2. Para evitar a aderência da fibra durante o isolamento, recubra pipetas Pasteur e três placas de Petri de 50 mm com 5% de BSA/PBS.
    NOTA: Um estereoscópio (Figura 2B) foi usado durante todas as etapas do isolamento.
  3. Após a digestão muscular, descarte o excesso de solução de colagênase e transfira o sóleo para o primeiro recipiente contendo DMEM com 1% de AB (Figura 2C).
  4. Usando a pipeta de amplo padrão Pasteur, enxágue suavemente para cima e para baixo para dissociar as fibras (Figura 2D).
  5. Com a pipeta Pasteur de calibre estreito, transfira fibras simples intactas ao longo do comprimento da fibra muscular para o segundo prato. Aproveite a oportunidade aqui para remover detritos e/ou fibras encolhidas (Figura 2E,F).
  6. Transfira fibras simples de alta qualidade (de comprimento total/intactas) para um terceiro prato para garantir pureza com a pipeta Pasteur de diâmetro estreito (Figura 2G,H).
  7. Colete as fibras em um tubo centrífugo de 25 mL revestido com BSA. Mexa suavemente a suspensão e deixe por 5 minutos em temperatura ambiente para permitir que as fibras precipitem até o fundo do tubo.
  8. Usando a pipeta de cano estreito Pasteur, descarte cuidadosamente o sobrenadante, removendo qualquer detrito restante. Deixe aproximadamente 500 μL do DMEM com solução AB a 1%. Esse precipitado conterá uma população altamente purificada de fibras musculares únicas (Figuras 2G,H).
    NOTA: Essa técnica pode gerar > 300 fibras individuais, que podem ser usadas para extração de proteínas e mRNAs e subsequente análise.

5. Estabelecimento de culturas de mioblastas altamente purificadas a partir de fibras de sóleo

  1. Dilua a matriz Matrigel até 0,1 mg/mL e use para revestir uma placa de cultura de 100 mm. Incube o prato a 37 °C por 30–60 minutos até que o revestimento polimerize uniformemente.
  2. Adicione um volume igual de Accutase à suspensão das fibras musculares e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Subsequentemente, adicione 10 mL de meio de crescimento (composto por DMEM sem glicose contendo 30% de soro fetal bovino, 1% de GlutaMAX, 1% de extrato de embrião de frango, CEE, 1% AB e 0,01 μg/mL fator de crescimento fibroblasto básico, bFGF)44.
    NOTA: Uma quantidade igual de Accutase neste caso é a quantidade de 500 μL descrita na Seção 4.8. A Accutase facilita a dissociação suave das fibras musculares e ajuda a liberar células satélite, apoiando a expansão subsequente da cultura de mioblastos.
  3. Transfira os 10 mL de suspensão de fibras musculares tratadas com Accutase para um recipiente revestido com Matrigel. Aproximadamente 4 fibras simples/cm 2 são adicionadas a um prato de cultura de 100 mm. Garanta que as fibras estejam distribuídas uniformemente pelo prato de cultura.
  4. Após 3 dias em meio de cultivo, colônias de mioblastas podem ser observadas. Substitua o meio de crescimento diariamente até que os mioblastos atinjam a população necessária. Normalmente, até o 6º dia, as culturas de mioblastas tornam-se confluentes o suficiente para a fase experimental (Figura 3A).
  5. Desprenda os mioblastos do prato original de cultivo usando tripsina e incube a amostra a 37 °C por 2 minutos. Usando um hemocitômetro, conte as células e sementes de acordo com o tamanho do poço e a confluência celular necessária para a progressão miogênica.
    NOTA: Para um prato de 100 mm, adicione 1 mL de tripsina.

Resultados

Nossa técnica demonstra que fibras isoladas dos músculos sóleo (SOL) e extensor do dedo longo (EDL) podem ser imunomarcadas de forma eficiente contra Pax7 (Figura 3B). Essas fibras isoladas podem ser mantidas em meio de cultura flutuante (composto por DMEM + GlutaMAX com 10% de soro de cavalo, 1% AB, 0,5% CEE) por 3 dias, seguido por imunomarcação (Figura 3B). Não é recomendado manter fibras flutuantes por mais de 4 dias. Sob as condições descritas de fibras flutuantes, as miofibras tendem a se agregar após esse período, comprometendo a análise subsequente de imunomarcagem.

A técnica apresentada pode ainda ser usada para imunoblotting em todo o programa miogênico (Figura 3C). De fato, mioblastos derivados de SOL e EDL foram placados em placas de 24 poços com aproximadamente 70% de confluência. As células foram mantidas no meio de crescimento por 1 dia (mioblastos) ou induzidas a se diferenciar por dois ou quatro dias (miotubos de formação precoce e diferenciados, respectivamente). Cinco μg de proteína foram carregados para análise de imunoblot.

A expressão do MyHC I foi quase especificamente expressa em fibras musculares derivadas do SOL, com expressão mínima nos miotubos e desprezível nos mioblastos (Figura 3C). MyHC II foi expresso tanto nas fibras musculares SOL quanto EDL. Essa expressão reflete o SOL, composto principalmente por tipos I e IIa, enquanto a EDL é composta principalmente por fibras IIx e IIb. Mioblastos não expressaram MyHC II, mas sua expressão aumentou progressivamente durante a diferenciação. As proteínas relacionadas à oxidação PGC-1α e COXIV demonstraram a maior expressão esperada em fibras derivadas de SOL. Além disso, uma expressão mais alta de GLUT4 foi detectada em fibras isoladas de SOL em comparação com fibras de EDL. Um problema que biólogos de músculos esqueléticos podem enfrentar é que proteínas de manutenção e controles de carga amplamente utilizados, como α-tubulina, β-actina, GAPDH e colorações de proteína total, incluindo Ponceau S, não permanecem estáveis em mioblastos, miotubos e fibras musculares isoladas, cada uma apresentando variabilidade distinta. A intensidade do sinal da α-tubulina e da β-actina foi maior nos miotubos, enquanto a coloração de Ponceau S foi relativamente fraca nos mioblastos. Em contraste, o GAPDH apresentou expressão mais forte nas fibras musculares da EDL. No entanto, dependendo do propósito experimental, uma dessas proteínas de manutenção pode ainda ser aplicável; alternativamente, fatores de normalização como a proteína de choque térmico 70 (HSP70) podem ser explorados.

Figura 1
Figura 1. Dissecação do músculo sóleo. (A) Equipamentos necessários para dissecação. 1: microtesoura, 2: pinças finas, 3: tesouras dissecadoras, e 4: pinos de dissecação. (B) O tendão de PLA foi cortado dos feixes de tendões GAS e SOL (seta amarela). O tendão distal de PLA (seta branca) foi levantado com pinças. (C) Um pino de dissecação foi inserido no espaço entre o tendão proximal do SOL (seta vermelha) e o GAS (seta verde). (D) O SOL foi separado do GAS usando um pino de dissecação. (E) Os feixes de tendões GAS e SOL foram então cortados no lado do GAS. (F) O tendão proximal do SOL foi então cortado com microtesoura. (G) Feixes de tendões distais adicionais foram removidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2. Isolamento das fibras do sóleo. (A) Equipamentos necessários para isolamento. 1: pipetas de diâmetro estreito e 2: carabinas Pasteur de grande diâmetro. (B) Estereoscópio usado para isolamento. (C) O sóleo digerido por colagênese foi transferido para o DMEM com 1% AB. (D) As fibras do sóleo se dissociaram do músculo após as primeiras 10 sessões de enxágue. (E) Fibras simples transferidas para o segundo prato. (F) Imagem mostrando fibras limpas removidas de detritos e fibras encolhidas. (G) Fibras simples sem detritos transferidas para o terceiro prato. (H) Fibras simples intactas claramente visíveis. Barra de escala = 10 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Expansão da cultura celular e análise de amostras derivadas de EDL e SOL. (R) Após 6 dias após o isolamento, as amostras cultivadas com meio de proliferação mostram uma cultura de mioblastos puros obtida a partir de fibras isoladas do sóleo. Barra de escala = 100 μm. (B) SOL e fibras únicas derivadas de EDL, imediatamente ou 3 dias após o isolamento, mostram células satélite imunomarcadas para Pax7 (verde). A ausência de MyoD (vermelho) confirma que as células satélite ainda não se comprometeram com a ativação miogênica. As fibras foram contra-tingidas com DAPI (azul). As células foram posteriormente observadas por meio de um microscópio de fluorescência. Barra de balança = 20 μm. (C) 5 μg de proteína foi usada para imunoblotting de mioblastos, miotubos e amostras derivadas de miofibras. Painéis de imunobloting mostram a expressão de MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulina, β-actina e GAPDH foram usados como alvos de limpeza/normalização. A coloração Ponceau S foi usada como controle total de carga proteica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

A primeira chave para isolar um grande número de fibras musculares do sóleo (SOL) é manter a integridade estrutural do músculo durante a dissecação. Se o epimisio do SOL for rompido ou se o músculo for puxado com força, especialmente ao longo de seu eixo longitudinal, durante a dissecação, o rendimento de isolamento será severamente comprometido. Esses erros de dissecação geralmente são fáceis de identificar depois. De fato, após a digestão da colagênase, o músculo fica uniformemente encolhido e forma uma massa branca e compacta. Nessas condições, apenas um número muito pequeno de fibras viáveis pode ser dissociado.

O segundo fator decisivo para o sucesso do isolamento do sóleo é a eficiência da digestão da colagênase tipo I. Quando a colagênase está funcionando de forma ideal, aproximadamente 100–200 fibras do sóleo podem ser obtidas durante as primeiras 10 sessões de enxágue. Em contraste, quando a digestão é subótima, mesmo após as primeiras 20 lavagens, menos de 50 fibras podem ser liberadas. Para obter um rendimento maior de fibras, é necessário enxágue mais vigoroso e ciclos adicionais de enxágue. No entanto, como as fibras SOL são excepcionalmente frágeis, isso frequentemente resulta em encolhimento durante o enxágue.

Para estabelecer uma cultura primária de mioblastas derivadas do SOL puro, a digestão da colagênase novamente desempenha um papel crucial. Quando a digestão é eficiente, menos fibras permanecem ligadas ao tecido residual e a transferência das fibras para o meio de cultivo resulta em contaminação mínima por fibroblastos. Em contraste, quando o SOL é mal digerido, fibras dissociadas permanecerão presas ao tecido residual, contaminando a cultura de mioblastos com fibroblastos. Os pesquisadores devem procurar os sinais típicos de contaminação por fibroblastos nas amostras de células semeadas; estes incluem tamanho celular muito maior e extensas protuberâncias do citoesqueleto, em comparação com as células satélites muito menores em formato de fuso em pratos aderidos com Matrigel. Caso ocorra contaminação, os pesquisadores podem submeter as células a etapas de pré-placagem, conforme descrito em outrolugar 45. Brevemente, os SCs são cultivados por 3 dias após o isolamento, depois tripsinizados e brevemente pré-pratados em pratos revestidos com colágeno. Durante 15–30 minutos de incubação, os fibroblastos aderem enquanto os SCs permanecem suspensos e são transferidos para placas frescas revestidas com Matrigel.

Como mencionado acima e consistente com nossa experiência, as fibras SOL são mais longas e frágeis do que as fibras do extensor do dedo longo (EDL) e do flexor do dedo curto (FDB). Isso torna a transferência de fibras usando pipetas Pasteur desafiadora. É essencial aspirar as fibras ao longo de seu eixo longitudinal em vez de puxá-las pelo centro; caso contrário, as fibras se dobram e encolhem sob o estresse. Além dos fatores decisivos que determinam diretamente se o isolamento da fibra tem sucesso, alguns passos técnicos adicionais são essenciais para melhorar o rendimento da fibra do soléo. Uma delas é revestir todas as pipetas, pratos e tubos de coleta Pasteur com 5% de BSA. Isso impede que fibras musculares recém-dissociadas aderam às superfícies, prevenindo assim a dobra das fibras e o encolhimento subsequente. Recomenda-se preparar novas pipetas Pasteur esterilizadas termicamente e revestidas com BSA cada vez que amostras musculares forem isoladas. Alternativamente, os pesquisadores poderiam preparar um conjunto de pipetas Pasteur para uso a longo prazo. Se sim, esterilize com calor a cada vez e passe uma camada fresca com BSA antes de usar.

O protocolo convencional para isolamento de fibras musculares individuais foi principalmente otimizado para músculos glicolíticos como FDB e EDL37. No entanto, músculos oxidativos, como o SOL, são estruturalmente distintos. Análises transcriptômicas mostraram que a expressão gênica relacionada à matriz extracelular (ECM) difere entre o SOL e o EDL46, incluindo genes como a distrofina, uma proteína ligadora do citoesqueleto do músculoesquelético 44. Consequentemente, a condição padrão para a digestão muscular EDL com 0,2% (2 mg/mL) de colagênase por 60–90 minutos não é ideal para os músculos SOL, resultando em feixes compactos de fibras ou fibras encolhidas após a digestão. Neste estudo, otimizamos vários passos-chave para adaptar o protocolo para músculos SOL oxidativos. Ao ajustar a concentração de colagênase tipo I para 0,5% (5 mg/mL), estender o período de incubação para 130 min e minimizar o estresse mecânico durante o enxágue, é possível obter consistentemente de 300 a 500 fibras intactas de um único camundongo. Comparado à EDL, o número e o rendimento das amostras SOL permanecem menores (a EDL pode render > 500 fibras); no entanto, o número de fibras e, importante, a alta qualidade das nossas fibras derivadas do SOL são robustos e adequados para aplicações posteriores, como imunomarcação e imunoblot. Embora nossos resultados de imunoblot tenham consistido em amostras de fibra única agrupadas, a técnica apresentada neste relatório é capaz de extrair fibras individuais intactas de forma confiável, tornando-as adequadas para aplicações posteriores como imunoblot, proteômica e sequenciamento de RNA47 em resolução de fibra única. Pesquisadores na área podem usar essa técnica para estudar diferenças metabólicas e contráteis entre fibras musculares oxidativas e glicolíticas.

No geral, esse protocolo oferece um método reprodutível e acessível para isolar fibras oxidativas intactas do músculo sóleo, ampliando o conjunto de ferramentas disponível para investigar a fisiologia e mecanismos moleculares específicos de fibras musculares.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo estabelecimento de bolsas universitárias para a criação de inovação em tecnologia científica (JST, bolsa nº JPMJFS2139 para T.H.) e bolsas da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (KAKENHI 23H00457 concedido ao N.L.F., 20J12849 a Y.Mi., 24K22254 a Y. Ma). Este estudo também foi apoiado pela Bolsa de Pesquisa Avançada do Governo Metropolitano de Tóquio [R2-2] para a Y.Ma., N.L.F., e pelo fundo estratégico de pesquisa da TMU para projeto inovador de pesquisa [R3] para a N.L.F. Obrigado a Yasuro Furuichi por seus conselhos e comentários úteis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Nome do produto: Vetorphale injeção
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Nome do produto: Dorbene Injeção
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Nome do produto: Dormicum Injeção
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0,25%), phenol redGibco25200056
Equipamento
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100Referido como Petri dish no manuscrito
Anticorpos para imunomarcação
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anticorpos para imunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ peroxidase de rábano
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ peroxidase de rábano
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

Referências

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