Um Modelo de Cultura Tridimensional Apoiando o Desenvolvimento Folicular Secundário Humano a Antral In Vitro

Resumo

Este estudo estabeleceu um modelo de cultura tridimensional (3D) que sustenta o desenvolvimento do folículo humano do estágio secundário ao antral in vitro. Esse sistema possibilita o crescimento e a formação de folículos enquanto preserva as características moleculares das células somáticas, fornecendo um modelo fundamental para a pesquisa em foliculogênese humana.

Resumo

A foliculogênese ovariana humana é um processo complexo e rigidamente regulado, que é desafiador de estudar diretamente in vivo. Embora modelos in vitro sejam essenciais para a pesquisa mecanicista, os sistemas existentes permanecem subótimos porque não conseguem recapitular a dinâmica espaço-temporal do desenvolvimento folicular. Este estudo apresenta um modelo de cultura 3D que apoia o desenvolvimento do folículo humano desde o estágio secundário até o antral. Este modelo recapitula com sucesso eventos morfológicos in vivo chave, incluindo crescimento folicular sustentado, uma fase de expansão de diâmetro distinto a partir do dia 10 e formação da cavidade antral por volta do dia 20. Importante destacar que essa progressão do desenvolvimento culminou na coleta bem-sucedida de óvulos viáveis no estágio da vesícula germinal (VG). Além disso, a análise de imunofluorescência revelou padrões distintos de expressão de receptores de gonadotrofina em células somáticas, consistentes com a identidade da granulosa e da teca. Células semelhantes a granulosas internas apresentaram alto receptor de hormônio folículo-estimulante (FSHR), enquanto células externas semelhantes a teca apresentaram alta expressão do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Esse modelo oferece uma plataforma valiosa para o estudo da foliculogênese humana e toxicologia reprodutiva, além de fornecer uma referência para otimizar sistemas de cultura folicular in vitro para desenvolvimento do estágio secundário ao antral.

Introdução

O processo fisiológico de desenvolvimento do folículo ovariano, do estágio primordial ao pré-ovulatório, é fundamental para a fertilidade^{feminina 1}. Esse processo envolve uma série altamente coordenada de eventos, incluindo o crescimento/maturação dos oócitos e a proliferação/diferenciação das células^{da granulosa 2}. As interrupções nesses mecanismos complexos representam uma das principais causas de infertilidade e disfunção ovariana. Um entendimento detalhado das redes regulatórias subjacentes à foliculogênese — abrangendo sinalização paracrina, interações ovocito-célula somática e dinâmica da matriz extracelular — é, portanto, de importância fisiopatológica crítica. No entanto, a investigação direta da foliculogênese humana in vivo permanece limitada por limitações éticas e práticas, o que impulsiona a necessidade de modelos in vitro confiáveis para elucidar esses mecanismos. Apesar dos avanços, ainda existe uma falta crítica de um modelo de cultura de longo prazo que apoie o desenvolvimento do folículo humano, especialmente do estágio secundário ao antral.

Embora a cultura folicular humana em matrizes bidimensionais (2D) ou tridimensionais (3D) tenha avançado o entendimento do desenvolvimento folicular^{precoce 3,4}, tais sistemas permanecem limitados no suporte à progressão para estágios posteriores. É notável que alcançar a foliculogênese humana in vitro em estágios avançados de desenvolvimento continua sendo particularmente desafiador devido ao maior tamanho dos folículos e ao longo prazo^{de maturação 5}. Mesmo entre o número limitado de sistemas de cultura folicular in vitro humana que conseguiram produzir ovocitos MII com sucesso, as taxas de maturação permanecem baixas (aproximadamente 20% no máximo⁾6,7,8,9. Talvez um desafio mais fundamental seja a recapitulação da transição do secundário para o antral, uma fase crítica e estruturalmente complexa que ainda não foi adequadamente modelada in vitro.

Este estudo estabeleceu um modelo de cultura 3D que apoia o desenvolvimento in vitro de folículos secundários humanos em folículos antrais com estruturas cáricas distintas. Esse modelo fornece uma base fundamental para investigações mais aprofundadas dos mecanismos regulatórios subjacentes ao desenvolvimento do folículo humano e serve como referência para futuras otimizações de sistemas de cultura folicular voltados para o desenvolvimento do secundário ao antral.

Protocolo

Este protocolo de estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim (Aprovação nº M2024151). Todos os tutores legais de menores participantes do estudo assinaram o formulário de consentimento informado.

Fonte de tecido
O tecido medular ovariano humano utilizado neste protocolo foi obtido de quatro pacientes pediátricas diagnosticadas com teratoma ovariano (idades de 2, 6, 13 e 16 anos) que doaram tecido ovariano para fins de pesquisa (Tabela 1). O córtex ovariano foi utilizado para estudos de criopreservação de tecido ovariano, enquanto o tecido medular restante foi empregado para cultura folicular in vitro neste estudo. Um total de 33 folículos secundários foram isolados, com 16 folículos designados para o grupo controle e 17 para o grupo de cultura 3D.

Preparação do reagente
O meio de transporte consistia no meio L-15 de Leibovitz, suplementado com suplemento substituto sérico a 10%, armazenado a 4 °C. A solução digestiva completa foi preparada suplementando MEMα com 0,04 mg/mL de Liberase DH, 10 IU/mL de DNase I e 100 UI/mL de penicilina-estreptomicina, armazenada a -20 °C. A solução para parar a digestão foi DPBS suplementada com suplemento de substituto sérico a 10% e armazenada a 4 °C. O meio de crescimento completo foi preparado suplementando MEMα com suplemento substituto sérico a 10%, 1% de insulina-transferrina-selênio, 50 μg/mL de ácido L-ascórbico, 2 mM de piruvato de sódio e 100 UI/mL de penicilina-estreptomicina. O meio era armazenado a 4 °C. O hormônio folículo-estimulante humano recombinante (FSH) foi adicionado a uma concentração final de 100 mIU/mL no início da cultura, conforme descrito em um estudo^{anterior 10}. Após a detecção visual da formação precoce de antros (por volta do dia 20), o hormônio luteinizante humano recombinante (LH) foi suplementado a uma concentração final de 10 mIU/mL durante as mudanças de meio. A matriz sólida de cultura foi preparada misturando a matriz de membrana basal de 70% (v/v) com meio de crescimento completo gelado a 30% (v/v) e mantida no gelo durante todas as etapas de manuseio.

Digestão de tecidos e isolamento secundário do folículo
O tecido ovariano era colocado em meio de transporte e transportado para o laboratório a 4 °C. Em condições estéreis, a medula ovariana era dissecada usando um bisturi. O tecido foi seccionado em pedaços finos (~3 × 3 × 1 mm) e ainda mais triturado em pequenos fragmentos (~0,5 × 0,5 × 1 mm) com um cortador de tecido, mantendo o tecido úmido durante todo o processo. O tecido picado foi transferido para um recipiente de 35 mm, e uma solução digestiva completa pré-aquecida foi adicionada a 2 mL por tecido de 100 mg. A incubação foi realizada a 37 °C por 45–80 minutos (média: 60 ± 15 minutos), com mistura suave a cada 10 minutos. A digestão foi interrompida quando o exame microscópico revelou o afrouxamento da matriz estromal e a liberação de folículos individuais (Figura 1). Folículos secundários saudáveis (diâmetro 100–200 μm, com ≥ 2 camadas celulares de granulosa e um oócito visível) foram selecionados sob estereoscópio usando uma pipeta de vidro controlada pela boca (diâmetro interno 200 μm) e lavados duas vezes com meio de crescimento completo pré-aquecido.

Incorporação 3D e cultura de longo prazo
Um inserto de cultura celular foi colocado em um recipiente de 35 mm umedecido com 2 mL de meio de crescimento completo e pré-equilibrado em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) por 2 horas. Folículos secundários selecionados foram transferidos para o insert e pré-cultivados durante a noite sob as mesmas condições. Ao final da pré-cultura, os folículos do grupo controle foram cultivados diretamente dentro do inserto (cultura 2D). Em contraste, folículos designados para o grupo de cultura 3D foram preparados para serem incorporados em uma matriz de membrana basal reduzida por fator de crescimento (proteína total 8~12 mg/mL). A matriz foi descongelada sobre gelo e misturada com meio de crescimento completo gelado a 30% (v/v). Gotículas de 40 μL da mistura foram colocadas em um recipiente de 35 mm (máximo seis gotas por prato), formando uma camada uniforme de gel com aproximadamente 1,5 mm de altura. Em seguida, um único folículo secundário era transferido para cada gota usando uma pipeta de vidro controlada pela boca, cuidadosamente posicionada no terço médio ao superior da gota para evitar que ela afundasse. O prato foi colocado em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) por 30 minutos para permitir a gelificação. Após a solidificação, 2 mL de meio de crescimento completo foram adicionados suavemente ao recipiente para iniciar a cultura a longo prazo.

Manutenção e monitoramento da cultura
Uma troca de meio de 50% com meio de crescimento fresco completo (contendo FSH) foi realizada a cada 48 horas. Os folículos foram observados diariamente sob estereoscópio, e seus diâmetros e características morfológicas foram registrados. Após a detecção visual da formação precoce de antros (por volta do dia 20), LH humano recombinante foi adicionado ao meio durante as mudanças subsequentes. A cultura foi mantida por até 30 dias ou até que os folículos atingissem o estágio antral (diâmetro > 400 μm com cavidade claramente definida cheia de líquido).

Dissociação celular pós-cultura
Ao final da cultura, os folículos antrais foram transferidos para um recipiente contendo DPBS fresco e dissociados mecanicamente usando uma seringa estéril de calibre 29. Os complexos cúmulo-óócito (COCs) isolados foram transferidos para um prato separado para análise posterior. A suspensão restante da granulosa e da célula theca foi transferida para um novo prato de 35 mm contendo 2 mL de meio de crescimento completo pré-aquecido, cuidadosamente girado para distribuição uniforme e incubado por 48 horas (37 °C, 5% CO₂).

Análise de imunofluorescência
Após a cultura, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas três vezes com PBS, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 por 20 minutos e, em seguida, bloqueadas durante a noite a 4 °C usando 1% de BSA em PBS. As células foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários. Os anticorpos primários usados foram anti-FSHR (coelho, 1:200) e anti-LHR (camundongo, 1:100). Após a incubação, as células foram lavadas três vezes por 15 minutos cada com PBS contendo 1% de BSA. Posteriormente, foram incubados com anticorpos secundários fluorescentes (anti-coelho e anti-rato, 1:200) por 2 horas em temperatura ambiente, no escuro. Por fim, as células passaram por três lavagens finais, cada uma com duração de 20 minutos. Os núcleos foram corados com DAPI por 5 minutos em temperatura ambiente. Depois, as amostras foram lavadas três vezes por 5 minutos com PBS contendo 1% de BSA. A imagem foi realizada usando um sistema de imagem de alto conteúdo Operetta CLS em modo confocal. Os sinais de fluorescência foram capturados usando os seguintes canais: DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) e Alexa Fluor 647 (FSHR), com configurações de exposição consistentes em todas as amostras.

Análise estatística
Comparações do diâmetro do folículo entre o grupo controle e o grupo de cultura 3D nos dias 5, 10 e 15 foram realizadas usando um teste t de amostras independentes. Um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística do diâmetro do folículo não foi realizada além do dia 15, pois quase todos os folículos do grupo controle não sobreviveram após o dia 15. Isso resultou em um tamanho amostral inadequado, impedindo comparações de grupo confiáveis e significativas. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism (versão 9.0).

Resultados

Desenvolvimento de um modelo de cultura 3D que apoia o crescimento do folículo humano até o estágio antral
Um grande desafio na pesquisa com folículos ovarianos é o desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro que apoie o desenvolvimento completo do folículo, com a formação da cavidade antral como um marco fundamental. Assim, este estudo estabeleceu um modelo de cultura 3D para folículos humanos in vitro (Figura 2

Discussão

A manutenção bem-sucedida dos folículos ovarianos humanos in vitro por meio da transição do secundário para o antral representa um avanço técnico significativo. Neste estudo, um sistema de cultura 3D que oferece suporte biofísico adequado e sinais hormonais específicos para cada estágio possibilitou essa progressão. Esses resultados estão alinhados com evidências recentes que ressaltam a necessidade de sistemas de cultura 3D para recapitular a fisiologia tecidual. Embora as mono...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondary)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondary)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix for organoid culture	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Cell culture insert	Millipore	PICMORG50
Culture dish	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	41400045
L-Ascorbic acid	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Serum substitute supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
The high-content imaging system	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100