Perfil Transcriptômico e Análise Bioinformática de Amostras de Medula Óssea para Identificar Assinaturas de Resistência à Quimioterapia em Leucemia Mieloide Aguda

Resumo

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho bioinformático padronizado para analisar alterações transcriptômicas na leucemia mieloide aguda (LMA). O objetivo é comparar amostras de medula óssea recém-diagnosticadas e recaídas e priorizar assinaturas moleculares associadas à resistência à quimioterapia e à progressão da doença para investigações subsequentes.

Resumo

A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma malignidade hematológica altamente heterogênea, na qual a recaída e a quimiorresistência adquirida continuam sendo as principais causas de falha no tratamento. Este artigo apresenta um protocolo bioinformático para análise transcriptômica de aspiradores de medula óssea. O objetivo principal do protocolo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para identificar assinaturas moleculares associadas à progressão da doença e resistência à terapia em LMA recaída. O pipeline detalha os procedimentos computacionais para comparar amostras de medula óssea não pareadas, demonstrados usando dados de sequenciamento de cinco casos recém-diagnosticados e quatro casos recaídos. Este método descreve as etapas essenciais para processar dados de sequenciamento de RNA, realizar análise diferencial de expressão gênica e realizar avaliações funcionais posteriores. A aplicação desse fluxo de trabalho identificou 2.025 genes diferencialmente expressos (DEGs), incluindo FOXC1, HOXA11, HOXA11-AS e AXL, como transcritos candidatos associados à recaída neste conjunto de dados representativo. Análises funcionais e de rede priorizaram ainda conjuntos de genes e hubs de interação relacionados à sinalização de pequenas GTPase, sinalização inflamatória, interações com matrizes extracelulares e processos biossintéticos de RNA. No geral, essa metodologia fornece um pipeline computacional reprodutível para mapear assinaturas transcriptômicas associadas à AML recaída e para gerar hipóteses que exigem validação experimental subsequente.

Introdução

A leucemia mieloide aguda (LMA) é um grupo de neoplasias malignas clonais originadas de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas, caracterizada pela proliferação anormal de células mieloides imaturas na medula óssea e pela supressão da diferenciação hematopoiética ^1,2,3. Embora a quimioterapia indutiva padrão atual (como a citarabina combinada com antracicinas) possa induzir remissão completa na maioria dos pacientes, a taxa de recaída permanece de 50% a 70%, e o prognóstico para pacientes recaídas é significativamente ^{comprometido 4,5,6}. A resistência adquirida à quimioterapia está associada à falha do tratamento da LMA, exigindo uma análise aprofundada das assinaturas moleculares ligadas a esse processo para melhorar as estratégias terapêuticas e as taxas de sobrevivência^{dos pacientes 7,8}.

No corpo mais amplo de literatura, estudos existentes indicam que a resistência à quimioterapia na LMA não se limita à regulação para cima das bombas de efluxo de medicamentos ou metabolismo anormal dos medicamentos, mas também está ligada à manutenção da sobrevivência das células-tronco leucemias (LCS), à formação de fenótipos semelhantes à transição epitelial-mesenquimatosa (EMT) dentro do nicho hematológico e às interações com o microambiente da medula^{óssea 9. 10,11}. Por exemplo, populações de LSC apresentam alta capacidade de autorrenovação e quiescência, o que está associado à resistência inerente a agentes quimioterapêuticos específicos do ciclo celular¹². Além disso, a regulação para cima das tirosinas quinases receptoras, como AXL, tem sido associada à resistência em LMA FLT3-ITD+, ocorrendo junto com a ativação das vias PI3K/AKT e MAPK e capacidades antiapoptóticas^{aprimoradas 13,14}. A reprogramação metabólica e a remodelação epigenética também foram reconhecidas como importantes eixos regulatórios na formação de resistências. Evidências sugerem que as células de LMA durante a recaída podem se adaptar ao estresse oxidativo induzido pela quimioterapia e ao dano ao DNA por meio de atividade de fosforilação oxidativa aumentada (OXPHOS), rácios NAD⁺/NADH modulados e estados alterados de modificação de^histonas 15,16,17. Fatores inflamatórios no microambiente da medula óssea, como IL-6 e CXCL8, também estão associados à sobrevivência dos LSCs e à resistência à quimioterapia, frequentemente ocorrendo em coordenação com a ativação das vias de sinalização STAT3/^{NF-κB 11,18}.

Apesar desses mecanismos reconhecidos, as alterações transcriptômicas associadas à recaída da LMA e à quimiorresistência permanecem incompletamente caracterizadas, especialmente quando sinais metabólicos, epigenéticos e relacionados ao microambiente da medula óssea são avaliados juntos em amostras clínicas. Esse fluxo de trabalho atende a essa necessidade priorizando os DEGs candidatos, caminhos e redes regulatórias associadas à transição do diagnóstico inicial para a recaída clínica. A abordagem integra análise de expressão diferencial, análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) e construção de redes de interação proteína-proteína (PPI) para mapear a reprogramação transcricional em todo o sistema e indicar candidatos para validação mecanicista subsequente.

O objetivo geral desse método é apresentar um pipeline padronizado e reprodutível de bioinformática para comparar os transcriptomas em massa de amostras de medula óssea de LMA recém-diagnosticadas versus recaídas. A razão por trás do uso dessa técnica in silico é sua capacidade de capturar eventos transcricionais imparciais, abrangendo todo o genoma, ultrapassando as limitações das análises de via única para priorizar redes regulatórias complexas e multidimensionais. Essa técnica oferece vantagens significativas em relação a métodos alternativos, como microarrays ou painéis multiplex qPCR direcionados, ao fornecer uma faixa dinâmica maior, a capacidade de detectar novos transcritos e quantificação precisa da expressão gênica sem as limitações das sondas^{pré-projetadas 19,20}. Para determinar se esse método é apropriado para sua aplicação, os leitores devem observar que este pipeline é especificamente projetado para pesquisadores que processam dados de sequenciamento de RNA em massa de coortes clínicas pareadas ou não, como aspiradores de tecidos. É adequado para identificar assinaturas amplas associadas à resistência e redes regulatórias candidatas, enquanto pesquisadores que necessitam de resolução específica por tipo de célula ou espacial precisariam usar fluxos de trabalho complementares de sequenciamento de célula única ou espacial. Em última análise, esse protocolo computacional permite a priorização de genes candidatos, vias e redes regulatórias para investigações experimentais subsequentes.

Protocolo

Todos os métodos envolvendo o uso de amostragem de tecido humano foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e a Declaração de Helsinque (revisada em 2013). As amostras clínicas de medula óssea foram obtidas com aprovação do comitê de ética institucional (Números de Aprovação TY-ZKY2024-116-01 e TY-ZKY2024-116-02).

1. Coleta de Amostras Clínicas e Classificação de Pacientes

1. Selecione amostras de aspiração de medula óssea de pacientes formalmente diagnosticados com leucemia mieloide aguda (LMA) com base nos critérios de classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS).
2. Aplicar critérios específicos de inclusão e exclusão durante a seleção do paciente para garantir homogeneidade e reprodutibilidade da coorte. Inclua pacientes adultos com LMA primária e exclua pacientes com LMA secundária, leucemia promielocítica aguda ou histórico prévio de outras malignidades (Tabela 1).
3. Atribuir a amostra coletada ao grupo recém-diagnosticado se o paciente apresentar LMA previamente não tratada no momento do diagnóstico clínico inicial.
4. Atribuir a amostra coletada ao grupo recaído se o paciente apresentar reaparecimento de blastos leucêmicos no sangue periférico ou blastos maiores que 5% na medula óssea após uma remissão completa documentada.
5. Colete as amostras residuais de medula óssea desidentificadas imediatamente após o procedimento clínico de aspiração de medula óssea de rotina.
   NOTA: Na demonstração deste protocolo específico, nove amostras consecutivas (cinco recém-diagnosticadas e quatro recaídas) foram coletadas entre setembro de 2024 e setembro de 2025. Como isso utilizou apenas amostras clínicas residuais desidentificadas, o comitê de ética dispensou a exigência de consentimento informado por escrito.
6. Processe imediatamente o aspirado de medula óssea coletado para preservação de RNA usando um método padrão de lise de fenol-guanidinium²¹.
   1. Transfira a medula óssea recém-coletada aspirada para um tubo de coleta contendo um anticoagulante. Agite o tubo para misturar bem o aspirado e o anticoagulante.
   2. Extraia um volume medido da amostra anticoagulada e adicione-a a um reagente comercial de lise fenol-guanidínio. Mantenha uma razão de volume de 3 partes de reagente de lisão por 1 parte da amostra.
      ATENÇÃO: O reagente de lise fenol-guanidinium contém substâncias químicas tóxicas e corrosivas que podem causar queimaduras graves e danos aos tecidos. Realize toda a manuseio de reagentes dentro de uma exaustão química usando o equipamento de proteção individual adequado.
   3. Agite vigorosamente o tubo para homogeneizar completamente a amostra e o reagente de lise. Certifique-se de que a mistura esteja totalmente misturada e verifique se não restam coágulos visíveis na solução.
   4. Congele imediatamente a amostra homogeneizada, submergindo o tubo em nitrogênio líquido.
      ATENÇÃO: O nitrogênio líquido é extremamente frio e pode causar congelamento severo ao contato. Use luvas criogênicas e uma viseira facial completa ao manusear nitrogênio líquido.
7. Transfira as amostras congeladas rapidamente para um freezer de -80 °C para armazenamento a longo prazo antes do pipeline de isolamento de RNA e sequenciamento transcriptoma a jusante. Isso representa um ponto seguro onde o experimento pode ser pausado e reiniciado posteriormente.
   NOTA: O fluxo de trabalho apresentado neste protocolo foca inteiramente na geração de assinaturas de resistência computacional. Nenhuma validação experimental independente, como a PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), foi realizada nos principais genes diferencialmente expressos identificados por esse pipeline específico.

2. Controle de Qualidade de RNA e Preparação de Bibliotecas

1. Avalie a integridade do RNA usando um sistema de eletroforese capilar microfluídica. Para esse fluxo de trabalho representativo, inclua amostras de RNA com número de integridade de RNA (RIN) ≥ 6,0, razão A260/280 entre 1,8 e 2,1, e sem pico visível de degradação. Registre as razões de RIN e pureza medidas para cada amostra antes da preparação da biblioteca.
2. Entrada de 1 μg de RNA total por amostra para a preparação da biblioteca. Purifique o mRNA do RNA total utilizando esferas magnéticas ligadas a oligo-T para enriquecer transcritos com cauda poliA.
3. Fragmente o mRNA enriquecido usando cátions divalentes. Incube a mistura a 94 °C por 15 minutos em um tampão de reação de síntese de primeira cadeia 5X.
4. Sintetize o cDNA de primeira fita usando primers hexameros aleatórios e uma transcriptase reversa sem atividade RNase H.
5. Degrade a fita molde de RNA usando RNase H. Sinteza o cDNA da segunda fita utilizando DNA Polimerase I e dNTPs em um sistema de reação de 20 μL.
6. Incubar a reação de síntese da segunda cadeia a 16 °C por 1 hora. Centrifuge brevemente a mistura de reação a 2.000 x g para coletar o líquido no fundo do tubo.
7. Converta os saliências restantes em extremidades rombas utilizando atividades de exonuclease e polimerase. Adenilato as extremidades 3' dos fragmentos de DNA e liga adaptadores com estruturas em alça em forma de alfinete para preparar a hibridização.
8. Purifique os fragmentos da biblioteca usando esferas magnéticas reversíveis de imobilização em fase sólida para selecionar preferencialmente fragmentos de cDNA com comprimento de 370–420 pb.
9. Realize lavagens com etanol durante a purificação das contas. Centrifuge os tubos a 2.000 x g por 30 s para coletar e remover completamente qualquer etanol residual antes da elução final.
10. Realize amplificação por PCR usando uma DNA polimerase de alta fidelidade, primers universais de PCR e primers de índice específicos para amostra.
11. Execute o perfil térmico da PCR com uma desnaturação inicial a 98 °C por 30 s. Em seguida, faça 12 ciclos de 98 °C por 10 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, terminando com uma extensão final a 72 °C por 5 minutos.
12. Purifique novamente os produtos de PCR usando as esferas magnéticas. Aplique os mesmos parâmetros de centrifugação do passo 2.9 para obter a biblioteca final.
13. Quantifique a concentração inicial da biblioteca usando um fluorômetro. Dilua a biblioteca final para uma concentração de 1,5 ng/μL.
14. Misture bem a biblioteca diluída. Centrifuge a mistura a 10.000 x g por 1 minuto a 4 °C para remover qualquer detrito restante antes da análise final.
15. Avalie o tamanho do inserto da biblioteca usando o sistema de eletroforese capilar microfluídica.
16. Quantifique a concentração efetiva da biblioteca com precisão por meio da PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) após confirmar que o tamanho do inserto atende às expectativas. Certifique-se de que a concentração seja superior a 1,5 nM para garantir a estabilidade da biblioteca e a qualidade do sequenciamento.
    NOTA: Isso representa um ponto seguro onde o experimento pode ser pausado. As bibliotecas preparadas podem ser armazenadas a -20 °C até o agrupamento e sequenciamento.

3. Agrupamento e Sequenciamento de Transcriptoma

1. Realize o agrupamento das amostras codificadas por índice em um sistema automatizado de geração de cluster. Use um kit comercial de cluster emparelhado conforme as instruções do fabricante.
2. Sequencie as preparações da biblioteca em uma plataforma de sequenciamento de alta taxa após a geração bem-sucedida do cluster. Gerar 150 leituras de par de bases (bp) em extremidade pareada.

4. Controle de Qualidade de Dados e Mapeamento de Leituras

1. Avalie a qualidade dos dados brutos (formato FASTQ) usando o fastp v0.23.2 para controle de qualidade e filtragem de leitura bruta. Registre os parâmetros da linha de comando em um log de análise. Nesse fluxo de trabalho, leituras limpas eram geradas removendo leituras contendo adaptadores, leituras contendo sequências poly-N e leituras de baixa qualidade usando configurações de filtragem idênticas entre amostras. Um comando representativo de ponta pareada é fornecido no Arquivo Suplementar 1.
2. Processe as leituras brutas por meio de um software automatizado de pré-processamento. Obtenha leituras limpas removendo leituras contendo adaptadores, leituras contendo sequências poly-N e leituras de baixa qualidade. Use parâmetros de filtragem idênticos para todas as amostras e registre o número de leitura retido, Q20, Q30 e conteúdo GC após a filtragem.
3. Calcule o conteúdo de Q20, Q30 e GC dos dados limpos. Defina as variáveis potenciais do lote antes da análise a jusante, incluindo data de coleta da amostras, data de extração do RNA, lote de preparação da biblioteca, rota de sequenciamento e execução do sequenciamento.
4. Avalie os efeitos em lote por meio de ACP e análise de correlação amostra para amostra usando valores de expressão normalizados. Se as amostras se agruparem principalmente por variáveis técnicas e não por estado clínico, documente a variável afetada e inclua-a como uma covariável na fórmula de desenho de expressão diferencial ou aplique um método estabelecido de ajuste em lote antes da visualização a jusante.
5. Adquira o genoma de referência (Homo sapiens, GRCh38) e os correspondentes arquivos de anotação genética Ensembl release 109 para alinhamento de leitura.
6. Construa o índice do genoma de referência usando o HISAT2 v2.0.5.
7. Alinhe as leituras limpas de extremidade pareada ao genoma de referência usando o HISAT2 v2.0.5. Use essa abordagem de alinhamento consciente da emenda para gerar um banco de dados de junções de emenda baseado no arquivo de anotação do modelo gênico.

5. Previsão de Transcrições Inovadoras e Quantificação da Expressão Gênica

1. Monte as leituras mapeadas de cada amostra usando o StringTie v1.3.3b em uma abordagem baseada em referência. Utilize esta ferramenta para montar e quantificar transcritos de comprimento total representando múltiplas variantes de splice para cada locus gênico.
2. Conte o número de leituras mapeadas para cada gene usando featureCounts v1.5.0-p3. Use a matriz bruta de contagem de leitura de inteiros resultante como entrada para análise de expressão diferencial a jusante.
3. Configure featureCounts v1.5.0-p3 para dados de sequenciamento de extremidades pareadas usando a opção de extremidade pareada (por exemplo, -p). Forneça o arquivo de anotação GTF GRCh38 baixado para definir os limites corretos das características genômicas.
4. Calcule os Fragmentos por Quilobase de transcrito por milhão de leituras mapeadas (FPKM) para cada gene. Use valores FPKM apenas para visualização descritiva, PCA, exibição de mapas de calor e resumos exploratórios de expressões; não utilize valores FPKM como matriz de entrada para testes de expressão diferencial DESeq2.

6. Análise diferencial de expressão gênica

1. Realize a análise de expressão diferencial entre os grupos recém-diagnosticados e os grupos recaídas usando R v3.5.0 e o pacote DESeq2 R v1.20.0. Importar a matriz bruta de contagem de leituras gerada no passo 5.2 para o ambiente R e manter os valores FPKM apenas para visualização e análises exploratórias.
2. Construa o objeto de conjunto de dados especializado necessário pelo pacote de análise. Execute o comando específico (por exemplo, DESeqDataSetFromMatrix()) para vincular a matriz de dados de contagem com a tabela de metadados de amostra correspondente.
3. Defina a fórmula de design experimental dentro do objeto de software. Especifique o estado clínico (recém-diagnosticado versus recaída) como a variável principal para comparação (por exemplo, desenho = ~ condição). Se uma variável técnica de lote for identificada no passo 4.3 e não for completamente confundida com o estado clínico, inclua-a na fórmula de desenho (por exemplo, projeto = ~ lote + condição).
4. Execute a função central de análise diferencial de expressão (por exemplo, DESeq()). Permita que o software realize automaticamente a estimativa do fator de tamanho, estimativa de dispersão e teste binomial negativo^{de Wald 22}.
5. Extraia a tabela de resultados utilizando a função de extração de resultados (por exemplo, results()). Especifique o argumento do contraste para definir a comparação exata (recaída versus recém-diagnosticado).
6. Ajuste os valores P resultantes para controlar a taxa de falsas descobertas. Utilize o procedimento integrado de Benjamini e Hochberg aplicado automaticamente pelo pacote^{de software 23}.
7. Filtre a tabela de resultados extraída para isolar os genes diferencialmente expressos (DEGs) significativos. Atribua qualquer gene com um valor P ajustado < 0,05 e uma mudança_{absoluta logarítmica de 2} vezes > 1 como significativamente expresso de forma diferencial.

7. Análise de Enriquecimento da Ontologia Gênica (GO)

1. Realize uma análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) dos DEGs identificados usando clusterProfiler v3.8.1 e org. Hs.eg.db v3.6.0. Insira a lista de IDs de genes Entrez correspondentes aos DEGs significativos identificados no passo 6.7.
2. Execute a função de enriquecimento GO (por exemplo, enrichGO()). Especifique os parâmetros exigidos, incluindo o banco de dados de organismos de fundo apropriado (por exemplo, OrgDb = org. Hs.eg.db), o domínio ontológico específico (Processo Biológico, Componente Celular ou Função Molecular) e o corte ajustado do valor P (0,05).
3. Certifique-se de que o algoritmo aplique as correções necessárias durante o cálculo do enriquecimento. Confirme que o software corrige internamente o viés de comprimento do gene e ajusta os valores P usando o método^{de Benjamini e Hochberg 24}.
4. Considere termos GO com valor P corrigido menor que 0,05 como significativamente enriquecidos. Gere um gráfico de pontos ou gráfico de barras utilizando as funções integradas de visualização do pacote para exibir os termos GO mais enriquecidos.

8. Análise de Enriquecimento de Vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)

1. Utilize um banco de dados abrangente dedicado a compreender as funções de alto nível do sistema biológico para identificar as vias desreguladas. Prepare a mesma lista de IDs DEG Entrez principais usados no passo 7.1.
2. Execute a função de enriquecimento KEGG (por exemplo, enrichKEGG()) dentro do pacote de anotação funcional R.
3. Defina os parâmetros críticos dentro da chamada de função. Defina o código do organismo estritamente para humano (por exemplo, organismo = 'tem') e defina o método de ajuste do valor P (por exemplo, método pAdadjust = 'BH').
4. Extraia as vias KEGG estatisticamente significativas. Filtre a saída para reter apenas aqueles caminhos que demonstram um valor p corrigido menor que 0,05.
5. Visualize as vias KEGG mais enriquecidas. Utilize as funções integradas de plotagem (por exemplo, dotplot()) para mapear a significância estatística e a contagem de genes associadas a cada via.

9. Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos (GSEA)

1. Prepare a lista de genes pré-classificada necessária para a análise. Calcule a métrica de classificação para todos os genes expressos usando o valor -log10 (valor P) sinalizado multiplicado pelo sinal da variação_{log 2} vezes derivada da análise diferencial de expressão.
2. Inicie uma instalação local do software GSEA do Broad Institute v4.2.3. Insira a lista genética pré-ranqueada recém-gerada na interface^{de software 25}.
3. Baixe os conjuntos genéticos pré-definidos necessários. Adquira os conjuntos de dados Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) do Molecular Signatures Database (MSigDB, versão 7.5.1)²⁶.
4. Configure os parâmetros do software para realizar o teste de enriquecimento estatístico. Defina o número de permutações para 1.000 e selecione o tipo de permutação como 'gene_set'.
5. Execute o algoritmo de análise para determinar se os conjuntos gênicos predefinidos apresentam uma diferença estatisticamente significativa e concordante entre os estados biológicos recém-diagnosticados e os recaídas.
6. Avalie a significância estatística dos perfis de enriquecimento gerados. Defina conjuntos gênicos significativos usando limiares rigorosos: um valor absoluto de pontuação de enriquecimento normalizado (NES) > 1,0, um valor P nominal < 0,05 e um valor q da taxa de descoberta falsa (FDR) < 0,25.

10. Análise de Redes de Interação Proteína-Proteína (PPI)

1. Acesse o banco de dados STRING para interações proteína-proteína conhecidas e previstas. Nesse fluxo de trabalho, a análise PPI foi realizada com STRING v11.5²⁷.
2. Insira a lista de IDs de genes Entrez ou símbolos oficiais de genes para os genes significativos expressos de forma diferenciada (identificados no passo 6.7) na interface de busca do banco de dados. Selecione o Homo sapiens como o organismo-alvo.
3. Configure os parâmetros de construção da rede para garantir que interações de alta qualidade sejam recuperadas. Defina a pontuação mínima exigida de interação para um limiar de confiança alto (pontuação > 0,700).
4. Exporte os dados resultantes da rede de interação para um diretório local. Salve o mapa de interação como um arquivo tabular padrão (por exemplo, formato TSV).
5. Importe os dados de interação exportados para o Cytoscape v3.9.1 para visualização e análise da^{rede 28}.
6. Filtre a rede construída para melhorar a clareza da visualização e destacar os principais hubs regulatórios. Remova quaisquer nós desconectados ou genes órfãos que não apresentem interações contínuas que atendam ao limiar de confiança estabelecido.

Resultados

Validação de Coortes Clínicas e Sequenciamento

A execução bem-sucedida do protocolo de extração e preparação de bibliotecas de RNA a montante (Figura 1) foi confirmada por métricas de rendimento e qualidade do sequenciamento. Neste conjunto de dados representativo, amostras de medula óssea de cinco pacientes recém-diagnosticados com LMA e quatro pacientes com LMA recaída forneceram uma média de aproximadamente 6,0 GB de dados brutos por amostra. A avaliação de controle de qualidade (Tabela 2) confirmou que a qualidade base e a profundidade de leitura atingiram os limites exigidos para análise bioinformática a jusante9. Baixa integridade de RNA (por exemplo, RIN < 6,0), baixas taxas de mapeamento ou alto viés de degradação de transcritos representariam qualidade de entrada subótima e comprometeriam a confiabilidade da análise diferencial de expressão a jusante.

Variância Transcriptômica Global e ACP

Para avaliar a variância global do transcriptoma e inspecionar o agrupamento clínico, a PCA foi realizada com base nos dados de expressão normalizada. Neste conjunto de dados representativo, os grupos recém-diagnosticados e recaídas apresentaram separação no espaço bidimensional (Figura 2A⁾²⁰, com PC1 e PC2 respondendo, respectivamente, por 23,82% e 18,75% da variância total. Os diagramas de Venn na Figura 2B,C fornecem um resumo descritivo adicional dos genes detectados entre amostras dentro dos grupos recém-diagnosticados e recaídos, apoiando verificações de reprodutibilidade em nível amostral antes da análise de expressão diferencial posterior. Como a coorte era pequena e não pareada, a separação da ACP foi interpretada como um resultado ilustrativo do fluxo de trabalho, e não como evidência definitiva da biologia específica do estado da doença.

Análise de Genes de Expressão Diferencial (DEG)

A aplicação dos limiares estabelecidos do protocolo (|_{log 2}FC| ≥ 1 e o valor P ajustado ≤ 0,05) à saída do DESeq2 identificou 2.025 DEGs, compreendendo 772 genes regulados para cima e 1.253 genes para baixo no grupo recaído (Figura 3A). Os históricos escolares candidatos com alta variação incluíam FOXC1 (log₂FC = 7,55, P = 4,92 x ^10-5), HOXA11 (log₂FC = 7,76), HOXA11-AS (log₂FC = 7,23) e AXL (log₂FC = 3,50), além de RHOB, PTX3 e CXCL8 regulados em baixa. A literatura existente relaciona vários desses genes à tendência, sinalização ou resposta terapêutica da^{LMA 13,29}; no entanto, o fluxo de trabalho atual os identifica apenas como históricos escolares de candidatos associados a recaídas. Qualquer papel mecanicista definitivo na resistência clínica requer validação funcional independente subsequente.

Enriquecimento Funcional e de Caminhos (GO, KEGG e GSEA)

O protocolo de anotação funcional mapeava os DEGs para sistemas biológicos mais amplos. A análise GO identificou enriquecimento de termos relacionados à transdução de sinais mediada por pequenas GTPase, transporte de íons metálicos e montagem de cromatina (Figura 4A–C). O mapeamento da via KEGG identificou associações com interações entre receptores ECM e citocinas-citocinas (Figura 4D). A GSEA mostrou enriquecimento dos processos biossintéticos de RNA no grupo recaído e enriquecimento das vias do metabolismo energético no grupo recém-diagnosticado (Figura 5A). Esses resultados de enriquecimento fornecem um roteiro descritivo dos conjuntos gênicos alterados e devem ser interpretados como associações geradoras de hipóteses, e não como fatores comprovados de recaída.

Construção de Rede de Interação Proteína-Proteína (PPI)

A rede STRING inicial continha 56 nós e 193 interações. Após a remoção de nós desconectados ou órfãos, a subrede Cytoscape exibida continha 42 nós e 136 interações (Figura 5B). A análise modular de rede priorizou TP53, CCL2, CXCL8 e IL6 como centros matemáticos centrais com o maior número de interações. Como a rede PPI depende de pontuações de interação previstas pelo banco de dados (por exemplo, pontuação ATF3: 0,982), a identificação do hub deve ser interpretada como priorização de alvos para estudos empíricos futuros, em vez de evidência direta de evasão por apoptose mediada por p53 ou outros mecanismos de resistência.

Os dados brutos de sequenciamento de RNA gerados neste protocolo foram depositados no repositório Figshare e são publicamente acessíveis via o seguinte DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30655814. Os dados processados e os arquivos de análise associados estão incluídos no artigo e em seus materiais suplementares. Parâmetros representativos de linha de comando e configurações de análise usados para reproduzir o fluxo de trabalho computacional são fornecidos como Arquivo Suplementar 1. Todos os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis sem restrições.

ID do paciente	Idade (Anos)	Sexo	Mutações Moleculares	Sobrevivência/Acompanhamento (Meses)	Status Clínico
R_AML_1	70	Masculino	FLT3-ITD (+)	22	Falecido
R_AML_2	29	Feminino	NPM1 (+)	11	Vivo
R_AML_3	40	Masculino	CEBPA (+)	17	Vivo
R_AML_4	55	Feminino	Triplo Negativo*	24	Falecido

Tabela 1: Características Demográficas e Clínicas dos Pacientes no Grupo LMA Recaída (R_AML). A Tabela 1 resume as características demográficas e clínicas da coorte de LMA recaída usada na análise representativa, incluindo características clínicas em nível de paciente relevantes para a interpretação do fluxo de trabalho transcriptômico.

Exemplo	Biblioteca	Raw_reads	Raw_bases	Clean_reads	Clean_bases	Error_rate	Q20	Q30	GC_pct
AML_1	FRAS25 0244891-1r	48705066	7,31G	47807532	7,17G	0.01	99.35	97.48	47.48
AML_2	FRAS25 0244896-1r	42969940	6,45G	42237962	6,34G	0.01	99.35	97.44	46.74
AML_3	FRAS2502 44906-1R	48738386	7,31G	47744462	7,16G	0.01	99.36	97.48	47.28
AML_4	FRAS250 244915-1R	48723650	7,31G	47688240	7,15G	0.01	99.29	97.26	47.45
AML_5	FRAS2502 44920-1R	49508198	7,43G	47740308	7,16G	0.01	99.37	97.53	47.73
R_AML_1	FRAS2502 44892-1R	47879408	7,18G	46671584	7.0G	0.01	99.39	97.49	47.63
R_AML_2	FRAS2502 70005-1R	47657378	7,15G	46957882	7.04G	0.01	99.39	97.49	50.5
R_AML_3	FRAS250 405722-1R	58754766	8,81G	56867112	8,53G	0.01	99.38	97.42	46.52
R_AML_4	FRAS2502 44902-1R	48491122	7,27G	47469334	7.12G	0.01	99.23	97.21	46.43

Tabela 2: Resumo da qualidade dos dados. A Tabela 2 relata métricas de qualidade de sequenciamento para cada amostra, incluindo rendimento de leitura, qualidade base, conteúdo de GC e informações de controle de qualidade relacionadas ao mapeamento usadas para determinar se as amostras eram adequadas para análise posterior.

Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo. O fluxo de trabalho resume as principais etapas experimentais e computacionais, incluindo coleta de amostras clínicas, controle de qualidade de RNA, preparação e sequenciamento de bibliotecas, processamento e alinhamento de leituras, quantificação de transcritos, análise diferencial de expressão, enriquecimento GO/KEGG, GSEA e construção de redes PPI. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Análise quantitativa de amostras. (A) A análise de componentes principais (ACP) foi realizada para avaliar diferenças entre grupos e a reprodutibilidade da amostra dentro do grupo. A PCA foi realizada utilizando métodos algébricos lineares baseados em valores normalizados de expressão gênica em todas as amostras. (B, C) Diagramas de Venn mostrando genes detectados entre amostras nos grupos AML e R_AML, respectivamente. Regiões restritas à amostra indicam genes detectados em amostras individuais, enquanto áreas sobrepostas representam genes comumente detectados em duas ou mais amostras. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise diferencial de expressão gênica. (A) Gráfico de barras mostrando o número de genes diferencialmente expressos (DEGs) entre grupos de comparação, identificados por DESeq2 com limiares de P-valor ajustado ≤ 0,05 e |_{log 2}FoldChange| ≥ 1. (B) Gráfico vulcânico dos DEGs. O eixo x representa os valores log₂do FoldChange, e o eixo y representa -log10 (valor P). Linhas azuis tracejadas indicam as linhas de limiar usadas para a seleção do DEG. (C) Mapa de calor de agrupamento hierárquico dos DEGs. O eixo x indica nomes de amostras, e o eixo y mostra valores de expressão normalizados dos DEGs. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Análise de enriquecimento funcional de genes expressos diferencialmente. (A) Terreno do bar de enriquecimento GO. O eixo x representa os termos GO, e o eixo y mostra significância de enriquecimento, expressa como -log10(padj). As cores representam BP (Processo Biológico), CC (Componente Celular) e MF (Função Molecular). (B) Gráfico da bolha de enriquecimento GO. O eixo x representa a razão de DEGs anotados para cada termo GO em relação ao número total de DEGs, e o eixo y indica os termos GO. O tamanho da bolha corresponde ao número de genes anotados, e gradientes de cor representam significância de enriquecimento. (C) Lote do bar de enriquecimento KEGG. O eixo x representa as vias KEGG, e o eixo y denota significado de enriquecimento. (D) Plano da bolha de enriquecimento KEGG. O tamanho da bolha indica o número de genes anotados, e gradientes de cor refletem o significado do enriquecimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Enriquecimento GSEA e análise de interação proteína-proteína (PPI) em rede. (A) Gráfico de barras mostrando escores normalizados de enriquecimento (NES) para conjuntos genéticos significativos selecionados. Valores positivos de NES indicam enriquecimento no grupo R_AML, enquanto valores negativos de NES indicam enriquecimento no grupo recém-diagnosticado com LMA. (B) Rede de interação proteína-proteína (IBP). Cada nó representa uma proteína, e cada aresta denota uma interação entre proteínas conectadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Etapas Críticas do Protocolo

A execução bem-sucedida desse fluxo de trabalho bioinformático depende de várias etapas críticas. Primeiro, o congelamento imediato e a lise correta do aspirado da medula óssea (Passo 1.6) são fundamentais, pois o microambiente da medula óssea é rico em ribonucleases que podem degradar rapidamente a integridade^{transcriptômica 30}. Durante a fase computacional, a configuração correta da fórmula do desenho experimental dentro do pacote DESeq2 (Passo 6.3) é fundamental para uma expressão diferencial precisa, especialmente quando o estado clínico (recém-diagnosticado versus recaída) é contrastado enquanto as variáveis de confusão potenciais são consideradas. Por fim, aplicar limiares rigorosos de taxa de falsa descoberta (FDR) durante a Análise de Enriquecimento de Conjuntos Genéticos (GSEA) (Passo 9.6) é um ponto crítico de verificação estatística para evitar a superinterpretação de redes funcionais falsamente positivas.

Modificações e Solução de Problemas

Um desafio comum nesse método é a presença de efeitos em lote, que frequentemente ocorrem quando amostras clínicas são coletadas e sequenciadas em períodos de tempo estendidos. Variáveis de lote devem ser definidas antes da análise, incluindo data de coleta da amostra, data de extração de RNA, lote de preparação de biblioteca, faixa de sequenciamento e execução de sequenciamento. Se a análise de PCA ou correlação amostral revelar agrupamento baseado na data de sequenciamento ou em outra variável técnica, em vez do fenótipo clínico, os usuários devem modificar o protocolo incluindo a variável em lote na fórmula de design de expressão diferencial quando estatisticamente viável ou aplicando algoritmos de correção por lote, como ComBat ou SVA, antes da visualização³¹. Se aplicar esse protocolo ao sangue total em vez de aspirados de medula óssea, uma modificação essencial é a inclusão de uma etapa de depleção do mRNA da globina durante a preparação da biblioteca para evitar que transcritos de globina altamente abundantes monopolizem a profundidade de leitura sequenciada. As versões de software e os principais parâmetros para o fluxo de trabalho representativo foram complementados da seguinte forma: fastp v0.23.2, HISAT2 v2.0.5, StringTie v1.3.3b, featureCounts v1.5.0-p3, R v3.5.0, DESeq2 v1.20.0, clusterProfiler v3.8.1, org. Hs.eg.db v3.6.0, sequenciamento de extremidade pareada a 150 pb, GSEA v4.2.3 com 1.000 permutações de conjunto de genes, MSigDB v7.5.1, STRING v11.5 com interações de alta confiança e Cytoscape v3.9.1. Parâmetros representativos de linha de comando e configurações de análise são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Limitações do Método

Embora abrangente, esse protocolo possui limitações metodológicas inerentes. Primeiro, utiliza sequenciamento de RNA a granel, que captura o perfil transcriptômico médio de toda a medula óssea aspirada e carece de resolução espacial de célula única. Portanto, o fluxo de trabalho não pode determinar se uma assinatura associada à recaída com aumento se origina de células-tronco de leucemia, células estromalas, células imunes ou alterações na composição celular³². Segundo, o conjunto de dados representativo é pequeno (n = 9) e não pareado, o que limita a robustez estatística e impede inferências causal definitivas. Terceiro, o fluxo de trabalho é puramente in silico. Ele gera hubs regulatórios candidatos e vias de sinalização, mas não pode validar independentemente sua necessidade funcional na quimiorresistência sem validação experimental ortogonal in vitro ou in vivo.

Estudos genômicos recentes de células únicas e únicas ampliaram o arcabouço de referência da LMA ao resolver heterogeneidade celular-estado, arquitetura clonal e evolução associada à terapia em resolução^{mais alta 33,34,35,36}. Essas abordagens são complementares ao fluxo de trabalho de RNA-seq em massa descrito aqui: o sequenciamento em massa fornece uma estratégia prática e econômica para assinaturas transcriptômicas em nível de coorte, enquanto métodos de célula única e multiômicos podem ser usados em estudos de acompanhamento para atribuir sinais candidatos a populações celulares malignas ou microambientais específicas.

Significado em relação aos métodos existentes

Apesar dessas limitações, esse pipeline transcriptômico oferece vantagens em relação a técnicas alternativas de diagnóstico e análise. Avaliações clínicas tradicionais de recaída em LMA frequentemente dependem de painéis multiplex qPCR direcionados ou citometria de fluxo padrão. Embora úteis para diagnósticos rápidos, esses métodos direcionados são limitados por sondas pré-definidas e só podem avaliar marcadores de resistência^{conhecidos 19}. Ao utilizar sequenciamento do transcriptoma genômico imparcial, combinado com análise em rede, esse protocolo pode indicar transcritos novos e associações sistêmicas que os métodos direcionados existentes podem ignorar.

Importância e Aplicações Potenciais

A metodologia descrita neste protocolo é relevante para a hematologia translacional e a medicina personalizada porque pode priorizar assinaturas transcriptômicas associadas à recaída para estudos adicionais. Uma possível aplicação a jusante é a nomeação de antígenos superficiais ou vias de evasão imunária que surgem durante a recaída. Tais candidatos podem informar o desenho de futuros estudos de validação e, se confirmados experimentalmente, podem contribuir para o desenvolvimento de imunoterapias de próxima geração, incluindo estratégias de células CAR-T ou^{CAR-NK 37}. Essas aplicações translacionais devem ser consideradas geradoras de hipóteses, e não conclusões estabelecidas a partir do presente conjunto de dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	RRID:SCR_019389	G2939BA
AMPure XP system	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	RRID:SCR_008452	A63881
cBot Cluster Generation System	Illumina, San Diego, CA, USA	-	SY-301-2002 ou ID do sistema específico da instituição
clusterProfiler (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	v3.8.1
Cytoscape (Software)	Cytoscape Consortium	RRID:SCR_003032	v3.9.1
DESeq2 (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	v1.20.0
DNA Polymerase I	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0209L
dNTP Solution Mix	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	N0447L
edgeR (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_012802	v3.22.5
fastp (Software)	OpenGene	RRID:SCR_016962	v0.23.2
featureCounts / Subread (Software)	The Walter and Eliza Hall Institute	RRID:SCR_012919	featureCounts v1.5.0-p3
GRCh38 reference genome	Genome Reference Consortium / Ensembl	-	GRCh38; Ensembl release 109
GSEA software	Broad Institute	RRID:SCR_003199	v4.2.3
HISAT2 (Software)	Johns Hopkins University	RRID:SCR_015530	v2.0.5
M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0253L
MSigDB gene sets	Broad Institute	RRID:SCR_016863	v7.5.1
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7760L/E7765L ou kit específico do laboratório
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7770L
NovaSeq sequencing platform	Illumina, San Diego, CA, USA	RRID:SCR_016387	NovaSeq system; ID do instrumento do provedor de serviços
org.Hs.eg.db (Annotation package)	Bioconductor	-	v3.6.0
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:AB_2756816	F530L
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:SCR_018095	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	Q32851
R software	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	v3.5.0
Random Hexamer Primer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	SO142
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	-	5067-1511
RNase H	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0297L
RNA-seq Library Prep Kit / Sequencing Service	Novogene, Beijing, China	-	Project No. X101SC25054246-Z01-J003
STRING database	STRING Consortium	RRID:SCR_005223	v11.5
StringTie (Software)	Johns Hopkins University / Center for Computational Biology	RRID:SCR_016323	v1.3.3b
TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS	Illumina, San Diego, CA, USA	-	PE-401-3001