Modulação farmacológica do eixo de tensão do retículo endoplasmático ALDH2-SIRT1 em degeneração retiniana induzida por MNU em camundongos C57BL/6: um estudo in vivo

Resumo

O estudo envolveu a administração de metil-nitrosoria em camundongos C57BL/6 para induzir danos na retina, seguida do tratamento com ativadores e inibidores de ALDH2 juntamente com SIRT1 e moduladores de estresse do retículo endoplasmático (ERS). O protocolo tinha como objetivo investigar os efeitos protetores desses tratamentos sobre a degeneração retiniana e sua influência no metabolismo dos aldeídos.

Resumo

Este estudo investigou os efeitos protetores da ativação da aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) (via Alda-1), inibição de ALDH2 (via Daidzin) e a modulação da sirtuína 1 (SIRT1) e do estresse do retículo endoplasmático (ERS) sobre danos retinianos induzidos por metil-nitrosoria (MNU) em camundongos C57BL/6. Setenta e dois camundongos foram aleatoriamente distribuídos em oito grupos, incluindo um grupo controle, um grupo com MNU sozinho e vários grupos combinados de tratamento. Os camundongos foram administrados com injeções intraperitoneais de agonistas e inibidores que visavam o eixo ALDH2-SIRT1-ERS, respectivamente. Peso corporal, espessura da camada retiniana e biomarcadores do metabolismo dos aldeídos foram avaliados no segundo e quarto dias após o tratamento. A administração de MNU induziu degeneração retiniana, resultando em perda significativa de peso corporal em todos os grupos, exceto no controle. O tratamento com Alda-1 atenuou danos na retina, enquanto Daidzin os agravou. A inibição farmacológica do SIRT1 (via EX-527) diminuiu os efeitos protetores do Alda-1, e a indução por ERS (via TUN) quase aboliu seus benefícios. Por outro lado, a ativação do SIRT1 (via SRT1720) mitigou os efeitos adversos do Daidzin, enquanto a inibição do ERS (via 4-PBA) aliviou parcialmente o impacto do Daidzin. Além disso, a MNU aumentou os níveis de marcadores do metabolismo dos aldeídos (malondialdeído [MDA] e 4-hidroxi-2-nonenal [4-HNE]), com Alda-1 reduzindo e Daidzin elevando esses níveis. Além disso, a modulação farmacológica das vias SIRT1/ERS interveio nos efeitos regulatórios do Alda-1 e Daidzin sobre o metabolismo do aldeído. No geral, a ativação do ALDH2 protegeu a estrutura retiniana e regulou o metabolismo do aldeído, destacando o papel crítico do eixo de sinalização ALDH2-SIRT1/ERS na mitigação da degeneração retiniana.

Introdução

A degeneração retiniana, uma das principais causas de cegueira no mundo todo, inclui condições como retinite pigmentar (RP), degenerescência macular relacionada à idade (DMRI) e retinopatia diabética (DR), que afetam coletivamente milhões de pessoas e impõem importantes encargos ^{socioeconômicos 1,2,3}. No entanto, atualmente há uma falta de terapias farmacológicas altamente eficazes para interromper a progressão dessas doenças retinianas cegantes na prática clínica. A patogênese da degeneração retiniana é multifatorial, envolvendo estresse oxidativo, inflamação crônica e estresse do retículo endoplasmático (SER), que prejudica a homeostase das células retinianas. Esses fatores de estresse são frequentemente desencadeados por desregulação metabólica interna (por exemplo, disfunção mitocondrial), levando em última instância à apoptose e danos irreversíveis à^{retina 4}. A metil-nitrosoria (MNU), um potente agente alquilante do DNA, surgiu como um indutor químico amplamente utilizado para modelar a degeneração^{retiniana 5}. O modelo de doença retiniana induzida pela MNU serve como uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos da doença e avaliar potenciais intervenções terapêuticas. Mecanisticamente, a MNU induz estresse oxidativo ao gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) e perturbar o equilíbrio redox, danificando assim membranas e organelos dos fotorreceptores. Isso também pode afetar o metabolismo dos aldeídos, prejudicando a desintoxicação da peroxidação lipídica. O acúmulo subsequente de aldeídos tóxicos pode agravar o dano oxidativo, amplificando a apoptose^{dos fotorreceptores 6}.

A aldeído desidrogenase 2 (ALDH2), uma enzima mitocondrial dependente de ^NAD+, desempenha um papel fundamental na desintoxicação de aldeídos tóxicos como 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) e malondialdeído (MDA), convertendo-os em ácidos carboxílicos menos reativos, prevenindo assim danos^{oxidativos 7}. A atividade robusta do ALDH2 é crucial para manter a homeostase redox, e a função comprometida do ALDH2 tem sido associada ao envelhecimento acelerado e a patologias^{neurodegenerativas 8}. A ativação farmacológica do ALDH2, notadamente por meio do agonista de moléculas pequenas Alda-1, demonstrou exercer efeitos citoprotetores em vários^{modelos 9,10}. A sirtuina 1 (SIRT1), uma deacetilase dependente de nicotinamida e adenina + (NAD+), regula as respostas ao estresse e o metabolismo energético modulando fatores de transcrição, incluindo p53 e o fator nuclear kappa B (NF-κB)¹¹. A ativação do SIRT1 tem mostrado potencial na promoção da função mitocondrial e da sobrevivência celular, com estudos relacionando sua regulação positiva à redução do dano oxidativo e da inflamação na degeneração^{retiniana 12}. O estresse do retículo endoplasmático (ERS), desencadeado pelo acúmulo de proteínas mal dobradas, ativa a resposta proteica não dobrada (UPR), que pode se tornar uma cascata pró-apoptótica sob estresse crônico. O ERS tem sido implicado na degeneração retiniana, contribuindo para a apoptose do^{fotorreceptor 13}. Apesar desses achados, a interação específica entre ALDH2, SIRT1 e ERS no contexto do modelo de degeneração retiniana induzida por MNU continua pouco compreendida. Além disso, os papéis coordenados dessas vias interconectadas exigem uma investigação sistemática adicional.

Portanto, o estudo atual teve como objetivo investigar os efeitos dos componentes-chave do eixo ALDH2-SIRT1-ERS — ALDH2 (via Alda-1 ou Daidzin), SIRT1 (via SRT1720 ou EX527) e ERS (via 4-PBA ou TUN) — sobre danos retinianos induzidos por MNU em camundongos C57BL/6. Utilizando análises histopatológicas e bioquímicas, examinamos como o direcionamento desse eixo afetava a sobrevivência dos fotorreceptores e o metabolismo dos aldeídos. Hipotetizamos que a ativação coordenada do ALDH2, o aprimoramento do SIRT1 e a supressão do ERS mitigariam sinergicamente a degeneração retiniana induzida pelo MNU, fornecendo assim uma justificativa para o alvo desse eixo em doenças degenerativas retinianas.

Protocolo

Declaração ética
Todos os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Experimental de Animais do Fuzong Clinical Medical College da Universidade Médica de Fujian e realizados em estrita conformidade com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual.

Animais e alocação de grupos
Um total de 72 machos C57BL/6 camundongos (8–10 semanas de idade, peso corporal de 20–25 g) foram obtidos do fornecedor certificado, atendendo aos padrões nacionais para criação de animais de laboratório. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente sob condições ambientais padronizadas, incluindo um ciclo de 12 horas luz/escuro, temperatura controlada (22 ± 2 °C) e umidade relativa (50% ± 10%), com acesso ad libitum a comida e água. Para investigar os efeitos moduladores das vias ALDH2, SIRT1 e ERS no dano retiniano induzido pelo MNU, os camundongos foram alocados aleatoriamente em oito grupos experimentais (n = 9 por grupo; n = 5 para o grupo do segundo dia; n = 4 para o grupo do quarto dia) usando uma sequência de randomização gerada por computador para minimizar o viés de seleção. O resumo gráfico do estudo foi mostrado na Figura 1.

Preparação e regime de tratamento de reagentes
Os reagentes experimentais usados neste estudo foram listados na Tabela de Materiais, com informações detalhadas sobre preparação e dosagem conforme segue. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg de MNU foram dissolvidos em 2 mL de soro fisiológico normal para preparar uma solução de 50 mg/mL. Em seguida, 1,4 mL dessa solução foi diluído com 5,6 mL de soro fisiológico normal até uma concentração final de 10 mg/mL para administração animal. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg de pó de Alda-1 foram dissolvidos em 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar uma solução de 50 mg/mL, que foi diluída com 24 mL de soro fisiológico normal até uma concentração final de 2 mg/mL. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg de pó de Daidzin foram dissolvidos em 1 mL de DMSO para preparar uma solução de 50 mg/mL, que foi então diluída com 24 mL de soro fisiológico normal até uma concentração final de 2 mg/mL. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg de pó de EX-527 foram dissolvidos em 0,1 mL de DMSO para preparar uma solução de 50 mg/mL, que foi diluída com 2,4 mL de soro fisiológico normal até uma concentração final de 2 mg/mL. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg de SRT1720 pó foram dissolvidos em 0,1 mL de DMSO e bem misturados. Em seguida, 400 μL de PEG300, 50 μL de Tween-80 e 450 μL de soro fisiológico normal foram adicionados para preparar uma solução de trabalho de 2 mg/mL. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg de pó de TUN foram dissolvidos em 0,1 mL de DMSO para preparar uma solução de 50 mg/mL, que foi então diluída com 2,4 mL de soro fisiológico normal até uma concentração final de 2 mg/mL. (7) 4-Fenilbutirato (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg de pó de 4-PBA foram dissolvidos em 1 mL de soro fisiológico normal para preparar uma solução de 2 mg/mL. Todos os volumes de administração acima foram de 5 × mililitros M (onde M = peso corporal animal em kg). Depois disso, os camundongos foram divididos em oito grupos com os seguintes protocolos de tratamento:

Grupo controle: Uma única injeção intraperitoneal de soro fisiológico normal.
Grupo MNU: Uma única injeção intraperitoneal de MNU.
Grupo MNU + Alda-1: Injeção intraperitoneal de Alda-1, seguida por uma única administração de MNU 2 horas depois. Alda-1 foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.
Grupo MNU + Daidzin: Injeção intraperitoneal de Daidzin, seguida por uma única aplicação de injeção de MNU 2 horas depois. Daidzin foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.
Grupo MNU + Alda-1 + EX-527: Injeção intraperitoneal de Alda-1, seguida pela injeção de EX-527 1 hora depois, e injeção de MNU 1 hora depois (administração única). Alda-1 foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.
MNU + Alda-1 + grupo TUN: Injeção intraperitoneal de Alda-1, seguida por injeção TUN 1 hora depois, e injeção MNU 1 hora depois. Alda-1 foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.
MNU + Daidzin + grupo SRT1720: Injeção intraperitoneal de Daidzin, seguida por SRT1720 injeção 1 hora depois e injeção MNU 1 hora depois. Daidzin foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.
Grupo MNU + Daidzin + 4-PBA: Injeção intraperitoneal de Daidzin, seguida pela injeção de 4-PBA 1 hora depois, e injeção de MNU 1 hora depois. Daidzin foi então administrado intraperitonealmente uma vez ao dia.

Monitoramento do peso corporal
A toxicidade sistêmica e os efeitos fisiológicos relacionados ao tratamento foram monitorados registrando o peso corporal de cada camundongo diariamente por quatro dias consecutivos após a administração do MNU. Os pesos foram medidos usando uma balança digital de precisão com precisão de ±0,1 g, e os dados foram documentados para acompanhar tendências de perda ou ganho de peso entre grupos, que serviram como indicadores indiretos de tolerância ao tratamento e estresse sistêmico.

Exame de histopatologia retiniana
Nos períodos do segundo e quarto dias após o experimento, camundongos foram eutanasiados por luxação cervical após anestesia com injeção intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital de sódio em uma dose de 50–60 mg/kg de peso corporal, seguindo rigorosamente as diretrizes institucionais de eutanásia. Os olhos, especificamente o esquerdo, foram imediatamente enucleados. Antes da enucleação, foi feita uma pequena incisão no limbo nasal para marcar a orientação. Os globos foram então imersos em 4% de paraformaldeído (PFA) em soro tampão fosfatado (PBS, pH 7,4) por 24 horas a 4 °C para fixação. Os olhos fixos foram então desidratados por uma série graduada de etanol (70%, 80%, 95% e 100%), eliminados em xileno e incorporados em blocos de parafina para processamento histológico. Durante a incorporação, a orientação foi padronizada posicionando o lado nasal marcado para baixo.

Seções seriadas (5 μm de espessura) foram preparadas usando um micrótomo rotativo através da cabeça do nervo óptico (ONH) para garantir amostragem representativa da região central da retina. Especificamente, as seções foram cortadas do lado superior em direção ao ponto nasal marcado, garantindo que todas as seções passassem pelo ONH. As seções eram então montadas em trilhas de vidro carregadas positivamente. A coloração com hematoxilina e eosina (HE) foi realizada de acordo com protocolos padrão. A morfologia retiniana foi avaliada por microscopia óptica com ampliação de 400×. As medições foram feitas sistematicamente da retina temporal a distâncias predeterminadas do ONH: 200, 400, 600, 800, 1000 e 1200 μm. Em cada local, foram medidas a espessura total da retina, o comprimento dos segmentos interno e externo (IS/OS), a espessura da camada nuclear externa (ONL), a espessura da camada plexiforme externa (OPL) e a camada nuclear interna (INL).

Para garantir objetividade e minimizar o viés de medição, foi implementado um rigoroso protocolo de controle de qualidade. Especificamente, cada um dos oito grupos experimentais foi subdividido em cinco ou quatro subgrupos (por exemplo, Subgrupos 1, 2, 3, 4, 5). Cinco ou quatro observadores independentes, cegos para atribuições de grupo, foram designados para medir o mesmo subgrupo correspondente em todos os grupos experimentais (por exemplo, o Observador A sempre mediu o Subgrupo 1 de cada grupo). Em cada ponto de medição, três leituras foram feitas dentro de uma faixa de ~5 μm (por exemplo, a 200 μm, 195 μm e 205 μm) e médias para minimizar erros técnicos. Medições quantitativas foram realizadas usando o software ImageJ (versão 1.54g), e o valor médio da espessura para cada ponto foi calculado para garantir a reprodutibilidade.

Marcadores do metabolismo dos aldeídos
Para avaliar o estresse oxidativo e o metabolismo dos aldeídos, amostras séricas foram analisadas para níveis de MDA e 4-HNE, que são biomarcadores-chave da peroxidação lipídica e do estresse aldeído. Especificamente, todos os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal (p) de pentobarbital de sódio em uma dose de 50–60 mg/kg de peso corporal. Após a anestesia profunda dos camundongos, a eutanásia foi realizada por luxação cervical. Imediatamente após a eutanásia, os globos oculares foram enucleados e o sangue retrobulbar foi rapidamente coletado. As amostras foram deixadas coagular em temperatura ambiente por 30 minutos, seguidas por centrifugação a 3.000 × g por 10 minutos. A fração sérica foi cuidadosamente transferida para tubos de microcentrífuga sem enzimas e armazenada a -80 °C até análise subsequente. Os níveis séricos de MDA foram medidos usando kits comerciais de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) seguindo os protocolos do fabricante. Em resumo, padrões e amostras foram adicionados às microplacas pré-revestidas, incubados com anticorpos primários específicos, lavados para remover materiais não ligados e reagidos com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP). O substrato de tetrametilbenzidina (TMB) foi então adicionado, e a reação foi terminada com ácido sulfúrico. Os valores de densidade óptica (OD) foram lidos a 450 nm usando um leitor de microplacas, e as concentrações de MDA/4-HNE foram determinadas comparando os valores de OD com curvas padrão geradas usando concentrações conhecidas dos analitos.

Análise estatística
Todos os dados foram apresentados como erro médio ± padrão (SE). Dado o pequeno tamanho da amostra (n = 5 para o segundo grupo do dia; n = 4 para o quarto dia), foram empregados os métodos estatísticos do teste Bootstrap. Especificamente, o método de reamostragem Bootstrap (1.000 iterações com substituição) foi usado para estimar intervalos de confiança (IC) de 95% para médias de grupos e para comparar diferenças entre grupos. Para cada desfecho (por exemplo, peso, espessura da retina, níveis de MDA/4-HNE), amostras Bootstrap foram retiradas do conjunto de dados original, e a média foi calculada para cada reamostra. O IC de 95% foi derivado dos percentis 2,5^e 97,5 da distribuição bootstrap. A importância foi avaliada indiretamente pela seguinte abordagem, examinando o intervalo de confiança. Se o IC dos resultados do Bootstrap não incluía zero, isso normalmente indicava que a diferença era significativa (assumindo uma comparação de médias entre dois ou mais grupos). As figuras eram geradas usando o software Graphpad (versão 5.01).

Resultados

Mudanças no peso corporal
Antes do experimento, não havia diferenças significativas no peso corporal entre os grupos. No segundo dia após o experimento, exceto no grupo de controle, que mostrou aumento no peso corporal de 17,0 ± 0,5 g para 17,4 ± 0,4 g, o peso corporal dos camundongos em todos os outros grupos diminuiu significativamente. Especificamente, o grupo MNU diminuiu de 17,4 ± 0,3 g para 16,2 ± 0,2 g, o grupo MNU + Alda-1 de 17,3 ± 0,3 g para 16,7 ± 0,4 g, o ...

Discussão

Estudos anteriores sugeriram que agonistas do ALDH2 poderiam oferecer efeitos protetores contra a degeneração^{retiniana 14} induzida pelo MNU. No entanto, os efeitos de intervenção de seu inibidor, juntamente com possíveis vias a jusante como SIRT1 e ERS, não foram explorados em detalhes. Há estudos indicando o envolvimento de SIRT1 e ERS em modelos de degeneração retiniana, incluindo degeneração retiniana induzida pela luz e camundongos geneticamente modificados co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4HNE Kit	Elabscience,China	E-EL-0128	Para medição de níveis de 4HNE no soro
Ácido 4-fenilbutírico (4-PBA)	MCE, US	HY-A0281	Reagente para inibição do ERS
Alda-1	MCE, US	HY-18936	Ativador ALDH2 para pesquisa
Daidzin	MCE, US	HY-N0018	Inibidor ALDH2 para pesquisa
Sódio de Fluorescein	Guangzhou	N/A	Usado para  obtido usando um sistema de angiografia com fluoresceína. As imagens angiográficas foram analisadas quanto à presença de qualquer fuga, áreas não perfundidas ou alterações na morfologia dos vasos retinianos.
Software ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde, EUA	Versão 1.53t
Kit MDA	Beyotime, China	S0131S	Para medição de níveis de MDA no soro
N-Nitroso-N-metilureia (MNU)	MCE, US	HY-34758	Agente alquilante de DNA para indução de degeneração retiniana
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich, US	30525-89-4	Usado para seções de tecido retiniano
Balança digital de precisão	Balança eletrônica, China	SF-400	CAPACIDADE: 5000 g ´ 1 g/177ozX0.10z,usado para registrar o peso corporal de cada rato
Prism	GraphPad	Versão 5.01	Software de análise estatística
Microtomo rotativo	LEICA, Alemanha	RM2016	Usado para preparação de seções retinianas
Selisistat (EX-527)	MCE, US	HY-15452	Inibidor SIRT1 para pesquisa
Pentobarbital de sódio	Sigma-Aldrich, US	1.93248	Usado para anestesia para pesquisas posteriores por injeção intraperitoneal (IP)
SRT1720	MCE, US	HY-10532	Ativador SIRT1 para pesquisa
Sumianxin	Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co	N/A	Usado para anestesia para pesquisas posteriores por injeção intraperitoneal (IP)
Tunicamicina (TUN)	MCE, US	HY-A0098	Reagente para indução de ERS