Artigo de revisão

Organoides cerebrais como plataformas emergentes para modelagem de infecções no SNC: neuropatogênese, descoberta terapêutica e administração de medicamentos

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DOI:

10.3791/70757

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7 de agosto de 2026

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1Laboratory of Molecular Virology, George Mason University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esta revisão examina organoides cerebrais como plataformas para modelar infecções virais neurotrópicas selecionadas e destaca suas aplicações na patogênese viral, descoberta de antivirais, respostas imunes inatas e administração de fármacos direcionados ao sistema nervoso central (SNC).

Resumo

Vírus neurotrópicos continuam sendo um desafio persistente à saúde global, e os mecanismos pelos quais eles danificam o cérebro humano ainda não são totalmente compreendidos. Modelos animais são frequentemente limitados por aspectos específicos da biologia do SNC para humanos, enquanto culturas celulares bidimensionais (2D) não conseguem recapitular as complexas interações celulares tridimensionais (3D) que ocorrem durante a infecção viral do cérebro. Na última década, organoides cerebrais derivados de células-tronco humanas surgiram como modelos fisiologicamente relevantes que abordam essas limitações. Essas culturas 3D se auto-montam em estruturas contendo neurônios, astrócitos e células progenitoras dispostas em padrões que se assemelham ao desenvolvimento cerebral inicial. Esta revisão examina a aplicação de organoides cerebrais no estudo de infecções causadas pelo vírus Zika (ZIKV), coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), vírus do herpes simples (HSV) e vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Os estudos foram selecionados no PubMed e selecionados com base em sua relevância para modelagem de infecção pelo SNC baseada em organoides, triagem de medicamentos antivirais, administração de medicamentos direcionados ao SNC e neuroinflamação. A triagem antiviral baseada em organoides identificou compostos promissores em bibliotecas que contêm mais de 1.000 candidatos. Estratégias de liberação de fármacos também são discutidas, com ênfase especial em nanopartículas, portadores à base de polímeros e vesículas extracelulares (EVs) avaliadas em modelos organoides e esferoides quanto à sua capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (BBB) e entregar carga terapêutica às células neurais. Também são examinados os papéis dos padrões moleculares associados a danos e patógenos (AMPs e PAMPs) na neuroinflamação, evasão do complemento e danos crônicos pós-infecção, incluindo COVID longa. São discutidas as limitações atuais, incluindo a falta de vasculatura funcional, componentes incompletos da BBB e desafios de reprodutibilidade. Apesar dessas limitações, os organoides do SNC fazem a ponte entre a pesquisa básica e a aplicação clínica, avançando no desenvolvimento de terapias eficazes para infecções virais do cérebro.

Introdução

O sistema nervoso central (SNC) é um sistema complexo composto por regiões funcionais distintas do cérebro e da medula espinhal. Os organoides do SNC, frequentemente chamados de "mini-cérebros", são estruturas multicelulares tridimensionais (3D) que imitam o cérebro humano em desenvolvimento. Eles são gerados principalmente a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), que podem se auto-montar em tecidos que representam diversas regiões cerebrais. Esses mini-cérebros recapitulam os padrões epigenéticos, a estrutura e os marcadores transcricionais do cérebro emdesenvolvimento 1,2,3.

A geração de organoides cerebrais utilizando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas do paciente foi desenvolvida pela primeira vez em 2013. Antes dessa descoberta, o acesso ao tecido cerebral humano era limitado devido às questões éticas associadas à realização de estudos experimentais, especialmente aqueles envolvendo tecido cerebral fetal ou in utero 2. O desenvolvimento de organoides cerebrais demonstrou a capacidade de imitar o neurodesenvolvimento humano, incluindo a formação de regiões cerebrais distintas, como o córtex cerebral. Lancaster et al. forneceram as primeiras evidências experimentais de que células-tronco podem formar estruturas neurais complexas in vitro, oferecendo um modelo que reflete com mais precisão a fisiologia humana do que culturas celulares bidimensionais (2D)convencionais 5. Importante destacar que certas condições do neurodesenvolvimento humano, como a microcefalia, têm se mostrado difíceis de replicar em modelos de roedores, enfatizando ainda mais a necessidade de sistemas derivados doser humano 6.

Organoides do SNC contêm múltiplos tipos celulares que se diferenciam e formam estruturas multicamadas semelhantes ao cérebroem desenvolvimento 7, tornando-os bem adequados para estudos de alta produtividade sobre neurogênese, migração neuronal e anormalidades dodesenvolvimento 8. A geração de organoides do SNC começa com células-tronco pluripotentes (PSCs), que incluem iPSCs e células-tronco embrionárias. Células-tronco embrionárias são expostas a fatores de crescimento e inibidores de sinalização para promover a diferenciação em células neurais e imitar o desenvolvimento embrionárioprecoce 2. Uma vez que as células começam a se agregar, elas passam por auto-organização dentro de um ambiente 3D e frequentemente são incorporadas em uma matriz extracelular para fornecer estabilidade estrutural. Os organoides são então tipicamente mantidos sob condições dinâmicas de cultura, como biorreatores giratórios ou agitação orbital, para melhorar a entrega de nutrientes e oxigênio, e apoiar o crescimentocontínuo 9. Organoides específicos de região do cérebro anterior, mesencéfalo e cérebro posterior também podem ser gerados usando protocolos guiados em biorreatores giratórios miniaturizados, com regiões cerebrais distintas que normalmente surgem ao longo de várias semanas ameses 9, 10 e 11. Os organoides do SNC capturam muitas características estruturais chave do cérebro humano em desenvolvimento, incluindo regiões ventriculares contendo glia radial que apoiam neurônios migratórios e progenitores intermediários que amplificam populaçõesneuronais 12. Os primeiros neurônios formam camadas semelhantes a corticais com redes sinápticas emergentes. Embora os organoides não repliquem totalmente o tamanho ou a organização do cérebro maduro, eles são mais relevantes fisiologicamente do que culturas tradicionais de camada única.

Uma grande vantagem dos organoides do SNC é sua capacidade de modelar o tempo do desenvolvimento. As culturas progridem de semanas para meses e paralelam ao desenvolvimento cerebral fetal humano. Isso permite aos pesquisadores observar processos neurológicos como neurogênese, extensão de axônios e formação precoce de circuitos neurais em tempo real. Organoides também podem ser programados para incluir micróglia, células semelhantes a vasos sanguíneos ou até componentes da barreira hematoencefálica (BBB), como astrócitos, células endoteliais e perícitos. Esses organoides podem apoiar estudos sobre respostas imunes e transporte desubstâncias 13. Além disso, organoides podem ser combinados para criar assembloides, que são sistemas auto-organizáveis que modelam a comunicação entre diferentes regiõescerebrais 14. Com essas capacidades, os organoides do SNC oferecem uma forma direta de investigar como vírus neurotrópicos invadem, se replicam e danificam o cérebro, questões que há muito tempo são difíceis de ser abordadas com modelos convencionais.

Existe um grande número e diversidade de vírus neurotrópicos que podem afetar o cérebro humano, incluindo flavivírus, o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), o vírus do herpes simples (HSV) e o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). O desenvolvimento de terapias antivirais eficazes é crucial, mas continua sendo desafiador devido à complexidade das interações vírus-cérebro. O cérebro é considerado um órgão imuno-privilegiado, apoiado pela BBB, que impede que grandes células e moléculas imunológicas entrem no cérebro pela corrente sanguínea.

Vírus neurotrópicos desenvolveram estratégias diversas para romper essa barreira, incluindo migração transcelular, interrupção de junções apertadas e o mecanismo do "cavalo de Troia", pelo qual células imunes infectadas carregam o vírus através doendotélio 4. Como resultado, a vigilância imunal no cérebro é restringida, dificultando a eliminação viral. Além disso, os componentes celulares da BBB, incluindo células endoteliais, astrócitos e perícitos, expressam receptores de reconhecimento de padrões que detectam padrões moleculares associados a patógenos virais (PAMPs) e promovem respostas imunes inatas, embora a sinalização pró-inflamatória possa, paradoxalmente, piorar a perturbação daBBB 15. Além disso, o acesso limitado ao tecido cerebral humano dificulta estudos sobre interações virais com células neurais e a entrega de agentes antivirais potentes ao SNC. Esses desafios combinados dificultam a descoberta de novos agentes antivirais para tratar infecções virais em todas as fases de desenvolvimento e ao longo da vida, tornando essencial compreender melhor como os vírus interagem com o cérebro e desenvolver novas estratégias terapêuticas para combater essasinfecções 16. No geral, esta revisão enfatiza a utilidade dos organoides do SNC para o estudo de infecções virais neurotrópicas, mecanismos de neuroinflamação e descoberta de medicamentos antivirais. A Figura 1 apresenta uma visão geral das principais aplicações dos organoides cerebrais na modelagem de infecções virais neurotrópicas, na investigação das interações hospedeiro-patógeno e no avanço do desenvolvimento terapêutico antiviral.

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Figura 1: Organoides cerebrais como plataformas relevantes para humanos para modelar infecções virais neurotrópicas do SNC. A figura oferece uma visão geral dos principais temas abordados, com foco em organoides cerebrais tridimensionais (3D) como modelos experimentais. Vírus neurotrópicos discutidos nesta revisão incluem HIV-1, HSV-1/2, SARS-CoV-2 e ZIKV. Diferentes modelos de organoides cerebrais possibilitam estudos de patogênese viral, interações hospedeiro-patógeno, disfunção da barreira hematoencefálica (BBB) e respostas neuroinflamatórias envolvendo neurônios, astrócitos, micróglias e células endoteliais cerebrais. Organoides cerebrais fornecem plataformas fisiologicamente relevantes para triagem e avaliação de medicamentos antivirais e avaliação de terapias antivirais. Criado no BioRender. Kashanchi, F. (2026) https://BioRender.com/y7eenju Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Revisão e perspetiva

Descoberta terapêutica em organoides cerebrais infectados por vírus

Triagem antiviral

Há uma falta de terapias aprovadas para muitas infecções virais neurotrópicas, limitando as opções de tratamento além do cuidado de suporte. Organoides cerebrais são uma ferramenta valiosa para descobrir novos compostos antivirais, possibilitando a triagem de drogas em um ambiente 3D fisiologicamente relevante que se assemelha ao tecido cerebral humano. Em um estudo inicial, foi realizada uma triagem química de alto teor de 1.120 medicamentos aprovados pela FDA e candidatos a medicamentos contra ZIKV em organoides cerebrais semelhantes a fetais. A atividade antiviral foi avaliada com base na proliferação celular e na supressão da infecção por ZIKV. De todos os compostos testados, nove mostraram potencial, com dois compostos — hippeastrina hidrobrometo (HH) e amodiaquina diidrocloreto diidratado (AQ) — destacando-se por seus fortes efeitos antivirais, reduzindo significativamente a infecção ao suprimir a produção de RNAviral 17.

Vários estudos subsequentes exploraram compostos que visam diferentes estágios do ciclo de vida viral. Em um estudo de Watanabe et al., o 25-hidroxicolesterol (25HC), um composto que bloqueia a entrada viral ao inibir a fusão de membrana, reduziu os níveis de mRNA do ZIKV em organoides corticais em ~74% e diminuiu as células positivas para ZIKV em ~72%. Além disso, o mesmo estudo avaliou compostos antivirais direcionados ao receptor AXL expressos em células progenitoras neurais. Um inibidor de pequenas moléculas do domínio tirosina quinase AXL, R428, produziu uma redução modesta nos níveis de mRNA do ZIKV (~41%). No entanto, o tratamento com um anticorpo anti-AXL não reduziu significativamente os níveis18 de mRNA do ZIKV. Por fim, três medicamentos antiflavivirais, duramicina, ivermectina e azitromicina, foram testados em organoides. Duramicina e ivermectina reduziram significativamente os níveis de mRNA do ZIKV, enquanto a azitromicina não mostrou efeito protetor contra o ZIKV, conforme determinado pela RT-qPCR eimunocoloração 18.

Em um estudo separado, Xu et al. analisaram 173 compostos como supressores da atividade da caspase-3 induzida pelo ZIKV e identificaram o emricasan como o candidato neuroprotetor mais potente sem afetar a proliferação celular nos organoides cerebrais. Dois compostos adicionais, niclosamida e PHA-690509, demonstraram atividade anti-ZIKV significativa ao inibir a replicação viral no estágio pós-entrada, de forma dependente da dose. Além disso, o co-tratamento com emricasan e PHA-690509 produziu um efeito aditivo e preservou a viabilidade dos astrócitos após a infecçãopor ZIKV 19. Em outro estudo, a enoxacina, um potenciador de interferência de RNA (RNAi), demonstrou atividade antiviral direta em células competentes para RNAi e preveniu completamente fenótipos microcefálicos induzidos pelo ZIKV em organoides cerebrais, sugerindo que o aprimoramento das vias antivirais intrínsecas em células progenitoras neurais pode representar uma estratégia terapêuticaviável 20.

Pettke et al. posteriormente triaram 110 análogos estruturais de TH3289 em múltiplas doses em organoides infectadospor ZIKV 21. Dois compostos, TH3289 e TH6744, apresentaram a maior atividade antiviral, e os casos mais ativos compartilharam um núcleo de benzimidazolona. Este estudo foi significativo porque o sistema organoide permitiu não apenas uma triagem rápida de compostos, mas também um acompanhamento mecanicista. Por exemplo, foi constatado que TH6744 interfere nos estágios finais do ciclode vida 21 do ZIKV.

Organoides cerebrais também têm sido usados para identificar candidatos terapêuticos para a infecção por SARS-CoV-2. Um medicamento anti-hepatite C aprovado pela FDA, o sofosbuvir, melhorou a sobrevivência neuronal e resgatou sinaptogênese comprometida em organoides cerebrais infectados porSARS-CoV-2 22. Organoides cerebrais também contribuíram para a compreensão da infecção do SNC mediada pelo HSV-1; no entanto, a triagem de medicamentos antivirais para HSV-1 em modelos organoides permanece limitada em comparação com estudos sobre ZIKV e SARS-CoV-2. Um estudo marcante usando neurônios derivados de iPSC demonstrou que a deficiência de TLR3 torna os neurônios humanos suscetíveis à infecção por HSV-1, revelando um fenômeno específico humano que modelos de roedores não conseguiramcapturar 23. Mais recentemente, Bellizzi et al. demonstraram que o direcionamento de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)-Cas9 das sequências genômicas do HSV-1 suprimiu tanto a infecção primária quanto a reativação viral em culturas organoides 3D, estabelecendo a edição gênica como uma estratégia antiviral viável para a infecção por herpesvíruspelo SNC 24. Considerando que a resistência ao aciclovir é um problema clínico emergente e não existe terapia curativa para a encefalitedo HSV 25, a ausência de triagem em grande escala de compostos antivirais contra HSV-1 em organoides cerebrais representa uma lacuna significativa de conhecimento.

Além das pequenas moléculas, oligonucleotídeos antisentido (ASOs), que direcionam o RNA e modificam a expressão gênica, são ferramentas terapêuticas emergentes para tratar várias doenças, e organoides cerebrais podem ser empregados para avaliar novas terapiasASO 26. Dada a utilidade dos organoides para estudos de ASO, características importantes como biodistribuição, toxicidade e eficácia terapêutica poderiam ser investigadas em organoides cerebrais infectados por vírus.

Uma das aplicações mais importantes dos organoides cerebrais é avaliar a neurotoxicidade dos antivirais existentes. Isso é particularmente importante porque tratamentos comumente usados para HIV demonstraram ser tóxicos para as células cerebrais tanto in vitro quanto invivo 27. Akay et al. demonstraram a neurotoxicidade dos antivirais em culturas corticais primárias contendo microglia, astrócitos e neurônios. Neurônios positivos para MAP2 apresentaram diminuição dependente da dose após exposição ao ritonavir e saquinavir. O tratamento com combinações de antirretrovirais (cART) resultou em neurotoxicidade aguda, e culturas tratadas com zidovudina (AZT) apresentaram aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)28. Embora esses achados tenham sido obtidos usando culturas 2D, organoides cerebrais poderiam expandir essa pesquisa ao fornecer uma plataforma fisiologicamente mais relevante para a triagem de neurotoxicidade de alta taxa de terapias antirretrovirais individuais ou combinadas. Para investigar os mecanismos subjacentes à neurotoxicidade induzida por antivirais nesses modelos 3D, técnicas como análise morfológica, ensaios funcionais e perfil transcriptômico podem serempregadas 29.

Além do rastreamento de neurotoxicidade, organoides cerebrais foram desenvolvidos para estudar o transtorno neurocognitivo associado ao HIV (HAND), que continua afetando de 30% a 50% das pessoas vivendo com HIV, apesar da terapia antirretroviral (TAR) eficaz. As células microgliais são o principal reservatório do HIV-1 no SNC, e modelos organoides foram fundamentais para elucidar como a infecção microglial causa danos neuronais. Kong et al. usaram organoides cerebrais derivados de iPSC contendo microglia e observaram um aumento significativo na expressão gênica de quimiocinas CCL2 e CXCL10, juntamente com ativação de múltiplos genes estimulados por interferon tipo I (MX1, ISG15, ISG20, IFI27, IFITM3 e outros) após a infecção porHIV-1 30. O perfil inflamatório de expressão gênica foi propagado para células observadoras, incluindo neurônios não infectados. Esses neurônios apresentaram um declínio acentuado na expressão do transportador de neurotransmissores, juntamente com aumento da expressão de genes associados à senescência celular e à morte celular. O uso de organoides cerebrais para pesquisas sobre HIV foi pioneiro de Dos Reis et al., que incorporaram microglia infectada pelo HIV em organoides cerebraishumanos 31. Esse modelo reproduziu a replicação viral de baixo nível tipicamente observada no cérebro humano. A incorporação de microglia infectada pelo HIV desencadeou uma resposta neuroinflamatória associada à astrogliose, patologia neurodegenerativa e degeneração e perda dos processos sinápticos neuronais. Donadoni et al. posteriormente utilizaram organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) contendo microglia e astrócitos para modelar o NeuroHIV e avaliar os efeitos da terapia antirretroviral combinada (cART) em um sistema organoide3D 32. Coletivamente, esses estudos baseados em organoides fornecem importantes insights mecanicistas sobre a HAND e estabelecem um sistema modelo valioso para investigar terapias neuroprotetoras.

Em conclusão, os organoides cerebrais fornecem um sistema modelo unificado para triagem de compostos antivirais enquanto avaliam simultaneamente os efeitos neurotóxicos no início do processo de desenvolvimento do medicamento. A identificação de compostos antivirais eficazes é apenas o primeiro passo rumo à tradução clínica (Tabela 1). Igualmente importante é o desenvolvimento de estratégias de administração de medicamentos capazes de administrar agentes terapêuticos às células infectadas dentro do SNC.

VírusModelo OrganoideTipos de CélulasPrincipais DescobertasLimitaçõesReferência
ZIKVOrganoides fetais derivados de hPSCProgenitores neurais, neurôniosHH e AQ reduziram o RNA viral da triagem de 1120 compostosSem células imunes; Estágio fetal17
Organoides corticaisProgenitores neurais25HC reduziu a infecção em ~74%; R428 reduziu o mRNA do ZIKV em ~41%Sem vasculatura18
Organoides cerebraisNeurônios, astrócitosEmricasan, neuroprotetor; Niclosamida e PHA-690509 inibem a replicaçãoSem microglia19
Organoides cerebraisProgenitores neuraisA enoxacina preveniu a microcefalia induzida pelo ZIKV via RNAiSem células imunes20
Organoides cerebraisNeurôniosTH3289 e TH6744 (núcleo de benzimidazolona) interferem no ciclo de vida tardio do ZIKVSem células imunes21
SARS-CoV-2Organoides cerebraisNeurôniosO Sofosbuvir resgatou a sinaptogênese e a sobrevivência neuronalSem BBB22
HSV-1Neurônios derivados de iPSCNeurôniosA deficiência de TLR3 deixa os neurônios humanos suscetíveis; Fenômeno específico de humanosApenas neurônios 2D23*
Culturas organoides 3DNeurôniosCRISPR-Cas9 suprimiu a infecção primária e a reativaçãoMaturação limitada24
HIV-1Organoides cerebrais iPSCNeurônios, microgliaCCL2, CXCL10 regulação para alta; ativação do gene interferon tipo I; Senescência neuronalSem vasculatura30
ORGanoides do Cérebro Humano com microgliaNeurônios, microgliaNeuroinflamação, astrogliose, degeneração sinápticaSem vasculatura31
Organoides cerebrais hiPSCNeurônios, microglia, astrócitosEfeitos do cART avaliados em modelo 3D NeuroHIVModelo em estágio inicial32

Tabela 1: Modelos organoides cerebrais usados para estudar infecções virais neurotrópicas. Esta tabela resume o vírus estudado, modelo organoide, tipos celulares incluídos, principais achados, limitações e referência para estudos representativos baseados em organoides cerebrais sobre ZIKV, SARS-CoV-2, HSV-1 e infecções por HIV-1.

Plataformas de entrega de medicamentos

Encontrar os compostos antivirais mais eficazes para tratar infecções do SNC é essencial, mas sem uma entrega eficiente ao cérebro, esses compostos podem não alcançar benefício terapêutico. Organoides cerebrais podem ser usados para avaliar sistemas de liberação de medicamentos quanto à sua capacidade de penetrar tecidos neurais e administrar cargas antivirais.

Nanopartículas à base de lipídios (LNPs) são amplamente utilizadas como transportadoras de medicamentos. Esses portadores de medicamentos demonstraram aumentar a biodisponibilidade e permitir a entrega direcionada de medicamentos ao local da doença, especialmente em toda aBBB 33. Formulações de mRNA baseadas em LNP foram utilizadas com sucesso na vacinação contraa COVID-19 34,35. Organoides cerebrais podem ser usados para avaliar a eficácia e segurança de novas formulações baseadas em LNP. LNPs também podem ser vetorizados para o SNC por modificação superficial com ligandos de direcionamento. Por exemplo, transferrina ou lactoferrina foram conjugadas a LNPs para facilitar a transcitose mediada por receptores e melhorar o transporte através doBBB 36,37. Coletivamente, a potencial eficácia na administração de medicamentos, neurotoxicidade e mudanças na estabilidade das nanoformulações após a penetração em BBB podem ser investigadas nos organoidescerebrais 38.

Além dos LNPs, nanotransportadores polipeptídicos de duplo alvo também foram estudados como sistema de entrega de fármacos em organoides cerebrais humanos. Nanopartículas (NPs) de ácido poli(L-glutâmico) direcionadas mostraram excelente citocompatibilidade e capacidade de entrar em organoides semelhantes ao mesencéfalo. Foi demonstrado que alanina e glutationa podiam direcionar eficientemente NPs para as células endoteliais cerebrais e penetrar organoides cerebrais, resultando na entrega de fármacos aocérebro 39. A permeabilidade de nanopartículas à base de polímeros foi investigada em organoides de microvasculatura 3D humana, com foco nos efeitos de seu tamanho e química de superfícies. Os organoides gerados consistiam em células endoteliais humanas derivadas de iPSC, astrócitos e perícitos cerebrais primários. Imagens confocais revelaram que a conjugação dos NPs com o ligando holo-transferrina (Tf) associada ao cérebro aumentou significativamente suapermeabilidade 40.

Em seguida, a absorção, penetração e distribuição de nanopartículas de ouro (AuNPs) foram investigadas em esferoides cerebrais BBB. Esses esferóides são compostos por seis tipos de células cerebrais: neurônios, astrócitos, perícitos, células endoteliais, microglias e oligodenrócitos. Os autores relataram que a hipóxia transitória levou à abertura do BBB e ao aumento do transporte de AuNPs para o interior esferoide. As nanopartículas conseguiram entrar facilmente em células enúcleos 41. Em um estudo semelhante usando o mesmo modelo esferoide, o rastreamento concorrente da cinética de penetração de nanocarriers e sua liberação de carga útil terapêutica foi avaliado pela microscopia de varredura a laserconfocal 42. Em outro estudo, Park et al. demonstraram que AuNPs conjugados com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) entraram com sucesso nos organoides cerebrais sem causar toxicidadesignificativa 43.

Além de direcionar as partes específicas, a forma e o tamanho das nanopartículas também podem desempenhar um papel significativo na capacidade de uma nanoformulação de entregar sua carga terapêutica ao cérebro44. Esferas de poliestireno de 200 nm vetorizadas com anticorpos contra o VCAM-1 acumularam de 1,2 a 1,5 vezes mais do que os NPs não vetorizados do controle. Curiosamente, partículas em forma de haste apresentaram acúmulo ainda maior de 2,1 a 2,5 vezes em relação aos controles correspondentes, sugerindo que partículas em forma de haste oferecem vantagem sobre as esferas em termos de ligação celular. Organoides cerebrais podem fornecer insights detalhados sobre como a geometria das partículas pode afetar a penetração cerebral. Além disso, os efeitos da hipóxia e de outros compostos biologicamente ativos sobre a permeabilidade ao BBB podem ser investigados mais a fundo em organoides neurovascularescerebrais 45,46.

Vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células-tronco representam uma alternativa biológica a portadores sintéticos de fármacos, como os LNPs. Branscome et al. exploraram o potencial reparador dos EVs contra a infecção por HIV-1 nas neurosferashumanas 47. Neste estudo, foi demonstrado que os EVs produzidos a partir de células-tronco mesenquimatosas (MSCs) e iPSCs podem penetrar naturalmente nas neurosferas, resgatar a viabilidade celular e reduzir a expressão de citocinas inflamatórias em neurosferas infectadas pelo HIV-1, destacando as propriedades neuroprotetoras e anti-inflamatórias dasEVs 47 de células-tronco. Em outro estudo de Kim et al., pequenas vesículas extracelulares (sEVs) foram projetadas para administração antiviral no tratamento da infecção por SARS-CoV-248. Os nanotransportadores foram carregados com ACE2 solúvel (sACE2) por meio de modificação genética das células doadoras com um plasmídeo codificando eGFP-CD9ΔTM4-sACE2(WT), resultando na expressão de sACE2 na superfície do sEV. Foi demonstrado que sEVs vetorizados por sACE2 protegiam contra WT e contra o vírus mutante S proteínaS pseudotipado 48. O mecanismo de proteção pode ser testado em organoides cerebrais infectados por SARS-CoV-2. Além disso, outro estudo mostrou que os EVs liberados de células infectadas pelo HSV-1 possuem componentes imunes inatos, como o STING, que podem ativar respostas imunes inatas nas células receptoras, resultando em uma inibição potente da replicação do HSV-1. Uma separação crucial dos EVs das partículas virais infecciosas foi alcançada pela centrifugação de gradientede densidade 49.

Organoides cerebrais também podem ser usados para testar a potencial neurotoxicidade de nanoformulações de novos fármacos. Por exemplo, quando AuNPs pegilados foram injetados em organoides cerebrais, foi observada inflamação significativa, mediada pela produção de ROS. Em contraste, os NPs poliláticos poliléticos apresentaram entrega eficiente de medicamentos e baixa citotoxicidade devido à sua lenta absorção e degradabilidade, permitindo a penetração no organoide cerebral sem provocar uma respostaimunológica 50. A neurotoxicidade de AuNPs, grafeno e pontos de carbono também foi avaliada em organoides neurovasculares 3D. Esses organoides consistiam em células neurais, micróglias e uma superfície celular endotelial. Esses estudos revelaram que a microglia pode desempenhar um papel fundamental na permeabilidade e toxicidade dessasformulações 51. Além disso, altas concentrações de NPs de ZnO também demonstraram causar morte neuronal significativa. O mecanismo de toxicidade foi ligado ao acúmulo intracelular de íons Zn, que diminuiu os níveis de proteína LC3B, sugerindo autofagiadefeituosa 52. No geral, esses estudos mostram que organoides cerebrais 3D podem capturar como as nanoformulações interagem com o tecido neural, desde a captação e penetração até a ativação imunológica e toxicidade. O sucesso das estratégias de administração de medicamentos direcionadas ao SNC depende, em última análise, não apenas de alcançar as células-alvo, mas também da modulação das vias inflamatórias ativadas durante a infecção, muitas das quais são iniciadas pela sinalização de DAMPs e PAMPs.

DAMPs e PAMPs em infecções virais

Organoides cerebrais podem ser usados para estudar DAMPs e PAMPs liberados por células estressadas, lesionadas ou moribundas no SNC. DAMPs incluem proteínas de choque térmico, ATP e ácido úrico, enquanto PAMPs incluem macromoléculas bacterianas, virais, fúngicas e parasitas. Assim, esses padrões moleculares alertam o sistema imunológico inato e ativam várias vias de transdução de sinais em resposta a antígenos estranhos ou a qualquer sinal comumente associado à infecção. Os mecanismos subjacentes aos seus efeitos protetores em resposta a infecções virais não são totalmente compreendidos, e investigações detalhadas desses processos podem ser realizadas nos organoidescerebrais 53. DAMPs e PAMPs liberados se ligam a um grande grupo de receptores, incluindo receptores tipo Toll (TLRs), receptores semelhantes a NOD (NLRs), receptores semelhantes a AIM2, receptores semelhantes a RIG-I (RLRs) e receptores de lectina tipo C (CLRs), que são expressos na membrana plasmática ou intracelularmenteem 54. Esses receptores são cruciais para a produção de citocinas e interferon em resposta a infecções virais neurotrópicas, incluindo EV-71, HIV-1, HSV-1, flavivírus, vírus do Nilo Ocidental (WNV) e outros54.

Slowikowski et al. investigaram como DAMPs, quimiocinas e moléculas de adesão liberadas por células neurais danificadas coordenam a entrada de leucócitos no SNC durante a encefaliteflaviviral 55. Em particular, foi revelado que o WNV aumenta a expressão de marcadores altamente inflamatórios de necroptose e morte celular por piroptose que promovem a liberação de DAMPs no cérebro infectado. Quando tais moléculas, por exemplo, a proteína caixa do grupo de alta mobilidade (HMGB1), são liberadas, elas induzem múltiplas vias de sinalização, levando à migração dependente de CXCR4 de monócitos ativados, macrófagos e células dendríticas para tecidosinfectados 56,57. Além disso, foi demonstrado que os DAMPs podem ser liberados em resposta à infecção, seguidos por regulação positiva dos TLRs e exacerbação da inflamação do SNC e danostecidulares 58. No geral, esses estudos indicam que infecções virais parecem desencadear vias de sinalização DAMP-PAMP sobrepostas, levando a neuroinflamação e danos tecidos. Coletivamente, organoides cerebrais contendo microglia e astrócitos poderiam servir como modelo para rastrear respostas em cascata imune no tecido neural humano, especialmente a interação entre liberação DAMP e neuroinflamação mediada por TLR.

O sistema do complemento é um elemento importante da imunidade inata que responde rapidamente à infecção. No entanto, muitos vírus desenvolveram mecanismos para superar esse sistemade defesa 59. Certos vírus escapam do sistema do complemento produzindo proteínas que se ligam aos componentes do complemento e os inibem ou sequestram. Isso foi demonstrado em diversos vírus, incluindo o vírus T-linfotrópico humano-1 (HTLV-1), citomegalovírus humano (HCMV), HIV-1, vírus símio 5 (SV5) e vírus da caxumba (MuV), que incorporam proteínas do complemento do hospedeiro em seus vírions (ou seja, CD55/DAF, CD59, CD64 e MCP). Essas proteínas inibem a resposta imune inata, promovendo a replicação viral e apersistência 60. Assim, organoides cerebrais podem ser usados para identificar os mecanismos específicos pelos quais vírus escapam do sistema do complemento. Evidências crescentes sugerem que DAMPs e PAMPs não apenas moldam a resposta antiviral inicial, mas também atuam como mediadores-chave da inflamação persistente que está por trás de condições pós-virais crônicas.

Papel dos DAMPs/PAMPs na inflamação persistente causada por infecção viral

Além da fase inflamatória aguda, infecções virais podem causar exposição crônica a AMPs/PAMPs, resultando em consequências inflamatórias a longo prazo, especialmente no cérebro. Organoides cerebrais podem se tornar uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos subjacentes das síndromes relacionadas à fase pós-aguda da infecção.

A maioria dos vírus humanos não persistentes atualmente conhecidos ativa respostas imunes durante a fase aguda da infecção, seguida pela eliminação de patógenos. No entanto, em alguns casos, os pacientes apresentam sintomas persistentes que podem diferir daqueles observados durante a fase aguda e podem persistir por meses ou até anos. Especificamente, pacientes com COVID-19 longa relatam fadiga crônica, "névoa mental", febre, dor e outras complicações neurológicas61. Além disso, a inflamação crônica pode aumentar a mortalidade e a morbidade, bem como o risco de atrotrombose, câncer e comprometimentocognitivo 62,63.

Além disso, a persistência de proteínas virais e RNA pode levar a níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1α, IL-1β, IFN-γ e IL-6, causando assim danos aos tecidos, envelhecimento precoce e exaustão do sistemaimunológico 64. A replicação lenta ou traços de componentes virais podem desencadear a liberação de DAMPs/PAMPs que interagem com seus receptores específicos, causando inflamação persistente de baixograu 65. Em alguns casos, a infecção cerebral por HSV-1 pode levar a danos neuronais seguidos de encefalite e pode eventualmente contribuir para o desenvolvimento de distúrbios neurodegenerativos, como a doençade Alzheimer 66. Mecanismos de autofagia interrompidos podem ser um gatilho importante de inflamação crônica em pacientes com HSV-2, na qual mecanismos protetores defeituosos levam à replicação viral persistente, à presença contínua de componentes virais no cérebro e àneurodegeneração 67. Esses componentes virais ativam sensores imunes inatos por meio de PAMPs e podem manipular vias de sinalização para contornar os efeitos antivirais da ativação imune inata. Importante destacar que HCMV e vírus Epstein-Barr (EBV) demonstraram estabelecer infecções virais crônicas que promovem disfunçãoimunológica 68,69. A senescência sustentada induzida pela infecção também pode contribuir para a inflamação de longo prazo associada a várias infecções virais. Organoides cerebrais 3D com componentes imunes integrados fornecem plataformas relevantes para entender os mecanismos complexos subjacentes à exposição crônica a DAMPs/PAMPs e seu papel nas complicações de longo prazo das infecções virais no SNC.

Limitações e perspectiva:

Apesar de suas vantagens em relação aos modelos tradicionais in vitro, os organoides cerebrais apresentam limitações significativas que precisam ser abordadas para apoiar sua aplicação mais ampla. Especificamente, a maioria dos organoides não possui células imunes residentes, que são grandes contribuintes para a modelagem de doenças virais e para a compreensão das respostas imunes inatas e adaptativas durante a infecçãoviral 70. Em particular, protocolos organoides padrão não incorporam microglia, as principais células imunes do SNC e reservatório do HIV-1, o que limita a modelagem da neuroinflamação e persistênciaviral 71. Outra limitação é a complexidade incompleta dos tecidos, incluindo a ausência de vasculatura, que desempenha um papel importante na entrega de nutrientes e oxigênio, bem como na disseminaçãoviral 72. Assim, o crescimento dos organoides é limitado porque as células no centro não conseguem receber nutrientes adequados. Além disso, a excreção de resíduos metabólicos é prejudicada, frequentemente levando a núcleos hipóxicos ou necróticos em grandes organoides. Além disso, os organoides não reproduzem totalmente as interações entre neurônios, células endoteliais e células estromais que podem influenciar a infecção viral e a patogênese. Além disso, neste estágio de desenvolvimento, os organoides não conseguem recapitular infecção sistêmica, disseminação interorgânica e respostas imunes de todo ocorpo. Outra limitação é que muitos organoides epiteliais têm acesso limitado à inoculação viral devido à sua superfície apicalvoltada para dentro 74. Como resultado, a inoculação viral requer microinjeção, levando à variabilidade e baixa taxa de produção. Assim, a inoculação de organoides com diferentes diâmetros dificulta o controle da multiplicidade de infecções. Além disso, muitos organoides se assemelham a tecidos fetais em vez de órgãos adultos, o que pode afetar o tropismo viral, a cinética de replicação e as respostas dohospedeiro 73. Isso é particularmente evidente no caso do HSV-1, já que a maturação neuronal impacta processos de estabelecimento e reativação da latência que os organoides em estágio fetal podem não recapitulartotalmente o 23. Em seguida, organoides podem variar consideravelmente em composição e função, levando a resultados variados, baixa reprodutibilidade e necessidade de numerosos réplicas experimentais. Por exemplo, organoides podem diferir em tamanho, composição celular, arquitetura e estado de maturação. Isso torna a padronização difícil, senão impossível, emlaboratórios 7,75. Por fim, o alto custo e a escalabilidade limitada da geração e manutenção dos organoides continuam sendo barreiras significativas. Como resultado, um grande desafio é o desenvolvimento de plataformas de alta capacidade compatíveis com a tecnologiaorganoide 74.

Apesar dessas limitações e limitações, os organoides possuem potencial significativo para modelar infecções virais, toxicologia e descoberta de medicamentos. Superar essas limitações poderia reduzir significativamente a dependência de modelos animais e facilitar estudos mecanicistas fundamentais76. Uma das deficiências notáveis dos modelos organoides existentes é sua complexidade fisiológica limitada e a falta de composição celular diversificada. Desenvolvimentos futuros precisarão focar na incorporação de componentes imunológicos, neuronais, vasculares e estromais em modelos organoides. Isso poderia ser alcançado usando modelos de cocultura que integram organoides com os tipos celularesmencionados 77,78. Especificamente, a incorporação de células imunes permitirá a modelagem das respostas imunes sistêmicas e da inflamação durante infecções virais. Além disso, organoides vascularizados podem ser desenvolvidos ainda mais para melhorar a complexidade fisiológica e recapitular melhor condições in vivo 79,80. Assim, organoides cerebrais que incorporam tecidos endoteliais apoiarão investigações sobre a função da barreira hematoencefálica e a administração de medicamentos durante infecçõesvirais 13,81. Além disso, organoides cerebrais 3D podem replicar vários aspectos-chave da infecção viral no cérebro. De fato, vários modelos organoides com estruturas intrincadas que representam de perto várias regiões cerebrais estão atualmente sob investigação. Por fim, a inclusão de componentes neuronais e estromais aumentaria ainda mais a fidelidade dos organoides aos sistemas orgânicos nativos. A reprodutibilidade continua sendo outra barreira séria para a aplicação mais ampla das tecnologias organoides. Portanto, gerar organoides robustos e altamente reprodutíveis é crucial para a posterior tradução de aplicações organoides. Diversos métodos para isolamento e semeadura de células, bem como a seleção de matrizes e fatores solúveis, devem ser padronizados em todo o campo83. Vale ressaltar que a composição do meio de cultura, a densidade celular e o tempo de cultivo podem afetar os resultados desses modelos. Portanto, estratégias para reduzir a variabilidade da matriz, incluindo hidrogéis sintéticos compostos por redes poliméricas totalmente definidas com características químicas e mecânicas precisamente controladas, foram introduzidas como uma alternativapromissora 84. Esses organoides apresentam variabilidade mínima de lote para lote, possibilitando estudos controlados. Além disso, a criação de biobancos organoides representando populações diversas de pacientes se tornaria um recurso valioso para a descoberta de medicamentos e identificação de biomarcadores. Tecnologias emergentes de inteligência artificial (IA) estão se tornando ferramentas importantes na pesquisa deorganoides 85. A aplicação adicional dessas tecnologias pode acelerar análises e reduzir o viés na interpretação dos dados. No entanto, aplicações de IA nessa área ainda estão em estágios iniciais. A incorporação de abordagens de IA no desenvolvimento de organoides, como a análise de imagens impulsionada por IA86 ou a otimização preditiva das condições de cultura87, facilitaria significativamente a pesquisa com organoides.

Conclusões

Esta revisão examinou como organoides cerebrais, culturas neurais 3D que imitam de perto a unidade neurovascular humana, estão sendo usados para estudar a invasão, replicação e danos ao SNC causados por vírus neurotrópicos. Embora cada vírus tenha características genéticas e estruturais únicas, muitos dos processos patológicos desencadeados por vírus no cérebro são compartilhados, e modelos organoides têm se mostrado bem adequados para dissecar esses mecanismos comuns e diferentes. A inflamação excessiva pode agravar os danos das células nervosas; No entanto, quando o sistema imunológico inato é devidamente controlado, ele pode limitar a disseminação viral e proteger o tecido cerebral.

Organoides 3D possibilitam o estudo de ambos os efeitos em um contexto fisiologicamente mais relevante, onde modelos animais e culturas celulares 2D falharam em capturar essas dinâmicas. Essas informações são fundamentais para combater a patogênese viral no cérebro e identificar tratamentos que mirem as vias corretas sem aumentar a inflamação. Os organoides cerebrais têm avanço de compreensão sobre infecções virais neurotrópicas, mas algumas lacunas técnicas ainda precisam ser resolvidas. Por exemplo, maturação lenta, vasculatura limitada e ausência de componentes de BBB continuam sendo desafios comuns. A variabilidade nas técnicas de diferenciação de organoides e as inconsistências de lote para lote também dificultam pesquisas envolvendo organoides cerebrais. Além disso, a quantificação da entrada viral, replicação, tropismo do tipo celular e respostas do hospedeiro em um contexto 3D controlado pode ser aprimorada. O trabalho revisado no manuscrito mostrou que os organoides cerebrais estão entre os sistemas mais relevantes disponíveis para estudar como vírus neurotrópicos interagem com o cérebro humano, testando candidatos antivirais e avaliando a administração de medicamentos ao SNC. À medida que a tecnologia amadurece com a melhora na vascularização, integração das células imunes e adoção de protocolos padronizados, os estudos baseados em organoides estarão melhor posicionados para identificar compostos e estratégias com potencial real para tradução clínica.

Abreviações: ASOs, oligonucleotídeos antissenso; BBB, barreira hematoencefálica; CLRs, receptores de lectina do tipo C; SNC, sistema nervoso central; CRISPR, agrupado regularmente com pequenas repetições palindrômicas intercaladas; CXCL10, ligando quimiocina C-X-C motivado 10; DAMPs, padrões moleculares associados a danos; EVs, vesículas extracelulares; hPSCs, células-tronco pluripotentes humanas; HSV-1/2, vírus do herpes simplex tipo 1/2; HIV-1, vírus da imunodeficiência humana tipo 1; IFNs, interferons; IL-6, interleucina-6; ISGs, genes estimulados por interferon; LNPs, nanopartículas lipídicas; NLRs, receptores semelhantes a NODs; PAMPs, padrões moleculares associados a patógenos; PRRs, receptores de reconhecimento de padrões; RNAi, interferência de RNA; RT-PCR, reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa; sACE2-EVs, vesículas extracelulares solúveis decoradas com ACE2; SARS-CoV-2, coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave; scRNA-seq, sequenciamento de RNA de célula única; TLRs, receptores do tipo Toll; TNF-α, fator de necrose tumoral-alfa; ZIKV, vírus Zika; 3D, tridimensional. ZIKV, Zikavírus; hPSC, célula-tronco pluripotente humana; HH, hippeastrina hidrobromido; AQ, amodiquina, diidrocloreto dihidratado; 25HC, 25-hidroxicolesterol, BBB, barreira hematoencefálica; cART, terapia antirretroviral combinada; CRISPR, agrupado regularmente com pequenas repetições palindrômicas intercaladas; hiPSC, célula-tronco pluripotente induzida humana; HIV-1, vírus da imunodeficiência humana tipo 1; hPSC, célula-tronco pluripotente humana; HSV-1, vírus do herpes simples tipo 1; RNAi, interferência de RNA; SARS-CoV-2, coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave; TLR3, Estudo de neurônios 2D derivados de iPSC com receptor tipo Toll 3.* incluído para comparação.

Divulgações

ChatGPT (OpenAI; GPT-5.5) foi usada de forma limitada para auxiliar na triagem da literatura e no refinamento da linguagem. Toda a seleção da literatura, checagem de fatos, verificação de referências e interpretação científica foram realizadas de forma independente pelos autores.

Agradecimentos

Os autores agradecem com gratidão a todos os membros do Laboratório Kashachi, com especial agradecimento a Gwen Cox por seu apoio inestimável. Este estudo também foi apoiado pelas bolsas R01MH134389, AI078859 e AI074410 R21DA057887 do National Institutes of Health (NIH) e pelo Departamento de Defesa HT9425-24-1-0876 para F.K.

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