Estratégia integrada UHPLC-MS/MS e HRMS para triagem de compostos potencialmente hepatotóxicos contendo furano em Dioscorea bulbifera L.

Resumo

Este estudo desenvolveu uma estratégia integrada combinando UHPLC–MS/MS e HRMS para rastrear compostos potencialmente hepatotóxicos contendo furano em Dioscorea bulbifera L.

Resumo

A Dioscorea bulbifera L. (DBL), uma medicina herbal tradicional usada para tratar distúrbios e tumores da tireoide, levantou consideráveis preocupações de segurança devido aos seus potenciais efeitos hepatotóxicos. Pesquisas anteriores sugerem que essa lesão hepática pode estar associada à ativação metabólica de compostos contendo furano (FCCs) presentes na DBL. Aqui, caracterizamos sistematicamente as FCCs e seus metabólitos reativos no extrato de DBL por meio de uma abordagem analítica integrada que combina cromatografia líquida de ultra-alto desempenho combinada com espectrometria de massa tandem (UHPLC-MS/MS) e cromatografia líquida de ultra-alto desempenho combinada com espectrometria de massa tandem de alta resolução (UHPLC-HRMS). Utilizando análises de espectrometria de massa direcionadas e não direcionadas, identificamos um total de 849 constituintes no extrato aquoso da DBL, incluindo 10 furanoditerpenoides e 17 FCCs adicionais. Para elucidar as vias metabólicas de ativação, usamos glutationa (GSH) e 4-bromobenzilamina (BBA) como agentes duplos de captura dentro de um sistema de incubação microssomal do fígado de camundongo (MLM). Por meio do metabolismo mediado por P450, sete adutos correspondentes derivados da diosbulbina B (DSB), C (DSC), D (DSD), E (DSE), L (DSL), N (DSN) e 2-pentilfurano foram capturados e caracterizados com sucesso. Este estudo estabelece uma abordagem sensível e específica para o perfil abrangente de compostos potencialmente hepatotóxicos de furano na DBL, e fornece insights valiosos sobre a formação de metabólitos reativos e mecanismos de toxicidade relacionados à fitoterapia que contém furan.

Introdução

Preocupações de segurança relacionadas à medicina tradicional chinesa (MTC), especialmente a lesão hepática induzida por medicamentos (DILI), dificultam sua ampla utilidade clínica e^{modernização 1,2,3}. Evidências crescentes sugerem que a maioria dos constituintes da MTC não é intrinsecamente tóxica; em vez disso, sua hepatotoxicidade resulta da ativação metabólica in vivo ^1,4,5. Compostos contendo furano (FCCs) são bem reconhecidos como precursores hepatotóxicos proeminentes, passando por ativação metabólica mediada pelo P450 para produzir intermediários eletrofílicos altamente reativos, especificamente cis-enediais, que são cruciais para iniciar a toxicidade hepática. Esses metabólitos eletrofílicos formam adutos covalentes com tióis cisteína e grupos amino de proteínas essenciais, facilitando assim a progressão de efeitos^{tóxicos 6,7,8}.

Na MTC, a Dioscorea bulbifera L. (DBL) tem sido amplamente utilizada para o tratamento de distúrbios da tireoide, tumores e doenças de pele ^9,10. Um total de 152 constituintes químicos foram isolados e caracterizados a partir da DBL, incluindo 41 furanoditerpenoides¹¹. Entre eles, a diosbulbina B (DSB), um componente bioativo importante, demonstrou induzir lesão hepática em modelos murinos, um efeito intimamente ligado à formação do cis-enedial (DDE) derivado do ^DSB12,13. Impulsionada pelos avanços na instrumentação analítica, a espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta importante para analisar componentes químicos complexos e metabólitos da^{MTC 14,15}. Convencionalmente, cis-enediais produzidos pelo metabolismo do DSB são detectados ao capturar espécies eletrofílicas com N-acetil-L-lisina em combinação com glutationa ou N-acetil-L-cisteína, seguida pela análise LC-MS/MS dos derivados quimicamente estáveis do^{pirrol resultante 16,17}. Com base nessa abordagem, desenvolvemos anteriormente uma estratégia aprimorada que emprega a captura simultânea de intermediários metabólicos derivados do furano com GSH e BBA, combinada com análise LC-MS/MS usando varredura de perda neutra de 129 Da e uma varredura iônica precursora de m/z 272 para adutos GSH, juntamente com uma varredura iônica precursora 1:1 de m/z 169 e 171 derivada da metade BBA para detecção de pirrol (Figura 1)^{18, 19}. Embora eficaz para furanoides conhecidos, essa abordagem apresenta limitações notáveis quando aplicada a misturas complexas, especialmente para FCCs que carecem de informações estruturais prévias. Portanto, permanece uma necessidade urgente de uma estratégia analítica abrangente capaz de permitir a caracterização química completa de matrizes complexas da MTC e, simultaneamente, apoiar a triagem eficiente de precursores hepatotóxicos.

Aqui, relatamos uma estratégia integrada para a caracterização sistemática de FCCs potencialmente hepatotóxicas em DBL (Figura 2). A estratégia envolve três etapas principais: (i) perfil químico abrangente do extrato aquoso de DBL usando metabolômica amplamente direcionada (WTM) baseada em UHPLC–MS/MS; (ii) captura de intermediários reativos gerados a partir de FCCs com GSH e BBA; e (iii) detecção e elucidação estrutural de adutos de GSH/BBA formados por ativação metabólica de constituintes potencialmente tóxicos usando HPLC–MS/MS e UHPLC–MS/MS. Essa abordagem integrada permite a identificação inequívoca dos principais precursores tóxicos responsáveis pela hepatotoxicidade induzida por DBL a partir de matrizes complexas da MTC e fornece uma estrutura altamente sensível e específica para a avaliação da segurança da MTC.

Protocolo

NOTA: Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da solução de teste DBL

1. Colete e autentique três lotes dos tubérculos de Dioscorea bulbifera L. Seguindo a Especificação Nacional para Processamento da MTC, remova as raízes fibrosas dos tubérculos, lave-as para remover a sujeira, corte-as em fatias circulares de 1 cm de espessura enquanto estão frescas, seque as fatias em um forno de ar forçado a 60 °C, depois remova e resfrie até a temperatura^{ambiente de 20}.
2. Pesar 200 g de DBL de cada lote e moe-os até virar um pó grosso (tamanho de partícula 250-850 μm) usando um triturador de alta velocidade.
3. Deixe de molho 20 g de pó bruto em 200 mL de água desionizada (1:10, p/v) por 30 minutos. Simultaneamente, processe uma mistura dos três lotes de pó grosso preparados na etapa 1.2 (misturados na proporção 1:1:1, p/w).
4. Extraia o material embebido aquecendo sob refluxo por 60 minutos. Filtre o extrato por gaze ou peneira para remover resíduos insolúveis. Adicione 200 mL de água desionizada ao resíduo restante e repita a extração do refluxo 2 vezes, cada por 60 minutos. Combine os três filtrados e concentre o extrato acumulado fervendo até um volume final de 100 mL.
5. Transfira o extrato concentrado para um liofilizador a vácuo e liofilize para obter pó.
6. Pese com precisão 18 mg de cada lote de pó de extrato. Dissolva cada um em 1,5 mL de acetonitrila a 50% e faça um vórtice na mistura por 30 s para garantir a homogeneidade.
7. Centrifuge a solução a 13.800 x g por 10 minutos a 4°C e colete o sobrenadante como solução de incubação MLM.
8. Pipete 20 μL da solução original, dilua a 1:50 com 50% de acetonitrila e use vórtice por 30 segundos. Em seguida, filtra a solução através de uma membrana microporosa de 0,22 μm para preparar a solução da amostra para análise espectrométrica de massas.

2. Caracterização química da DBL

1. Condições cromatográficas
   1. Use uma coluna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) e ajuste a temperatura do forno da coluna para 40 °C. Prepare a fase móvel A como ácido fórmico de 0,1% (v/v) na água e a fase móvel B como acetonitrila.
   2. Programe a elução do gradiente da seguinte forma: 0–10 min, 2%–50% B; 10–11 min, 50%–95% B; e 11–13 min, 95% B. Ajuste a vazão para 0,4 mL/min e injete 2 μL da amostra.
2. Realizar análise espectrométrica de massa usando os seguintes parâmetros: Fonte de íons: ionização eletrospray Ionização Ionização Turbo V (ESI); Modo de aquisição: Monitoramento de reações múltiplas (MRM) com aquisição simultânea nos modos de íons positivos e negativos; Tensão de pulverização de íons: +5,5 kV (positivo) / −4,5 kV (negativo); Gás cortina: 35 psi; Temperatura de origem: 400 °C; Gás fonte de íons 1: 60 psi; Gás fonte de íons 2: 60 psi; Potencial de desagrupamento (DP): ±100 V.
3. Processamento de dados
   1. Adquirir e processar dados de MRM usando o software SCIEX Analyst (v1.6.3). Converta os arquivos de dados brutos (.wiff) para o formato TXT usando MSConvert. Anote os compostos detectados consultando a biblioteca proprietária BiotreeDB (V2.1) MS. A anotação foi baseada na correspondência dos tempos de retenção (RT), razões massa-carga (m/z) e padrões de fragmentação com padrões autênticos.

3. Caracterização de conjugados GSH/BBA gerados em incubações MLM

1. Incubação de MLM
   1. Descongele lentamente a suspensão microssomal do fígado de camundongos sobre gelo. No gelo, prepare a mistura de incubação em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, adicionando sequencialmente os componentes listados abaixo. Adicione o sistema regenerativo de NADPH por último. Para o grupo de controle, substitua o sistema regenerativo de NADPH por um volume igual de PBS gelado. Vórtice para misturar brevemente.
      1. Prepare uma mistura de incubação composta pelos seguintes componentes: Suspensão microssômica do fígado de camundongo (MLM, proteína 4 mg/mL): 125 μL; Solução de cloreto de magnésio (MgCl₂) (32 mM): 10 μL; DBE (12 mg/mL) ou solução padrão DSB (35 mM): 10 μL; Solução de glutationa (GSH) (50 mM): 100 μL; Solução BBA (250 mM): 10 μL; Tampão PBS (pH 7,4, contendo 1,0 mol/L EDTA e 0,1 mol/L_{K 2HPO 4}): 145 μL; Solução do sistema regenerador de NADPH (5,0 mM): 100 μL.
   2. Imediatamente após a conclusão da incubação, remova todos os tubos da incubadora. Termine a reação enzimática adicionando 1 mL de acetonitrila gelada (-20 °C) a cada tubo.
   3. Vórtice por 3 minutos para precipitar proteínas. Centrifuge a 13.800 x g por 10 minutos a 4 °C.
   4. Colete o sobrenadante, filtre através de uma membrana de 0,22 μm e transfira o filtrado para um frasco autoamostrador.
2. Triagem preliminar da incubação de extratos de DBL por MLM por HPLC-MS/MS
   1. Condições cromatográficas
      1. Use uma coluna C18 (150 mm x 4,6 mm, 3 μm) e ajuste a temperatura da coluna para 25 °C. Prepare a fase móvel A como ácido fórmico de 0,1% (v/v) na água e a fase móvel B como acetonitrila.
      2. Execute a seguinte inclinação: 0–2 min, 10% B; 2–15 min, aumento linear de 10% para 90% B. Ajuste a vazão para 0,8 mL/min e injete 5 μL da amostra preparada.
   2. Condições de espectrometria de massa. Ajuste o alcance de varredura total para m/z 500–1000. Varreduras de íons precursores (PI) em m/z 169 e 171, e uma varredura de perda neutra (NL) de 129 Da em modo íon positivo, e uma varredura PI em m/z 272 em modo de íons negativos. Defina os parâmetros-chave da seguinte forma: tensão de pulverização iônica (IS), +5.500 V (positivo) / −4.500 V (negativo); potencial de desagrupamento (DP), ±70 V; potencial de entrada (EP), ±10 V; energia de colisão (CE), +35 V (positivo) / −40 V (negativo); potencial de saída da célula de colisão (CXP), ±10 V; gás fonte de íons 1 e 2 (GS1/GS2), 50 psi cada; gás cortina (CUR), 40 psi; e temperatura de origem (TEM), 650 °C.
   3. Adquira e processe todos os dados de espectrometria de massa usando o software SCIEX Analyst (v1.6.3).
3. Identificação de derivados de pirrol e FCCs pelo UHPLC-HRMS
   1. Condições cromatográficas
      1. Use uma coluna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,9 μm) e ajuste o forno da coluna para 30 °C. Prepare a fase móvel A como ácido fórmico de 0,1% (v/v) na água e a fase móvel B como acetonitrila.
      2. Programe o gradiente da seguinte forma: 0-20 min, 5%-95% B; 20-21 min, 95% B. Ajuste a vazão para 0,3 mL/min e injete 2 μL da amostra.
   2. Realizar análise espectrométrica de massa com os seguintes parâmetros: Fonte de íons: ESI; Tensão de pulverização de íons: +3,5 KV (íons positivos)/-2,5 KV (íons negativos); temperatura capilar: 320 °C; temperatura do aquecedor da sonda: 350 °C; gás de bainha: 10 arb; corrente máxima de pulverização: 100 μA; Nível de RF da lente S: 50%; energia de colisão: 35 V (íons positivos) e 40 V (íons negativos); Alcance de varredura: 100-1000 m/z.
   3. Pré-processamento de dados
      1. Com base nos FCCs identificados pelo DBL e no mecanismo de captura (Figura 1), extraia os conjugados previstos de GSH/BBA usando o ChemBioDraw Ultra 14.0 (Figura Suplementar 1).
      2. Importe os arquivos crus (.raw) do HRMS adquiridos para o módulo Qual Browser do Xcalibur (V4.1). Crie um fluxo de trabalho de identificação no software para selecionar conjugados GSH/BBA.
      3. Compare os espectros experimentais MS¹ e MS² com as estruturas previstas de conjugados GSH/BBA derivadas de FCCs (previstas usando ChemBioDraw Ultra 14.0) com base nos mecanismos de addução conhecidos (Figura 1 e Figura Suplementar 1). Use um limiar mínimo de intensidade máxima de 1 x 10⁵ e uma tolerância de precisão de massa de ± 10 ppm para todos os íons monitorados. Confirme os conjugados com base no padrão característico de isótopos de bromo (aproximadamente 1:1) observado tanto nos espectros MS¹ quanto MS² , incluindo íons diagnósticos em m/z 169 e 171.
      4. Determine os pesos moleculares das FCCs originais subtraindo a massa da marca GSH/BBA dos íons moleculares observados. Use 472/474 Da (C₁₇H_{21O 5}N₄BrS) para a subtração.
      5. Caracterize as FCCs-mãe no DBL pelo UHPLC–HRMS com base nos resultados obtidos acima.

Resultados

FCCs identificadas no DBL
Para caracterizar o perfil químico do DBL, foi empregada uma combinação de perfil WTM baseado em quadrupolos triplos e HRMS. Essa abordagem dupla permitiu a análise abrangente de pares de íons extraídos, gerando cromatogramas de íons extraídos altamente informativos (EICs, Figura 3A) e cromatogramas iônicos totais (TICs, Figura 3B). Sob as condições cromatográficas e de detecção otim...

Discussão

Investigações anteriores sobre a hepatotoxicidade da DBL focaram principalmente nos intermediários metabólicos de FCCs individuais, utilizando estratégias de captura^{direcionadas 9,22}. Embora essas abordagens forneçam valiosos insights mecanicistas, sua eficácia em matrizes herbais complexas é frequentemente limitada pela baixa detecção de intermediários bioativados de baixa abundância. No presente estudo, desenvolvemos um fluxo d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-Bromobenzilamina	Jiuding Chemical (Shanghai) Technology Co., Ltd	X114214A
Acetonitrila	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd	1000294000
Centrífuga	Wuxi BaiTaKe Biotechnology Co., Ltd	CR3180
Cromatográfico  Sample  Garrafas	Zhejiang ALWSCI Technology Co., Ltd	C0000008
Diosbulbina B	Chengdu PufeiDe Biotech Co., Ltd	18022603
Dioscorea bulbifera L.	-	DBL-1; DBL-2; DBL-3	Os materiais vegetais foram autenticados pelo Prof. Weike Jiang (Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guizhou, Guiyang, China), com amostras voucher depositadas no Laboratório Chave de Farmacologia Básica da Província de Guizhou.
Balanço Eletrônico	Fábrica de Instrumentos Eletrônicos Anting de Xangai	FA1004B
Ácido fórmico	Thermo Fisher Scientific Co., Ltd	195715
Glutationa	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd	SLBX5462
Alta velocidade  Crusher	Yongkang Biao Hardware Products Co., Ltd	XC-2000Y
Microssomos do fígado de camundongos de Kunming (machos)	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.	MB12496-1
Cloreto de Magnésio	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	M8161
Metanol	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd	646377
Filtro de Milliporos	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	Nylon66
NADPH Na4	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	102X022
Forno	Instrumento Laboratorial & Tianjin Equipment Co., Ltd	GFL125
Soro Tamponado com Fosfato	Beyotime Biotechnology  Co., Ltd	C0221B
Termostato  água  bath  oscilador	Shanghai Zijia Instrument Co., Ltd	THZ-82A
Ultra-freezer	Thermo Fisher Scientific Co., Ltd	TDE60086FV-ULTS
Purificador Ultrassônico	Shanghai Zijia Instrument Co., Ltd	L10-250A
Misturador de vórtices	Fábrica de Instrumentos Médicos Jiangsu Haimen	VM-D