Artigo de método

Um Modelo Padronizado Ex Vivo de Oromucosas Suínas para Avaliação de Fluxos de Peptídeos

369 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

9 de junho de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma plataforma de triagem usando mucosas do tecido epitelial bucal suíno recém-isoladas para avaliar a permeação peptídica. O método integra a permeação de um GLP-1RA na presença de um intensificador de permeação proveniente de soluções, câmaras Hilltop, filmes em Células de Difusão Franz e insertos impressos em 3D, acompanhados por avaliação histológica da mucosa.

Resumo

A administração oromucosa de medicamentos em filmes, comprimidos, pastilhas e outras formas dosais oferece uma via sistêmica conveniente para pacientes pediátricos e idosos, e para pacientes que não conseguem engolir cápsulas ou comprimidos facilmente. Desenvolver formulações de peptídeos buccais e sublinguais requer modelos pré-clínicos que estejam alinhados com as estruturas epiteliais oromucosas não queratinizadas dos humanos, das quais porcos e cães são os mais adequados. Obtivemos tecidos oromucosos suínos frescos descartados em um matadouro. As mucosas foram dissecadas do músculo liso subjacente usando aquecimento controlado e depois montadas em Células de Difusão Franz ou em novos insertos de resina 3D impressos em baixo volume. Combinações de realçadores peptídicos e permeação foram adicionadas ao lado doador, e moléculas permeadas foram amostradas do lado receptor e quantificadas por cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (uHPLC). Para os inserts, os valores de resistência elétrica transepitelial (TEER) das mucosas montadas foram medidos usando eletrodos de hashis de EVOM. A histologia tecidular foi examinada após incubação tanto em células de difusão de Franz quanto em inserções 3D. A concentração ideal de potenciador de permeação foi selecionada quando misturas aquosas de peptídeo e realçador produziram aumento na permeação. A permeação peptídica atingiu 4,3% ao longo de 3 horas em inserts tridimensionais (3D) e 1,7% em modelos de câmara Hilltop, estes últimos simulando exposição direta de um filme bucal. Filmes mucoadesivos poliméricos camada por camada, contendo combinações peptídicos-realçadores, foram desenvolvidos e aplicados ao tecido mucoso para estudos de permeação usando câmaras de difusão. A permeação peptídica ex vivo nas mucosas bucais suínas atingiu 2% quando as mucosas foram expostas à combinação ideal de glicodesoxicolato (GDC) incorporada aos filmes bucales. Esses estudos de triagem ex vivo fornecem um caminho para a subsequente avaliação farmacocinética de formulações de filmes carregados de peptídeos administradas pela via oromucosal em porcos e pessoas.

Introdução

Oromucosas bucais e sublinguais são rotas atraentes de administração oral de medicamentos porque oferecem locais diretamente acessíveis e evitam o metabolismo hepático de primeira passagem, potencialmente melhorando a biodisponibilidade e a aceitação do paciente em comparação com outras vias, incluindoa oral 1,2. Os peptídeos geralmente são administrados por injeção em vez de administração oral devido à baixa permeação através do epitélio intestinal, devido ao seu maior peso molecular, hidrofilicidade e suscetibilidade à degradaçãoenzimática 3. A FDA aprovou 102 peptídeos para aplicações terapêuticas, com ~450 peptídeos terapêuticos em avaliação em ensaios pré-clínicosou clínicos 4. Incluem comprimidos orais formulados com potenciadores de permeação (por exemplo, semaglutida, Rybelsus)5 e plataformas oromucosas (Minirin Melt e acetato sublingual de desmopressina Nocdurna) desenvolvidas usando a tecnologia de comprimidos orais desintegrantes (ODT) Zydisda Catalent6. Apesar da extensa investigação em estudos de permeabilidade bucal de fármacos, os valores de permeabilidade das moléculas mostram baixa reprodutibilidade e comparabilidade limitada entre os estudos 7,8. Essas inconsistências decorrem em grande parte de variações nos modelos animais experimentais utilizados e de diferenças no manuseio e preparação das mucosas bucaisisoladas 9.

Ensaios de permeabilidade ex vivo usando mucosas isoladas de tecido bucal e sublingual, são uma ferramenta valiosa para prever a permeabilidade in vivo de pequenas moléculas oromucosas e para triagem pré-clínica de componentes de formulação relevantes para as formasde dosagem 10,11,12; no entanto, seu uso na triagem peptídica tem sido limitado porque a permeabilidade basal é desprezível. Nos últimos anos, a mucosa bucal suína tornou-se o modelo preferido porque sua estrutura não queratinizada e características fisiológicas e bioquímicas se assemelham muito àshumanas 13. Amostras bucais de cães são ainda menos acessíveis em comparação com o tecido suíno de matadouros, embora ambas as fontes sejam14 não queratinizadas. Persiste considerável variabilidade na espessura epitelial e nos métodos de processamento. A padronização da preparação oromucosa bucal e sublingual é essencial. Variáveis como condições de armazenamento de curto e longo prazo, espessura do tecido e manutenção da viabilidade durante os experimentos influenciam todos os resultados da permeabilidade ex vivo 8. A preservação tecidular é crítica, pois tanto a integridade estrutural quanto a atividade metabólica da mucosa afetam diretamente os perfis dedifusão 12,15. A perda da função barreira pode resultar em taxas de permeação de medicamentos artificialmenteelevadas 16,17. Além do armazenamento, o método usado para dissecar mucosas bucais suínas para montagem em câmaras de permeação introduz ainda mais variabilidade. Diferenças na remoção do tecido conjuntivo submucoso, seja por meios mecânicos, químicos ou térmicos, podem alterar apermeabilidade 18. Embora alguns relatos sugiram que a separação de calor para isolar o epitélio do músculo liso preserva apermeabilidade 19, falta consenso. Atualmente, não existe um método universalmente aceito para dissecar e avaliar a integridade das mucosas bucaisisoladas 20. O açúcar hidrofílico fluoresceína isotiocianato-dextrano marcado (FITC dextrano 4000, FD-4) é comumente usado como marcador de integridade para a mucosa bucal porcina, pois apenas moléculas pequenas abaixo de ~500 Da podem penetrar passivamente no tecido. Em contraste, uma mucosa intacta restringe o transporte do FD-4, e uma transferência de doador para receptor abaixo de 0,6% é tipicamente considerada aceitável em 2-4 horas21,22. Além disso, a coloração de tecidos por hematoxilina e eosina fornece uma avaliação direta da morfologiaepitelial 23.

Neste trabalho, estabelecemos um protocolo padronizado para o manuseio da mucosa de mucosas buccais suínas isoladas, projetado para otimizar a integridade e permeabilidade da mucosa durante um período determinado. Nossos objetivos eram fornecer uma estrutura experimental para dissecar tecido epitelial bucal suíno e aprimorar a confiabilidade das avaliações de permeabilidade ex vivo de peptídeos em oromucosas montadas em câmaras de difusão e insertos. Primeiro realizamos análises visuais para identificar a mucosa bucal livre de danos do matadouro. Otimizamos técnicas de processamento de tecidos, espessura mucosa e métodos para manter a integridade dos tecidos durante os experimentos. Utilizando um análogo estável e de baixa potência do receptor peptídico-tipo 1 do Glucagon (GLP-1 RA) como molécula-ferramenta, realizamos estudos de permeação peptídica na presença e ausência de um realçador de permeação de sal biliar, glicodesoxicolato de sódio (GDC), em mucosas bucais montadas em células de difusão de Franz e em inserts personalizados do tipo transwell impressos em 3D e feitos em casa. GDC e GLP-1 RA foram apresentadas a mucosas bucais a partir de soluções, câmaras Hilltop e filmes poliméricos multicolados de bicamada mucoadesiva. Utilizamos marcadores de permeabilidade, histologia dos tecidos e valores de resistência elétrica trans-epitelial/endotelial (TEER) como nossos principais critérios de avaliação.

Protocolo

As bochechas de porco usadas neste estudo foram coletadas em um matadouro local; portanto, não era necessária aprovação ética.

1. Isolamento, preparação e armazenamento do epitélio bucal suíno

  1. Colete tecidos das bochechas de porco de um matadouro local e transporte em até 90 minutos para o laboratório em soro tampão fosfatado gelado (PBS, pH 7,4). Nos próximos 60 minutos, prepare os tecidos de acordo com a metodologiadescrita anteriormente 19,24, com pequenas modificações para diferentes sítios oromucosas, conforme mostrado na Figura 1.
  2. Usando um bisturi, separe as mucosas bucais do tecido subjacente e enxágue o tecido três vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS). Descarte as mucosas com danos na superfície visual.
  3. Imerga as mucosas intactas em PBS a 65 °C por 3 minutos e separe o epitélio e o tecido conjuntivo restante do músculo liso usando uma pinça de relojoeiro tamanho 5. Esse método também é aplicável para isolar mucosas epiteliais sublinguais e linguais.
  4. Seque suavemente as oromucosas dissecadas em papel filtro de celulose e proceda para estudos de permeação (a opção preferível) ou congele por no máximo 4 semanas.
  5. Para o processo de congelamento após a separação, imerga oromucosas por 2 horas em um crioprotetor, 85% glicerol25, com sacudidas suaves. O glicerol de alta viscosidade substitui a água intercelular para evitar a formação de cristais de água, que podem danificar a estrutura do tecido.
  6. Após esse período, substitua o glicerol por PBS fresco e glicerol 10%. Congele as amostras mucosas a -20 °C ou -70 °C, dependendo da duração de armazenamento necessária. Realize o procedimento de congelamento a uma taxa controlada de ~-1 °C·min-1.
    NOTA: Todos os experimentos são realizados usando pelo menos três amostras de tecidos das bochechas de diferentes animais.

2. Estudo de permeação ex vivo em mucosas montadas em células de difusão de Franz e uso de câmaras Hilltop para apresentar a RA GLP-1 e GDC

NOTA: Estudos de permeabilidade ex vivo são realizados inicialmente em mucosas buccais suínas recentes e isoladas usando células de difusão de Franz (FDC).

  1. Monte as mucosas dissecadas em câmaras (área da janela 1,2cm 2) mostrada na Figura 2 e equilibre por 30 minutos com PBS, pH 6,8 (lado doador, volume de 1 mL) e PBS, pH 7,4 (lado receptor, volume de 10 mL).
  2. Após 30 minutos de equilíbrio, substitua a solução doadora PBS (pH 6,8) por 1 mL de PBS contendo uma razão 1:1 entre GLP-1RA (25 mg/mL) e GDC (25 mg/mL).
  3. Continue mexendo a câmara do receptor com 10 mL de PBS pH 7,4, mantido a 37 °C a 300 rpm. Amostre 1 mL do compartimento receptor a cada 60 minutos por 180 minutos. Colete amostras triplicadas dos compartimentos doadores no início e no final do experimento. Após cada amostragem, reabasteça as câmaras com 1 mL de PBS.
  4. Ao final do experimento, armazene o tecido em 10% de formalina para histologia ou homogeneize-o para quantificar o peptídeo GLP-1RA restante no tecido.
  5. Da mesma forma, realize a permeabilidade do GLP-1RA usando recamarotas Hilltop (HTC).
    NOTA: O objetivo do uso do HTC é confirmar o efeito de amplificação da permeação oromucosa da GDC sobre o GLP-1 RA em solução antes de formular um filme bucal em duas camadas. O HTC é uma câmara construída a partir de Kraton G-2705, um copolímero biocompatível de estireno-etileno-butileno-estireno (SEBS), com diâmetro externo de 19 mm, e contém uma almofada Webril (12,7 mm de diâmetro) composta por fibras de algodão 100% não trançadas, que serve como material absorvente e antiaderente para aplicação de solução26.
  6. Da mesma forma, avalie a permeabilidade ex vivo do GLP-1RA e GDC (proporção 1:1) carregados em filmes de bicamada mucoadesiva, colocando os filmes em câmaras doadoras de FDCs ou em inserts 3D, conforme descrito para HTC.
  7. Para confirmar a integridade do tecido epitelial bucal porquino, use FD-4 (0,05 mM) como marcador de fluxo fluorescente e adicione-o ao lado doador para avaliar o vazamento no tecido.
    NOTA: Tecidos que apresentam vazamento são excluídos dos cálculos de permeabilidade.
  8. Após o experimento de 3 horas, quantifique-se o fluxo cumulativo de GLP-1 RA por análise uHPLC das amostras de 200 μL retiradas do compartimento basolateral em triplicado. Repita todos os experimentos de permeação três vezes. Quantifique o fluxo cumulativo de GLP-1RA a partir de uma curva de calibração gerada a partir de concentrações conjuntas de GLP-1RA.

3. Preparação de filmes bucais capturados com o GLP-1RA e GDC

NOTA: Filmes bilayer bucais contendo uma camada mucoadesiva e de suporte são fabricados usando fundição com solvente e um revestimentosemi-automatizado 27.

  1. Prepare um filme de duas camadas para aprisionar o GLP-1RA usando HPMC e PVP-K90 como polímeros formadores de filme, e um componente mucoadesivo, Na-CMC.
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para a composição da camada mucoadesiva e de suporte do filme bucal. A GDC é incorporada com um peptídeo GLP-1 RA em filmes-modelo em quantidades baixas de mg para observar seu efeito na permeação peptídica através das mucosas bucais suínas montadas em câmaras.
  2. Prepare a camada mucoadesiva dissolvendo os polímeros formadores de filme, 45 mg de HPMC, 10 mg de Na-CMC e 25 mg de PVP-K90, em água desionizada contendo 3% de glicerol a 400 rpm por 10 minutos, usando um agitador de placa quente magnética.
    NOTA: O HPMC é solúvel em temperatura ambiente, enquanto o PVP-K90 requer aquecimento a 40 °C por 30 minutos para se dissolver.
  3. Adicione 2 mg de Aerosil 200 F sob meximento, seguido pela adição do GLP-1 RA. Depois, adicione GDC e disperse a 600 rpm por 30 minutos.
  4. Ultrasultrasonice a solução polimérica final por 90 minutos usando um banho de ultrassonação para remover as bolhas.
  5. Fundir filmes sobre um revestimento de polietileno tereftalato (PET) e revestir com uma lâmina de doutoramento ajustada a 2600 μm a 2 mm/s. Seque os filmes em um forno a ar quente a 40 °C por ~1 hora.
  6. Para a camada de apoio, dissolva 5% de celulose etílica (CE) e 5% propileno glicerol (PG) em água hidroalcoólica (etanol:água), depois despeje a polpa dissolvida sobre um revestimento PET. Por fim, corte os filmes secos em quadrados de 1 cm × 1 cm, embale sachês de alumínio e armazene a 4 °C.

4. Impressão de um insert 3D personalizado que imite transwells

NOTA: Os inserts personalizados impressos em 3D são fabricados seguindo um método previamente descrito com pequenasmodificações 28.

  1. Resumidamente, projete o modelo 3D usando software de design assistido por computador (CAD).
  2. Mantenha as dimensões do insert 3D iguais às do corpo cilíndrico principal (câmara doadora), com uma área máxima de superfície de 1659,06mm² e dimensões externas totais de 25,20 mm ao longo do eixo x, 14,50 mm no eixo y e 21,63 mm ao longo do eixo z.
  3. Além disso, projete um anel circular de retenção destacável para suportar o tecido epitelial. O anel tem diâmetro externo de aproximadamente 19,90 mm e diâmetro interno de 17,93 mm, correspondendo às dimensões do corpo cilíndrico principal, e pode caber em placas Transwell de 12 poços (Figura 3).
  4. Fabrice todos os componentes usando uma impressora 3D de estereolitografia (SLA) de mesa com uma resina transparente curável por UV. Todas as dimensões são aproximadas e podem ser ajustadas conforme necessário para garantir o encaixe adequado nos Transwells e compatibilidade experimental.
    NOTA: Para garantir a remoção de monômeros não reagidos e potenciais lixiviáveis, todas as peças passaram por um protocolo padronizado de pós-processamento, incluindo uma lavagem de 10 minutos em álcool isopropílico 99% (IPA) imaculado, seguida de cura UV conforme as especificações do fabricante, ou seja, 1 minuto à temperatura ambiente em uma Forma de Cura 2. Arquivo de estereolitografia (STL) para design de modelos 3D pode ser encontrado em arquivos https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 ou suplementares (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2).

5. Permeação através das mucosas montadas em inserções 3D

NOTA: A permeabilidade ex vivo do GLP-1RA e GDC incorporada em filmes bucais bicamadas mucoadesivas também pode ser avaliada usando inserts 3D de baixo volume, projetados sob medida para imitação Transwell (Figura 2), como alternativa aos FDCs. Isso ocorre porque o lado receptor de 10 mL dos FDCs dilui o peptídeo, desafiando a sensibilidade à detecção do uHPLC. O desenho do CDF, portanto, não é econômico nem prático para fluxos peptídicos, pois exigiria detecção contínua de ensaios imunossorvetores ligados a enzimas (ELISA) ou radioimunoensaios (RIA).

  1. Fabrice/imprima os inserts em uma resina curável por UV usando uma impressora SLA3D desktop 28, e monte-os em placas de cultura de tecido de 12 poços.
  2. Posicione as mucosas bucais suínas em uma área de janela de 1,4 cm2 entre as câmaras apical e basolateral, meça a resistência elétrica transepitelial (TEER) de base usando o voltohmímetro EVOM 2 com eletrodos STX2 de hashis colocados nos lados doador e receptor dos insertos. TEER é calculado pela Lei de Ohm.
  3. Após colocar o filme (1,0 × 1,0cm 2) sobre o tecido do tecido, pipete 0,5 mL de PBS (pH 6,8) na câmara apical e 1,5 mL de PBS (pH 7,4) na câmara basolateral.
  4. Colete amostras (0,2 mL) dos lados do receptor em intervalos de 1 hora ao longo de 3 horas e substitua por volumes iguais de buffer novo.
  5. Quantifique o peptídeo GLP-1 RA fluxado por uHPLC.
    NOTA: Não há adsorção de GLP-1RA com inserções 3D observada após 3 horas, como mostrado na Figura Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 3.
  6. Meça a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando o voltômetro EVOM 2 com eletrodos de hashis STX2 em intervalos de 1 hora ao longo de 3 horas. O TEER é calculado pela Lei de Ohm.
  7. Para confirmar a integridade do tecido epitelial bucal e sublingual porcina, use FD-4 (0,05 mM) como marcador fluorescente.
    NOTA: Todos os experimentos são realizados em triplicado, e os resultados relatados correspondem à média ± DS de três conjuntos de dados.

6. detecção uHPLC do GLP-1 RA

  1. Quantifique a quantidade de GLP-1 RA permeada através de oromucosas montadas em FDCs e insertos, de cada uma das soluções do lado doador, HTCs e filmes por uHPLC usando uma coluna CSH C18 (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) com fase móvel de 0,1% TFA em acetonitrila (Eluente A) e 0,1% TFA em água (Eluente B), elusão gradiente ao longo de 8 min a 30 °C, com volume de injeção de 20 μL e vazão de 0,7 mL/min, e detecção UV em 214 nm (tempo de retenção: ~4,2 min).
  2. Realize um estudo de linearidade.
    1. Projetar um estudo de linearidade para estimar a resposta analítica das condições otimizadas de uHPLC usando padrões de calibração GLP-1 na faixa de 2,5–20,0 μg·mL⁻1.
    2. Prepare padrões de calibração (n = 6–8 níveis) independentemente e injete amostras em triplicado. Realize uma regressão linear de mínimos quadrados da área de pico (mAU) versus concentração nominal, e avalie a linearidade usando o coeficiente de determinação (r2), o % de intercepto y e a distribuição dos resíduos (resposta observada–prevista).
      NOTA: A inspeção visual do gráfico de calibração e do gráfico dos resíduos indicou um desvio insignificante da linearidade no menor nível de sensibilidade (2,5 μg·mL⁻1), com resíduos dentro do limite de aceitação predefinido (±3%). A faixa de calibração é subsequentemente restrita a uma faixa de 2,5–20,0 μg·mL⁻1, na qual a regressão mostrou linearidade aceitável (r2 ≥ 0,999, % de intercepto y < 2%, e todos os resíduos dentro de ±3%).

7. Estimativa do GLP-1RA retido no tecido bucal

  1. Remova as mucosas epiteliais buccais porcinais expostas à GLP-1 AR e GDC dos FDCs/inserts.
  2. Enxágue o tecido três vezes com PBS para remover excipientes adsorvidos de medicamentos e filmes.
  3. Em seguida, homogeneize o tecido em 5 mL de PBS usando um homogeneizador de mesa até que esteja completamente fragmentado.
  4. Armazene a amostra durante a noite a 4 °C para permitir o equilíbrio da partição peptídica entre tecido homogeneizado e PBS.
  5. Em seguida, centrifuge a mistura a 5000 × g por 5 minutos para precipitar os fragmentos e coletar o sobrenadante para quantificação.
  6. Esterilize o sobrenadante através de filtros centrífugas de 0,22 μm para remover partículas residuais antes da análise do uHPLC.

8. Histologia do tecido oromucoso

NOTA: Após 3 horas de permeação da AR GLP-1 proveniente de misturas, HTCs ou filmes, as mucosas são processadas para avaliação dos danos.

  1. Fixe os tecidos com 10% de formalina por 48 horas e depois insome os tecidos fixos na parafina.
  2. Seccione os tecidos em um tamanho de 5 μm usando um micrótomo.
  3. Em seguida, colorir os tecidos com hematoxilina e eosina (HE) para examinar a integridade histológica usando microscopia óptica a 4× de ampliação.
  4. As lâminas são analisadas com um microscópio vertical e analisadas usando software de análise de imagem.
    NOTA: O fluxo de trabalho geral é resumido na Figura 4.

Resultados

Isolamento e dissecação dos tecidos epiteliais buccais suínos
A mucosa bucal suína é amplamente usada como tecido substituto para oromucosas humanas porque compartilham características anatômicas comparáveis e propriedades de barreirafisiológica 29. Os tecidos epiteliais buccais suínos são isolados tanto por métodos cirúrgicos quanto de aquecimento, como mostrado na Figura 4. Inicialmente, o bisturi é usado para remover músculos e tecidos conjuntivos mais profundos das bochechas. Os pedaços isolados de tecido com camadas mucosas combinadas e intactas e tecido conjuntivo são então colocados em PBS quente aquecido a 65 °C por 3 minutos. O tecido é removido do tampão, e o epitélio e a lâmina própria subjacente são retirados com pinças tamanho 5. O aquecimento permite uma espessura consistente e uniforme no epitélio dissecado resultante.

Permeação ex vivo de um GLP-1RA através de oromucosas bucais suínas montadas em FDCs e insertos impressos em 3D
A permeação ex vivo do GLP-1RA foi avaliada utilizando mucosas do tecido epitelial bucal porcino montadas em FDCs e insertos. Para avaliar a razão ótima de concentração do GLP-1 RA: GDC, HTCs contendo almofadas de algodão com área de 12,7 mm foram fixados no lado doador das mucosas montadas em FDCs, e a mistura peptídico-potenciador foi pipetada no algodão. A permeação acumulada da AR GLP-1 atingiu aproximadamente 4,3% ao longo de 3 horas quando a GDC foi incluída em proporção 1:1 (GLP-1RA 25 mg; GDC 25 mg). Em contraste, na ausência de GDC, nenhum fluxo detectável de GLP-1RA foiobservado 27. Parâmetros quantitativos de permeabilidade, incluindo aaplicação P, são calculados usando a seguinte fórmula:

P app =figure-results-1

Onde:
P app: coeficiente de permeabilidade aparente (cm/s).
dQ/dt: taxa de transporte do GLP-1RA em estado estacionário, calculada como a quantidade de peptídeo transportada por unidade de tempo (μg/s).
A: área do insert 3D (cm2).
Co: a concentração inicial do peptídeo no compartimento doador (apical) (μg/mL).

O coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) do GLP-1RA nas mucosas bucais suínas é mostrado na Figura Suplementar 2. Quando a relação GLP-1RA:GDC era 1:1, as mesmas concentrações dos HTCs eram incorporadas em filmes de duas camadas; no entanto, a permeação do GLP-1RA em tecidos buccais suínos isolados não foi quantificável usando a configuração convencional de FDC, pois a apresentação do GLP-1RA dos filmes para as mucosas é mais lenta do que a partir de misturas em solução ou de HTCs. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos inserts personalizados de baixo volume impressos em 3D para reduzir o volume do receptor para 1,5 mL, melhorando assim a sensibilidade da detecção. Usando inserts 3D, a permeação acumulada de GLP-1RA a partir de filmes bucais ao longo de 3 horas foi mensurável e atingiu aproximadamente 1,8%, conforme mostrado na Figura 5. Os valores TEER e fluxos FD-4 foram usados para avaliar a integridade da barreira epitelial e a permeabilidade paracelular. Uma queda dependente do tempo no TEER foi observada (Figura Suplementar 3) nos grupos de tratamento e correspondeu ao aumento da permeação do GLP-1RA. PBS e tecidos tratados com filme em branco não apresentaram alterações no TEER, indicando que a matriz de filme em duas camadas não rompeu a barreira. Esses dados implicam a GDC como o principal contribuinte para o efeito de potencialização da permeação.

Avaliação histológica do tecido suíno
Foi realizada uma avaliação histológica da mucosa bucal suína ex vivo para avaliar o impacto dos métodos de isolamento de tecidos e examinar a integridade epitelial após 3 horas de exposição ao GLP-1RA e GDC. Como mostrado na Figura 6, tecidos recém-isolados obtidos pelo método de aquecimento preservaram a arquitetura fisiológica epitelial normal, com camadas estratificadas intactas e muco contínuo na superfície, e não apresentaram evidências de danos estruturais. Em contraste, tecidos isolados por separação mecânica ou submetidos a armazenamento/congelamento apresentaram pequenas alterações na morfologia das células epiteliais e redução na espessura do muco superficial. Mucosas bucais expostas a 25 mg de GLP-1RA na presença de 25 mg de GDC mantiveram a integridade epitelial e se assemelhavam muito aos controles não tratados. Foram observados apenas edema leve e erosão epitelial superficial. Exposição ao GLP-1RA isoladamente ou a blank e GLP-1RA: Filmes de duas camadas carregados com GDC não produziram danos visíveis nos tecidos, e as características histológicas foram comparáveis às dos tecidos controle tratados com PBS.

figure-results-2
Figura 1: Cavidade bucal suína mostrando áreas mucosas bucal e sublingual. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 2: FDCs e componentes. Seis câmaras estão montadas em um sistema integrado (à esquerda). Um indivíduo, Franz Cell, é mostrado (meio). O sistema de montagem para tecido bucal em uma câmara individual (à direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 3: Componentes de inserts de resina 1cm 2 impressos em 3D. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 4: Fluxo de trabalho para isolamento, montagem, permeação e processos histológicos de epitélio bucal suíno. Criado em BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-6
Figura 5: Quantidade acumulada do GLP-1 RA. Quantidade cumulativa ex vivo do GLP-1 AR permeou o lado receptor da mucosa epitelial bucal suína após 180 minutos de aplicação de 25 mg/mL de GLP-1RA (Vermelho), 25 mg/mL de GLP-1RA: 25 mg/mL de solução GDC (Preto) e 25 mg/mL de GLP-1RA: 25 mg/mL de GDC carregado em filmes (roxo) aplicados por HTC, FDC e inserts 3D. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-7
Figura 6: Imagens microscópicas coloridas com HE de mucosas epiteliais buccais suínas sob diferentes condições de exposição. (A) filme em branco, (B) mistura aquosa de GLP-1RA: GDC, (C) filmes presos com GLP-1RA:GDC, (D) mucosas isoladas de tecido fresco após tratamento térmico (65 °C), (E) epitélio bucal isolado de tecido congelado após tratamento térmico, (F) mucosas isoladas por método mecânico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Composição da camada mucoadesiva
ComponentesConcentração (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glicerol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Camada de suporte
Etila celulose5 mg
Propilenoglicol5 mg

Tabela 1: Composição do mucoadesivo e das camadas de fundo do filme bucal.

Figura suplementar 1: Adsorção de GLP-1RA após incubação de 0,5 mg de GLP-1RA por 6 horas com insertos 3D. Os dados são a média ± DS de três experimentos (n = 3).Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) de um GLP-1RA após exposição a 3 horas do tecido mucoso bucal suíno montado em insertos 3D. Solução de 25 mg/mL de GLP (vermelho), 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de solução aquosa de GDC (preto) e 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de GDC incorporado em filmes bucais (roxo). Os dados representados são a média ± SD (n = 3). Significância estatística entre os grupos foi observada: p < 0,05. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Resistência transepitelial (TEER). Redução gradual da resistência transepitelial (TEER) a partir de tecido epitelial bucal porcino isolado fixado em insertos 3D, após exposição a 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de solução de GDC (vermelho), 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de GDC em filmes bucais (verde) e 25 mg/mL de GLP-1RA em PBS (azul). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Integridade e vazamento tecido. A integridade e o vazamento do tecido foram avaliados expondo tecidos epiteliais buccais porcinos em insertos 3D a 0,05 mM FD4 no lado doador. As amostras foram retiradas em intervalos fixos de 60 minutos ao longo de 6 horas. Média +DS de três experimentos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Detalhes experimentais adicionais.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Essa metodologia descreve protocolos experimentais para o isolamento de epitélios buccais e outros epitélios oromucosos suínos, juntamente com ensaios de permeabilidade para terapêuticos à base de peptídeos usando um análogo estável de GLP-1RA de baixa potência comoexemplo 30. Peptídeos são macromoléculas hidrofílicas com permeabilidade desprezível através das membranas mucosas17. A execução bem-sucedida do protocolo acima depende do isolamento preciso e da montagem da mucosa bucal e sublingual. O isolamento exige habilidade especializada e rigoroso controle de temperatura; Mesmo pequenas flutuações térmicas durante o processo de aquecimento podem induzir alterações fisiológicas e morfológicas prejudiciais no tecido epitelial, comprometendo, em última análise, a integridade dos dados de permeação. Além disso, a fixação do tecido isolado dentro dos inserts personalizados impressos em 3D representa uma etapa crítica. Dada a natureza delicada das camadas epiteliais, há um risco maior de ruptura ou vazamento do tecido durante a montagem. Para mitigar isso, utilizamos um teste de vazamento FD4, que serve como medida de controle de qualidade para garantir a integridade da membrana antes de iniciar os estudos de fluxo. O vazamento FD4 foi inicialmente avaliado visualmente e ainda quantificado usando espectroscopia UV-visível. Os dados correspondentes são fornecidos nos dados suplementares (Figura Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 3).

A CDF convencional, considerada padrão para estudos ex vivo , frequentemente apresenta desafios na quantificação de terapêuticas peptídicas devido aos altos volumes na câmara receptora, tipicamente 10 mL. O alto volume leva à diluição excessiva da amostra, embocando as concentrações de peptídeos permeados abaixo do LOD mais baixo para métodos analíticos padrão. Para evitar isso, desenvolvemos um novo insert impresso em 3D que imita a escala e os volumes do sistema transwells usado para monocamadas de células epiteliais, incluindo oCaco-2 31. Os inserts podem ser colocados diretamente em placas padrão de cultura de tecido de 12 poços e acomodam de forma segura mucosas epiteliais buccais suínas isoladas. Essa modificação reduz significativamente o volume do compartimento doador quase 7 vezes para 1,5 mL, concentrando-se assim no analito e superando limitações de sensibilidade do uHPLC. Essa adaptação é particularmente importante para a quantificação de medicamentos peptídicos de baixa permeabilidade e custosos.

Foi observado um aumento na permeação de GLP-1 RA na presença de GDC usando o sistema de inserção 3D. A quantidade acumulada permeada de GLP-1RA atingiu ~55,3 μg em 3 horas, correspondendo a ~4,3% da concentração inicialmente aplicada no lado doador. Em contraste, nenhum fluxo mensurável de GLP-1 RA foi detectado quando concentrações semelhantes de GLP-1RA e GDC aprisionadas em filmes bucais foram aplicadas em mucosas bucais montadas em FDCs, sugerindo que pode ter ocorrido permeação peptídica, mas permaneceu analiticamente indetectável devido à diluição excessiva no grande volume do receptor. No entanto, a permeação cumulativa de GLP-1 RA da formulação de filme bucal em duas camadas atingiu aproximadamente 1,8% em 3 h em inserções 3D ao longo de 3 horas, demonstrando a viabilidade de detectar o transporte peptídico de baixo nível através do tecido bucal a partir das formas dosais usando o sistema de receptores miniaturizado. A permeação ex vivo da GLP-1 RA também foi avaliada usando CTT contendo um algodão carregado com o peptídeo e o GDC. Este é um dispositivo inicial de triagem muito útil para provar o conceito de que a apresentação de um peptídeo a partir de filmes com um realçador de permeação pode ser possível. A integridade da barreira do epitélio bucal suíno pode ser monitorada durante o experimento usando TEER e vazamento FD-4. Uma diminuição lenta e dependente do tempo na TEER foi observada durante a exposição ao agonista do receptor GLP-1 (GLP-1 AR), o que é consistente com o aumento do transporte paracelular induzido nas mucosas bucais pelo salbiliar 32.

Uma limitação dessa técnica é a dependência de tecido suíno fresco, que nem sempre está disponível sob demanda nos matadouros, e a qualidade do tecido pode variar. Para enfrentar as limitações de obter tecido fresco a uma distância razoável do laboratório, avaliamos a crioproteção para armazenar amostras de alta qualidade que poderíamos usar posteriormente. Embora o uso de tecido fresco seja o ideal, o uso de tecidos mucosos armazenados isolados requer o uso cuidadoso de crioprotetores e taxas de congelamento para evitar a formação de cristais de gelo e danos subsequentes à barreira. O protocolo tem a capacidade de fazer a ponte entre estudos padrão de permeação em macroescala e análise de peptídeos de alta sensibilidade. Ao otimizar tanto o processo de isolamento de tecidos quanto o protocolo de permeação usando inserts 3D, alcançamos um grau maior de reprodutibilidade e sensibilidade do que normalmente relatado com FDCs. Além disso, o uso de inserts 3D oferece uma estrutura para que pesquisadores forneçam limites de detecção para moléculas peptídicas caras, representando uma melhoria significativa na flexibilidade e no fluxo de dados da pesquisa mucosa ex vivo .

Esses protocolos fornecem uma base para a medição confiável da permeação do tecido mucoso usando classes de fármacos além dos peptídeos. A capacidade de gerar perfis de permeação de alta resolução a partir de modelos ex vivo auxiliará nas previsões para dados de absorção pré-clínica derivados de modelos animais. A permeação ex vivo da RA GLP-1 também foi avaliada usando HTCs contendo um algodão carregado com o peptídeo e GDC, uma solução potenciadora de permeação. Essa abordagem de entrega garantia um contato íntimo e reprodutível entre a mistura e a superfície mucosa. Foi observado um aumento significativo na permeação de GLP-1RA com razão 1:1 de GDC em inserções 3D que imitam transpoços. Este é um dispositivo de triagem muito útil para provar o conceito de que a apresentação de um peptídeo a partir de filmes com um realçador de permeação pode ser possível em um desenho construído adaptado de monocamadas cultivadas de células epiteliais para mucosas teciduais. A integridade da barreira do epitélio bucal suíno pode ser monitorada durante o experimento usando medição TEER e vazamento FD4.

No geral , as avaliações ex vivo de permeação e histológicas demonstram que a avaliação confiável do transporte peptídico bucal e sublingual na presença de um realçador de permeação depende da preparação do tecido, protocolos de fluxo e sensibilidade analítica. Entre as abordagens de isolamento examinadas, a separação do epitélio bucal e sublingual suíno recém-extraído usando o método térmico proporcionou um bom equilíbrio entre a manutenção da integridade epitelial e a reprodutibilidade da dissecção tecidual, como evidenciado pela TEER basal estável, vazamento mínimo de FD4 e preservação das estruturas celulares do tecido. Importante, o insert impresso em 3D melhorou significativamente a confiabilidade experimental ao reduzir a diluição do compartimento receptor, permitindo a quantificação de fluxos peptídicos baixos que eram indetectáveis em FDCs. Em conjunto, esses achados apoiam o uso de mucosas epiteliais buccais suínas isoladas em uma câmara de inserção de tecido como plataforma ex vivo para avaliação da administração bucal de peptídeos terapêuticos para entrega sistêmica.

Divulgações

Os autores não têm envolvimento financeiro ou conflito de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Ben Shovlin (Escola de Medicina Veterinária da UCD) pela assistência técnica. Também agradecemos ao Dr. Hans Eckhardt (Escola de Química da UCD) pelo apoio na análise do uHPLC. Este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon Europe da União Europeia, sob o número de subvenção 101071054. Também reconhecemos o apoio adicional de financiamento da Subvenção Número 13/RC/2073_P2, do Research Ireland CURAM Center for Medical Devices e do Fundo Europeu de Desenvolvimento. Os autores gostariam de agradecer a Kenneth McNamara, da Rosderra Irish Meats, pela oferta de bochechas de porco.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Computer / LaptopGenéricoQualquer sistema padrão≥8 GB RAM recomendado
Script de aquisição de dadosPersonalizadocollect.pyScript de aquisição baseado em Python
Eletrodos de gel descartáveisGenéricoEletrodos Ag/AgCl pré-geladosUso único, adesivo
Módulo de aquisição EEGUpside Down LabsBioAmp EXG PillFront-end analógico para sinais de biopotencial
Gel de eletróde (se forem usados elétrodos reutilizáveis)GenéricoGel condutorMelhora a condutividade do sinal
Aplicação interativa (jogo)GenéricoQualquer jogo simples (por exemplo, corrida)Interface controlada por teclado
Fios de conexãoGenéricoConectores Macho-FêmeaFios de breadboard padrão
Matplotlib / SeabornOpen-sourceVersões mais recentesBibliotecas de visualização
Placa de microcontroladorArduinoUno / Maker UnoADC de 10 bits, interface USB
Ambiente de programação PythonPython Software FoundationPython ≥3.8Linguagem de programação open-source
Biblioteca PyTorchMeta AIVersão ≥1.12Framework de aprendizado profundo
Scikit-learnOpen-sourceVersão estável mais recenteUtilitários de ML
Bibliotecas de processamento de sinalSciPyVersão mais recenteFiltragem, STFT
Cabo USBGenéricoUSB Tipo-A para BCabo de transferência de dados

Referências

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Permea o de Pept deosModelo Ex VivoMucosa BucalC lulas de Difus o de FranzInsertos Impressos em 3DPotencializador de Permea oResist ncia El trica TransepitelialFilmes MucoadesivosCromatografia L quida de Ultra Alta Efici ncia
Um Modelo Padronizado Ex Vivo de Oromucosas Suínas para Avaliação de Fluxos de Peptídeos
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.