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Estratégias de Imagem para Intervenção com Acupuntura em Camundongos Modelo da Doença de Alzheimer

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DOI:

10.3791/70998

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21 de abril de 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma estratégia de micro-PET in vivo combinada com ensaios comportamentais e moleculares para avaliar dinamicamente os efeitos da eletroacupuntura na deposição de β-amiloide e na função cognitiva em um modelo murino com doença de Alzheimer.

Resumo

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado principalmente por disfunção cognitiva progressiva. Uma de suas características patológicas típicas é a formação de placas senis no cérebro devido à deposição de proteínas β-amiloide (Aβ). A acupuntura demonstrou potencial na prática clínica para melhorar a função cognitiva em pacientes com DA. No entanto, seus efeitos dinâmicos sobre a patologia Aβ exigem elucidação objetiva por meio de abordagens tecnológicas modernas. A tomografia por emissão de micropósitrons (micro-PET) fornece uma ferramenta poderosa para observação in vivo e não invasiva da deposição de Aβ nos cérebros de camundongos modelo de Alzheimer. Neste protocolo, detalhamos uma estratégia de imagem utilizando [18F]AV-45 micro-PET para avaliar os efeitos da intervenção eletroacupuntura, complementada por testes comportamentais Morris Water Maze e análise molecular Western blot. A abordagem integrada permite a visualização e quantificação da progressão patológica do Aβ nos cérebros de camundongos modelo de Alzheimer. Isso fornece evidências objetivas e quantitativas para explorar o efeito regulatório da acupuntura na deposição de Aβ. Integrando os princípios da medicina tradicional chinesa com as modernas tecnologias de imagem molecular e biologia molecular.

Introdução

O monitoramento in vivo da deposição de β-amiloide(Aβ) no cérebro é crucial para avaliar a progressão patológica da AD1. Após a aplicação clínica de terapias com anticorpos direcionados a Aβ (por exemplo, Lecanemab), a avaliação longitudinal e quantitativa da carga cerebral de Aβ usando PET tornou-se um padrão ouro para determinar a eficáciaterapêutica 2. Embora a acupuntura tenha demonstrado potencial em estudos pré-clínicos para modular o metabolismo de Aβ, as abordagens tradicionais de pesquisa têm dependido em grande parte de análises ex vivo, carecendo de ferramentas eficazes para a avaliação direta e objetiva de seu impacto dinâmico na deposição de Aβ em organismos vivos. Nos últimos anos, avanços nas tecnologias de imagem molecular criaram oportunidades para preencher essa lacuna. o micro-PET permitiu a observação longitudinal não invasiva da deposição de Aβ em camundongos modeloAD 1. Mais importante ainda, novas estratégias de imagem estão evoluindo de abordagens de alvo único para paradigmas multimodais. Por exemplo, estudos confirmaram que diferentes subtipos estruturais de fibrilas Aβ apresentam afinidades de ligação variadas aos traçadores PET comumente usados, aumentando novas demandas por quantificaçãoprecisa 3. Simultaneamente, técnicas emergentes como a imagem neuroimune (por exemplo, TSPO PET) e avaliações da função da barreira hematoencefálica oferecem perspectivas sem precedentes para elucidar de forma abrangente os complexos mecanismos patológicos da DA e os efeitos multi-alvo das intervençõesterapêuticas 4.

Com base nessa base, este estudo visa desenvolver uma estratégia avançada de micro-PET de imagem, utilizando as sondas específicas de Aβ mais recentes, para avaliar de forma dinâmica e quantitativa o impacto da intervenção de acupuntura na deposição de Aβ nos cérebros de camundongos modelo de Alzheimer in vivo. O estudo não apenas validará a eficácia terapêutica da acupuntura, mas também buscará fornecer evidências diretas de seus mecanismos subjacentes no nível de imagem molecular.

Protocolo

Conduzir todos os experimentos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitidas pelos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Experimental em Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (nº: bucm-4-2021102707-5421).

1. Preparação de animais experimentais

  1. Obtenha mouses machos APP/PS1 de 6 meses e camundongos C57BL/6 com idade e gênero correspondentes pesando 28,0 ± 2,0 g.
  2. Alojar os camundongos em gaiolas padrão a uma temperatura ambiente de 24 ± 2 °C com umidade de 40% a 60%.
    NOTA: Os animais foram alojados em gaiolas padrão no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, Universidade Médica da Capital.
  3. Mantenha os animais sob um ciclo padrão de 12 horas luz/escuro (período escuro: 20h00 às 8h00) com acesso livre a comida e água. Troque a roupa de cama diariamente para garantir condições de moradia limpas e secas.
  4. Aclimate os animais ao ambiente de laboratório por 7 dias. Comece os experimentos no oitavo dia após a aclimatação.

2. Agrupamento e intervenções de animais

  1. Atribuir aleatoriamente vinte camundongos machos machos APP/PS1 de 6 meses para um grupo modelo da doença de Alzheimer (grupo DA, n = 10) e para um grupo de eletroacupuntura (grupo EA, n = 10). Atribuír dez camundongos C57BL/6N com idade e sexo a um grupo controle normal (grupo N, n = 10).
  2. Identifique os três pontos de acupuntura na cabeça para a intervenção: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) e GV29 (Yintang).
    NOTA: A localização dos pontos de acupuntura é baseada no "Atlas de Pontos de Acupuntura Animal" formulado pela Sociedade de Pesquisa em Acupuntura Experimental da Associação Chinesa de Acupuntura-Moxibusção. O GV20 está situado no ponto médio entre as pontas de ambas as orelhas; GV29 está localizado no ponto médio entre as extremidades mediais das sobrancelhas; e GV26 está localizada abaixo do septo nasal do camundongo, na junção dos dois terços inferiores e do terço superior da linha média da fenda labial. O diagrama esquemático é mostrado na Figura 1.
  3. Administre estimulação por eletroacupuntura ao grupo EA uma vez ao dia por 20 minutos ao longo de 15 dias consecutivos.
    1. Prenda o mouse com segurança usando mangas de retenção de tecido idênticas e personalizadas. Certifique-se de que o corpo esteja confortavelmente enrolado enquanto a cabeça permanece totalmente exposta para uma inserção precisa da agulha e respiração normal.
    2. Prepare agulhas descartáveis estéreis para acupuntura (0,25 mm × 13 mm).
    3. Aplique um método rápido de picada (inserção rápida e retirada imediata sem retenção) no ponto de acupuntura GV26 (Shuigou) usando a agulha estéril de acupuntura.
    4. Conecte as alças das agulhas em GV20 e GV29 aos clipes de saída de um aparelho eletrônico de eletroacupuntura.
    5. Ajuste os parâmetros de estimulação do aparelho para fornecer uma onda contínua e esparsa, com frequência de 2 Hz, tensão constante de 2 V e intensidade de corrente de 0,1 mA.
    6. Observe o rato atentamente e verifique se a intensidade da estimulação induz um leve tremor rítmico na cabeça do rato.
  4. Manter camundongos nos grupos N e AD sob condições idênticas de habitação, sem qualquer intervenção. Submeter os grupos N e AD aos mesmos procedimentos diários de manuseio e contenção que o grupo EA durante o período de 15 dias para garantir consistência nas condições experimentais.

3. O teste do labirinto aquático Morris (MWM)

NOTA: A estrutura comportamental (Morris Water Maze) se baseia em nosso trabalhoanterior 5.

  1. Preparação de aparelhos
    1. Coloque um tanque circular de água (90 cm de diâmetro, 50 cm de profundidade) na sala de testes. Encha o tanque com água (22 ± 2 °C) até uma profundidade de 30 cm.
    2. Adicione 0,5 kg de leite desnatado em pó à água para deixá-la opaca. Divida virtualmente o tanque em quatro quadrantes iguais (I, II, III e IV).
    3. Posicione uma plataforma de escape (circular, 5 cm de diâmetro, 28 cm de altura) no centro do quadrante I.
    4. Coloque pistas visuais distintas de diferentes formas na parede interna de cada quadrante para ajudar o mouse a aprender e memorizar a localização da plataforma.
    5. Monte uma câmera digital 2 m acima do centro do tanque, no teto, e conecte-a a um sistema de aquisiçãode imagem 6.
  2. Habituação
    1. Remova a plataforma do tanque no dia anterior ao teste da plataforma oculta. Permita que o rato nade livremente no aquário por 90 segundos de manhã e à tarde para se aclimatar ao ambiente experimental.
  3. Teste de plataforma oculta
    1. Realize o teste da plataforma oculta por cinco dias consecutivos.
    2. Selecione os pontos de partida do segundo, terceiro e quarto quadrantes, respectivamente, garantindo que cada ponto de partida esteja equidistante do centro do tanque.
    3. Coloque o rato na água, de frente para a parede do aquário. Permita que o camundongo observe o ambiente por 10 segundos após ser colocado na água.
    4. Grave a latência de escape e o caminho de natação se o mouse localizar a plataforma oculta e permanecer nela por 5 segundos dentro de um limite de 60 segundos. Guie o mouse manualmente para a plataforma se ele não encontrar a plataforma em até 60 s.
    5. Permita que o animal permaneça na plataforma por 10 segundos para observar e memorizar o local, e registre a latência de fuga como 60 segundos.
  4. Teste de sonda espacial
    1. Remova a plataforma oculta do tanque após cinco dias consecutivos de treinamento com plataformas ocultas.
    2. Coloque cada rato na água a partir de um dos pontos de partida localizados no segundo, terceiro ou quarto quadrante. Deixe o rato nadar livremente por 60 segundos. Registre o caminho de natação e o tempo passado no quadrante-alvo (quadrante I).
    3. Devolva todos os camundongos às gaiolas imediatamente entre os testes para minimizar o contato direto com o experimentador.

4. Análise do Western blot

  1. Eutanasiar seis camundongos por grupo 24 horas após a conclusão da intervenção de 15 dias. Dissecar e isolar rapidamente tecidos frescos do hipocampo no gelo.
  2. Pese os tecidos do hipocampo e coloque-os em tubos de microcentrífuga pré-resfriados. Adicione um buffer de lise RIPA frio suplementado com um coquetel inibidor de protease a 1% e um coquetel inibidor de fosfatase a 1% na proporção de 10 μL de buffer por 1 mg de tecido.
  3. Homogeneize os tecidos completamente usando um homogeneizador mecânico de tecidos em gelo. Centrifuge os homogeneados a 12.000 x g por 15 minutos a 4 °C para remover detritos celulares. Colete cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga pré-resfriado.
  4. Misture as amostras de proteína com um tampão de carga de 5× SDS e ferva a mistura a 95 °C por 10 minutos para desnaturalizar completamente as proteínas. Carregue quantidades iguais de proteína (20 μg) por poço em um gel SDS-PAGE de 15%. Inclua um marcador de peso molecular de proteína pré-colorido em um poço adjacente.
  5. Faça funcionar o gel de empilhamento em uma tensão constante de 80 V por 30 minutos e então resolva as proteínas no gel separador a 120 V até que a frente do corante azul de bromofenol alcance o fundo do gel.
  6. Transfira as proteínas separadas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm a uma corrente constante de 250 mA por 90 minutos sobre gelo. Bloqueie a membrana PVDF com leite desnatado desnatado 5% dissolto em soro salino tampado com Tris-buffer, contendo 0,1% de Tween 20 (TBST) por 1 hora em temperatura ambiente, com agitação suave em um shaker.
  7. Incubar a membrana com um anticorpo primário contra Aβ (diluído [1:1000] em tampão bloqueante) e um anticorpo primário contra GAPDH (diluído [1:5000] em tampão bloqueante) durante a noite a 4 °C em um shaker horizontal. Incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) (diluído [1:2000] em tampão bloqueador) por 1 hora em temperatura ambiente.
  8. Lave a membrana três vezes com TBST por 10 minutos cada para remover os anticorpos secundários não ligados.
  9. Aplique um substrato de quimioluminescência (ECL) aprimorada à membrana e capture o sinal usando um sistema de imagem por quimioluminescência.
  10. Quantifique as intensidades das bandas proteicas usando o software ImageJ (versão 1.53a). Normalize os valores em escala de cinza das bandas-alvo para os do GAPDH e calcule os níveis relativos de expressão das proteínas de interesse.

5. [18F]Radiossíntese AV-45

  1. Realize radiomarcação por substituição nucleofílica de 3,0 mg do composto precursor por [18F]KF.
  2. Purifique o produto usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para alcançar uma pureza radioquímica (RCP) superior a 95%.
  3. Dissolva o composto marcado em etanol.
  4. Dilua a solução com cloreto de sódio a 0,9% e prepare o produto final em etanol 10% para usosubsequente 7.

6. Imagem PET in vivo

  1. Selecione quatro camundongos aleatoriamente de cada grupo experimental.
    1. Coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento de água circulante (37 °C) ou sob uma lâmpada aquecedora por 5 a 10 minutos antes do procedimento para promover a vasodilatação das veias caudais.
    2. Prenda o rato em um restritor cilíndrico transparente adequado, deixando a cauda totalmente exposta. Desinfete a cauda e visualize ainda mais as veias laterais da cauda limpando a pele com um swab de etanol a 70%.
  2. Retirar o radiorastreador AV-45 formulado[18F] em uma seringa de insulina de 0,5 mL equipada com uma agulha. Prepare um volume de injeção de aproximadamente 100–150 μL para alcançar uma dose alvo de radioatividade de 3,0 MBq (pureza radioquímica > 95%)2.
  3. Meça e registre a radioatividade inicial da seringa cheia de rastreador usando um calibrador de dose.
  4. Insira a agulha, biselando para cima, em um ângulo raso (aproximadamente 10°–20°) na veia lateral da cauda. Espere 60 minutos após a administração, então anestesie o camundongo por inalação de isoflurano a 2%.
  5. Posicione o mouse e faça um PET estático tridimensional de 15 minutos.
  6. Reconstrua os dados PET usando um algoritmo tridimensional de maximização de expectativa ordenada por subconjunto (OSEM).
  7. Processe os dados reconstruídos com o software PMOD (versão 4.5).
    1. Co-registrar os dados em um modelo cerebral adequado para camundongos de pequeno a médio porte dentro do módulo de fusão PMOD. Permita que o software delinee automaticamente as regiões de interesse (ROIs) no cérebro do camundongo.
  8. Calcule os valores padronizados de captação (SUVs). Obtenha a razão padronizada de valor de absorção (SUVR) comparando o SUV de cada ROI com o docerebellum 8.
    NOTA: A variabilidade aceitável na dose administrada (2,0–3,8 MBq) acomoda as flutuações diárias do rendimento do radiotracador e o peso corporal individual dos camundongos. Como as quantificações subsequentes dependem da razão padronizada de valores de captação (SUVR) — que normaliza a região-alvo em relação a uma região de referência (cerebelo) — as variações absolutas de dose dentro dessa faixa não comprometem os resultados comparativos de imagem. A tomografia por emissão de micropósitrons (Micro-PET) é mostrada na Figura 2.

7. Análise estatística

  1. Realize todas as análises estatísticas usando o software SPSS (versão 19.0).
  2. Apresente os dados como média ± desvio padrão (DS).
  3. Aplique ANOVA unidirecional para analisar os resultados do teste da plataforma oculta.
  4. Analise os dados do teste de sonda espacial e da imagem PET usando ANOVA de medidas repetidas ou ANOVA unidirecional, seguido por testes pós-hoc de LSD para comparações par a par.

Resultados

Efeito da eletroacupuntura na função cognitiva em camundongos APP/PS1

Para avaliar a capacidade de aprendizagem espacial, os camundongos passaram por testes de treinamento do dia 1 ao dia 5. No teste da plataforma oculta (Figura 3A,B), a latência de escape dos camundongos em todos os grupos mostrou uma tendência decrescente durante o período de treinamento. Comparado ao grupo N, o grupo DA apresentou uma latência de escape significativamente prolongada (p < 0,05), indicando déficits pronunciados de aprendizagem e memória em camundongos APP/PS1 de 6 meses de idade. A latência de escape no grupo AD foi significativamente maior do que na N e EA (p < 0,01). Notavelmente, no quinto dia, a latência de escape no grupo EA foi significativamente menor do que na grupo AD (p < 0,05) (Figura 3C). Após o período de treinamento de 5 dias, a memória espacial foi avaliada usando o teste de sonda espacial. A razão entre o tempo gasto nadando no quadrante alvo (plataforma) e o tempo total de natação foi calculada; uma proporção maior indica melhor retenção de memória. Os resultados mostraram que a razão de tempo de natação no grupo da AD foi significativamente menor do que na do grupo N (p < 0,01). Em contraste, o grupo EA apresentou uma razão significativamente maior em comparação com o grupo DA (p < 0,01). No entanto, a razão no grupo EA permaneceu menor do que a do grupo N (p < 0,05) (Figura 3D).

O número de passagens de plataforma, que reflete a precisão da memória espacial, também foi analisado. Um número maior de cruzamentos sugere melhor retenção de memória. O grupo AD apresentou significativamente menos passagens de plataforma do que o grupo N (p < 0,05), enquanto o grupo EA apresentou um aumento significativo em comparação com o grupo AD (p < 0,05). No entanto, o grupo EA ainda apresentava menos cruzamentos do que o grupo N (p < 0,05) (Figura 3E).

Efeitos da eletroacupuntura na deposição de Aβ no hipocampo do microfone APP/PS1e

A deposição de Aβ foi avaliada usando imagem PET, e a razão padronizada de valores de captação (SUVR) do traçador Aβ radiomarcado foi calculada no hipocampo de camundongos APP/PS1 (Figura 4A). As micro-PET scans revelaram que tanto o grupo N quanto o grupo EA apresentaram valores significativamente menores de SUVR em comparação com o grupo AD (Figura 4B). Análises quantitativas adicionais confirmaram que o SUVR e o Aβ do hipocampo no grupo EA foram significativamente maiores do que os do grupo N (p < 0,05), enquanto permaneceram significativamente menores do que no grupo DA após intervenção eletroacupuntura (p < 0,05) (Figura 4C).

Efeitos da eletroacupuntura na expressão da proteína Aβ

Após as avaliações comportamentais e de imagem, a expressão da proteína Aβ no hipocampo foi avaliada por análise Western blot (Figura 5A). A análise quantitativa revelou que a expressão relativa de Aβ no grupo AD foi significativamente elevada em comparação com o grupo N (p < 0,05). O grupo EA apresentou uma redução significativa na expressão de Aβ do hipocampo em comparação ao grupo da DA (p < 0,05). No entanto, os níveis de expressão no grupo EA permaneceram mais altos do que os do grupo N, indicando que, embora a intervenção tenha efetivamente atenuado o acúmulo de Aβ, não eliminou completamente as placas existentes (Figura 5B).

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Figura 1: Diagrama esquemático mostrando as localizações dos pontos de acupuntura GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) e GV29 (Yintang) em camundongos. Essa figura foi reutilizada com permissão de Sun et al.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Tomografia por emissão de micropósitrons (Micro-PET). O IRIS PET/CT (Inviscan) é um sistema de imagem pré-clínico para camundongos e ratos, apresentando alta sensibilidade (>9%) e resolução espacial de 1 mm, com campo axial de visão de 96 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Efeito da eletroacupuntura na função cognitiva. (A) Aparelho MWM. (B) Os ratos foram testados usando o aparelho do labirinto aquático Morris (MWM). (C) Tendências na latência de escape durante o teste da plataforma oculta. Comparado ao grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado ao grupo da doença de Alzheimer (DA), ▲▲p < 0,05. (D) Proporção do tempo de natação no primeiro quadrante. Comparado ao grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado ao grupo AD, ▲▲p < 0,05. (E) Número de passagens de plataforma no quadrante da plataforma. Comparado ao grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado ao grupo AD, ▲▲p < 0,05. Essa figura foi reutilizada com permissão de Sun et al.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Efeitos da eletroacupuntura na deposição de Aβ. (A) A região de interesse no hipocampo do camundongo é exibida em verde. (B) Imagens tomografiadas por microemissão de pósitrons de Aβ em camundongos de cada grupo. (C) Comparação das razões padronizadas de valor de absorção de [F]AV-45 (SUVR; região-alvo/cerebelo) no hipocampo de cada grupo, quantificadas por micro-PET. Comparado ao grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado ao grupo da doença de Alzheimer (DA), ▲▲p < 0,05. Essa figura foi reutilizada com permissão de Sun et al.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Efeitos da eletroacupuntura na expressão da proteína Aβ. (A) Bandas representativas de Western blot mostrando os níveis de expressão de Aβ (4 kDa) e GAPDH (146 kDa) como controle de carga. As bandas ilustram baixa expressão de Aβ no grupo N, alta expressão no grupo AD e expressão reduzida no grupo EA em comparação com o modelo DA. (B) Análise quantitativa da expressão relativa de Aβ para GAPDH entre os grupos experimentais. Comparado ao grupo N, ◆◆p < 0,05; comparado ao grupo da doença de Alzheimer (DA), ▲▲p < 0,05. Essa figura foi reutilizada com permissão de Sun et al.5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Visualizar e quantificar Uma deposição no hipocampo oferece uma janela fundamental para a progressão patológica do9 d.C. Embora existam múltiplas modalidades de neuroimagem, alcançar translação de alta resolução, quantidade e entre espécies continua sendo um obstáculo significativo. Por exemplo, a imagem de fluorescência no infravermelho próximo é frequentemente limitada pela resolução espacial, e a ressonância magnética — embora capaz de mapear alterações estruturais — frequentemente exige doses excessivamente altas de agentes de contraste para delimitar placas amiloides in vivo. Em contraste, a PET representa uma ferramenta translacional ideal, permitindo a avaliação dinâmica da neuroinflamação, metabolismo da glicose e acúmulo de A tanto em modelos animais quanto em populaçõesclínicas 10,11. A imagem molecular via PET não apenas facilita o diagnóstico precoce e a estadiamento patológico preciso. mas também é indispensável para monitorar o engajamento e a eficácia do alvo das terapêuticas emergentes paraDA12. O advento da tecnologia micro-PET no campo pré-clínico expandiu substancialmente a utilidade do PET além dos ambientes clínicos e da pesquisa com primatas não humanos. Caracterizado por resolução espacial superior e alta sensibilidade adaptada a campos de visão pequenos, o micro-PET permite que pesquisadores acompanhem longitudinalmente a progressão neurodegenerativa em modelos deroedores 13,14. Crucialmente, métricas quantitativas estabelecidas, como o SUVR calculado em relação a regiões de referência sem patologia robusta A, como o cerebelo, podem ser facilmente traduzidas do laboratório parao 15 ao lado do leito. Historicamente, a PET com traçadores específicos apresentou alta sensibilidade diagnóstica (até 90%) e especificidade (89%) para AD16,17. Embora o traçador de PIB [11C] tenha revolucionado a visualização inicial do amiloide, sua meia-vida curta limitou sua amplaimplantação 18. O desenvolvimento subsequente e a aprovação da FDA em 2012 do [18F]AV-45 (Florbetapir) mitigaram essaslimitações, proporcionando uma meia-vida mais longa junto com excelente afinidade de ligação e seletividade para Aβ. Consequentemente, [18F]AV-45 tornou-se um elemento básico tanto para diagnósticos clínicos quanto para avaliaçõespré-clínicas 20.

Vários passos críticos e possíveis modificações devem ser considerados ao utilizar esse protocolo. Primeiro, o controle rigoroso dos parâmetros da radiossíntese é essencial; qualquer desvio na quantidade de precursor ou na temperatura da reação pode comprometer severamente a pureza e o rendimento radioquímico do [18F]AV-45. Segundo, o alinhamento estereotáxico preciso durante a imagem PET é fundamental para evitar efeitos de volume parcial, que podem distorcer artificialmente os cálculos dos SUVRs em pequenas regiões hipocampais de camundongos. Para solucionar problemas de baixa relação sinal-ruído em imagens PET, os pesquisadores devem verificar a atividade específica do traçador injetado e garantir que a profundidade da anestesia isoflurana permaneça estável, pois o movimento respiratório pode borrar as imagens.

Essa metodologia tem certas limitações. Embora o micro-PET do AV-45 forneça uma visão macroscópica da carga regional de Aβ, sua resolução espacial não permite a visualização de placas amiloides microscópicas únicas. Além disso, a intervenção eletroacupuntura de 15 dias implementada neste estudo demonstrou uma atenuação significativa da carga de Aβ em comparação com camundongos de Alzheimer não tratados; no entanto, dado que a eliminação completa das placas Aβ estabelecidas normalmente requer meses de intervenção sustentada, o paradigma atual reflete principalmente uma modulação precoce da dinâmica solúvel do Aβ ou uma parada da deposição progressiva, em vez da eliminação completa da placa estrutural. Além disso, obter PET scans antes e depois da intervenção no mesmo sujeito proporcionaria um controle longitudinal mais forte, uma estratégia que deve ser adotada em desenhos experimentais futuros.

Em resumo, os resultados deste estudo sugerem que a intervenção por eletroacupuntura (EA) mitiga significativamente o acúmulo de Aβ e preserva a função cognitiva espacial em camundongos APP/PS1. A base mecanicista dessa melhoria pode estar relacionada aos efeitos neuromoduladores da estimulação dos pontos de acucidade21 do Vaso Governador (Du Mai), que foram anatomicamente ligados a redes fasciais e neurovasculares que promovem o fluxo sanguíneo cefálico e as vias de limpeza. Ao fornecer evidências robustas e quantificáveis de imagem molecular, esse protocolo ressalta a importância de integrar modalidades terapêuticas tradicionais com neuroimagem avançada. Esse arcabouço metodológico abre caminho para investigações mais profundas sobre as vias terapêuticas da acupuntura no combate à DA.

Divulgações

Todos os autores declararam que não há conflitos potenciais de interesse.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82004482, 82274654, 82274644), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (nº 7252219) e pelo Fundo de Cultivo de Inovação do Sexto Centro Médico do Hospital Geral do EPL (Nº CXPY202405). Agradecemos à Biorender (biorender.com) por fornecer as ferramentas gráficas utilizadas neste estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
[18F]AV-45Laboratório de Radiofarmacêutica da Universidade Normal de Pequim— —O traçador mais amplamente utilizado na indústria
0,22 & mu; Membrana m PVDFBeyotimeFFP71Transferência eficiente de filme
15% SDS-PAGE GelBeyotimeP0066Dificultar a migração de proteínas de pequenas moléculas
5 e vezes; Buffer de carregamento SDSBeyotimeP0015Garanta listras claras e uma separação precisa.
Mouse macho de 6 meses com APP/PS1Cavenberg (Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Amplamente utilizado para pesquisa sobre doença de Alzheimer.
 
C57BL macho de 6 meses/camundongos 6Cavenberg (Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Para o grupo controle normal
Aβ anticorpoProteintech25524-1-APDetecção A & beta; Monômero
Agulhas descartáveis estéreis para acupunturaZhongYan TaiHe Medical Instrument Co., LtdZYTH2013030504Ferramentas comuns de acupuntura
Substrato ECLThermo Fisher (Pierce)  32106 (500 mL)Detecção de proteínas-alvo
Aparelho de eletroacupuntura (EA)Beijing Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202Equipamentos de eletroacupuntura comumente usados na China
GAPDHProteintech23567-1-CBProteína de referência clássica (1:5000)
Anticorpo secundário conjugado com HRPThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100μ L)Detecção de proteínas-alvo (1:2000)
Software ImageJNIH  Versão 1.53aAnálise dos valores em escala de cinza das tiras
IsofluranoCentauro30135687 (250ml)Anestesia segura e rápida de camundongos
PET-TCSistema de imagem IRIS PET/CTIRISAlta sensibilidade ao PET e excelente desempenho quantitativo
Coquetel inibidor de fosfataseBeyotimeP0055BManter o estado de fosforilação das proteínas
Software PMODTecnologias PMOD  Versão 4.5 Usado para  processamento e análise de dados de imagens PET
Marcador de peso molecular de proteína pré-coloridaThermo Fisher (Pierce)26619 (2 vezes; 250 e micro; L) Monitoramento de eletroforese e transferência de membranas 
Coquetel inibidor de proteaseBeyotimeP1046Inibição de amplo espectro da atividade de proteases endógenas
Buffer de lise RIPABeyotimeP0013CManutenção da modificação da fosforilação de proteínas
Leite em pó desnatado usado no aparelho Morris Water MazeYili6907992637815Tornar a água opaca e esconder plataformas subaquáticas
O sistema de labirinto aquático MorrisChengdu Taimeng Software Co., Ltd.WMT-100SEquipamentos de labirinto aquático amplamente utilizados na China

Referências

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