Sondando o Microambiente Ovariano: Métodos para Isolamento, Cultura 2D e Cultura Organoide de Células Somáticas Ovarianas de Camundongos

Resumo

Descrevemos métodos para isolar células somáticas ovarianas de camundongos a partir de uma fração rica em estroma do ovário e para gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes.

Resumo

O ovário consiste em populações heterogêneas de células somáticas, tanto dentro do folículo quanto do estroma ao redor, que são essenciais para o suporte à função ovariana e para a geração de gametas de alta qualidade. Relatamos métodos para isolar células somáticas de ovários de camundongo, incluindo células endoteliais, epiteliais, esteroidogênicas, estromais e imunes. Quando essas células somáticas primárias do ovário são placadas e cultivadas em um sistema tradicional de cultura 2D, a heterogeneidade celular, organização, bem como as interações célula-célula e matriz celular tipicamente encontradas no ovário, são perdidas. Assim, também descrevemos como gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes. Esses organoides se auto-montam, mantêm populações celulares diversas e produzem fatores extracelulares e secretados, incluindo citocinas. Organoides podem ser utilizados em experimentos de cocultura e podem ser mantidos em cultura por pelo menos 3 semanas com alta viabilidade. No geral, esses modelos permitem a investigação da fisiologia e patologia ovariana a partir da perspectiva das células somáticas.

Introdução

Embora o óvulo, ou gameta feminino, seja essencial para dar origem à próxima geração, as populações celulares somáticas no ovário desempenham papéis críticos no desenvolvimento de gametas, produção de hormônios esteroides e homeostase ovariana. Os óócitos, cercados por células somáticas da granulosa e da teca, formam as unidades funcionais do ovário conhecidas como folículos. As células da granulosa estão fisicamente conectadas ao oócito por projeções transzonais e fornecem suporte metabólico e nutricional ao óvulo, além de regular a parada meiótica ^1,2. Além disso, em resposta às gonadotrofinas, as células granulosa e teca produzem hormônios esteroides, incluindo estrogênio, progesterona e andrógenos, que têm efeitos além do sistema reprodutor, impactando os sistemas cardiovascular, musculoesquelético e nervoso, afetando assim a saúde geral da^{mulher 3}. Os folículos ovarianos se desenvolvem dentro de um estroma ovariano heterogêneo composto por vasculatura, células imunes, várias populações de fibroblastos intersticiais e células mesenquimatosas, além de uma matriz extracelular (^ECM)4 altamente ordenada. Esse microambiente estromal fornece sinais físicos e químicos que impactam o crescimento do folículo, ovulação e^{luteinização 4}.

Existem vários métodos para isolar e cultivar gametas e folículos in vitro, e esses métodos avançaram nosso entendimento sobre oogênese e foliculogênese⁵. No entanto, o compartimento somático do ovário é relativamente pouco estudado, em parte devido à falta de modelos robustos in vitro. Os modelos atuais do compartimento somático ovariano são amplamente restritos a um único tipo celular, como fibroblastos, células epiteliais da superfície ovariana, endoteliais, imunes ou^granulosas 6,7,8,9,10,11. A cultura de células somáticas primárias ovarianas definidas de forma ampla em 2D favorece populações de macrófagos ao longo do tempo, resultando em perda da heterogeneidade^{celular 12}. Além disso, a cultura tradicional bidimensional (2D) de monocamadas não permite as diversas interações célula-célula e matriz celular presentes no ovário. Explantações de tecido ovariano mantêm a complexidade celular e estrutural do tecido nativo, mas variam em composição dependendo de onde foram depuradas dentro do^{ovário 13,14}.

Organoides são versões tridimensionais (3D), multicelulares e miniaturizadas de órgãos ou tecidos que recapitulam a organização e as funções in vivo ^15,16. Organoides podem ser gerados a partir de células-tronco ou células primárias isoladas de tecido normal ou^{doente 15}. No contexto do sistema reprodutor feminino, organoides foram gerados para modelar o endométrio, trompa de Falópio, colo do útero e^{placenta 17}. No entanto, em relação ao ovário, até recentemente, os modelos organoides eram limitados a um único tipo celular, como células epiteliais da superfície ovariana ou células cancerígenas, ou foram gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para se assemelhar a estruturas foliculares em vez do estroma^{ovariano 17,18}. Estudos recentes geraram e caracterizaram organoides usando populações heterogêneas de células somáticas isoladas de tecido de camundongo, macaco rhesus e ovariano^humano 19,20,21. Esses modelos organoides permitiram investigar mecanismos celulares subjacentes ao envelhecimento ovariano, bem como os efeitos da exposição a ftalatos na composição da^{ECM 19,21}.

Dada a importância crítica das células somáticas, tanto no folículo quanto no estroma, para a função ovariana, descrevemos métodos para isolar células somáticas de uma fração rica em estroma de ovários de camundongos e para cultivá-las in vitro usando cultura tradicional de monocamada ou em um modelo organoide. Usando micromoldes de agarose sem andaimes, as células somáticas ovarianas formam organoides em 1 a 3 dias. Os organoides preservam populações importantes de células ovarianas, incluindo fibroblastos, macrófagos e células esteroidogênicas, e podem ser cultivados por até 3 semanas com alta viabilidade. Organoides somáticos ovarianos são propícios para avaliações transcriptômicas e histológicas, análise de meios condicionados, co-cultura com outros tipos celulares e métodos de triagem de compostos. No geral, esses organoides são um modelo robusto para interrogação e modulação in vitro do compartimento somático ovariano e podem ser aplicados ao estudo do desenvolvimento ovariano, envelhecimento, fisiologia e patologia.

Protocolo

O uso de animais para desenvolver esse protocolo foi de acordo com o Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Northwestern University e as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (Número de Garantia de Bem-Estar Animal da Northwestern University: A3283-01; ID do Protocolo IACUC: IS00013082_IM12). Informações do fabricante e números de catálogo para todos os materiais, incluindo moldes de silicone para micromoldes, mídias e suplementos de agarose, estão disponíveis na Tabela de Materiais. Uma visão geral das etapas do protocolo é apresentada na Figura 1. Todos os passos do protocolo devem ser realizados utilizando equipamentos de proteção individual apropriados, em conformidade com todas as regulamentações institucionais de biossegurança e saúde e segurança ambiental e, salvo especificação em contrário, dentro de um gabinete de biossegurança Classe II.

Figura 1: Esquema do isolamento de células somáticas ovarianas de camundongos, geração de organoides somáticos ovarianos e aplicações posteriores. Os ovários do camundongo são isolados e a fração estromal é enriquecida. A fração estromal enriquecida é digerida enzimática e mecanicamente. Tecido não digerido é forçado. As células são peloteadas, lavadas, contadas e placadas para cultivo em 2D. Para a geração de organoides, após a cultura 2D durante a noite, as células são colhidas usando tripsina e são em pellets, lavadas e contadas. As células são semeadas em micromoldes de agarose para cultura organoide. Organoides podem ser utilizados para histologia, extração de RNA/proteína, análise de meios condicionados, tratamentos e triagem de medicamentos, além de co-cultura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Preparação de meios para isolamento e cultura de células somáticas ovarianas

NOTA: A digestão do tecido ovariano e o subsequente isolamento e cultura de células somáticas primárias requerem quatro tipos de meio: meios de dissecção (DM; usados nos Passos 2.3–2.4 para dissecação e perfuração de ovários de camundongo), meios enzimáticos (EM; usados nos Passos 2.5–2.8 para digestão enzimática de ovários de camundongos enriquecidos com estroma), meios de têmpera (MQ; usados no Passo 2.9 para retardar a digestão enzimática), e meios de blindagem (PM; usados nos Passos 2.11–2.14 e 4.6 para lavagem, placagem e cultura 2D de células somáticas primárias do ovário, bem como para a inativação da tripsina na colheita das células da cultura 2D). Todo o meio deve ser preparado em um armário de segurança biológica esterilizado Classe II ou exaustor de fluxo laminar. As receitas de mídia listadas abaixo são suficientes para processar ovários de 5–6 camundongos, mas devem ser escaladas conforme necessário. Todos os meios podem ser preparados com até uma semana de antecedência e armazenados a 4 °C, mas as enzimas para a EM devem ser adicionadas frescas no dia do isolamento celular.

1. Prepare DM (15 mL) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS) e 0,5% de penicilina-estreptomicina (PS) no meio L-15 de Leibovitz. Esterilize o meio usando um filtro estéril.
   NOTA: A DM é tamponada para a troca de ar ambiente e utilizada durante a microdissecação do ovário a partir dos tecidos ao redor, bem como para enriquecimento da fração estromal.
2. Prepare EM (10 mL) contendo 1% de FBS e 0,5% de PS em αMEM. Adicione 82 unidades enzimáticas/mL de colagênase IV e 0,2 mg/mL de DNase I (≥400 unidades de atividade enzimática/mg). Dissolva as enzimas invertendo e depois esterilize o meio usando um filtro estéril.
   NOTA: O meio enzimático é tamponado com bicarbonato de sódio para troca de ar a 5% de_CO2 e utilizado para a digestão enzimática de fragmentos de tecido ovariano.
3. Prepare QM (20 mL) contendo 10% de FBS e 0,5% de PS em meio αMEM. Esterilize o meio usando um filtro estéril.
   NOTA: A MQ é tamponada com bicarbonato de sódio para troca de ar a 5% de_CO2 e utilizada para a têmpera da digestão enzimática.
4. Prepare PM (30 mL) contendo 10% de FBS e 1% de PS em RPMI 1640 (contendo 25 mM HEPES e 2 mM L-Glutamina). Esterilize o meio usando um filtro estéril.
   NOTA: A PM é tamponada com bicarbonato de sódio para troca de ar a 5% de CO₂ e utilizada para o revestimento das células somáticas primárias do ovário, bem como para cultivo em 2D.

2. Digestão do tecido ovariano e isolamento de células somáticas primárias

NOTA: Os ovários de camundongos são isolados e digeridos tanto enzimática quanto mecanicamente para isolar células somáticas primárias. Ovários de 5 a 6 camundongos podem ser processados juntos no mesmo prato. Os passos a seguir devem ser realizados usando técnica asséptica, preferencialmente usando um microscópio dissecador em um exaustor de fluxo laminar.

1. Adicione 10 mL de EM, 20 mL de MQ e 20 mL de PM em placas de Petri separadas de 100 mm. Equilibre as placas em uma incubadora de cultura de tecidos (ambiente umidificado, 37 °C com 5% de CO₂) por pelo menos 1 hora antes do uso.
2. Aqueça o DM em banho-maria (37 °C) antes do uso.
3. Dissecar ovários de camundongos em uma placa de Petri de 35 mm contendo 3 mL de DM. Separar os ovários do tecido adiposo anexado, do oviduto e da bursa ovariana usando pinças de ponta fina e/ou microtesouras (Figura 2Ai,ii). Utilize um microscópio dissecador conforme necessário para microdissecação.
4. Transfira os ovários dissecados para um vidro de relógio de 45 mm com 2–3 mL de DM. Sob um microscópio dissecante, ancorar e perfurar todas as áreas dos ovários usando agulhas de insulina 28-G com as mãos não dominante e dominante, respectivamente, por aproximadamente 10 minutos. Gire frequentemente o tecido ovariano para garantir que todas as áreas sejam desintegradas.
   NOTA: A perfuração dos ovários enriquece a fração estromal ao liberar folículos preantral, bem como complexos cúmulo-oócitos e células de granulosa dos folículos antrais (Figuras 2Aiii–iv).
5. Use pinças de ponta fina para mover ovários de camundongos enriquecidos com estroma para a placa de Petri com EM equilibrada (Figura 2Bi).
6. Trabalhando rapidamente para minimizar as mudanças de temperatura e pH do meio, rasgue os ovários enriquecidos com estroma em pedaços de aproximadamente 2–3 mm com pinças de ponta fina (Figura 2Bii).
7. Segure a placa de Petri em um ângulo e pipete repetidamente a EM contendo pedaços de tecido ovariano com uma pipeta p1000, ajustada para 1 mL, 100× ou por 3 minutos, o que ocorrer primeiro (Figura 2Biii). Gire a placa de Petri conforme necessário para garantir que todos os pedaços de tecido estejam pipetados.
   NOTA: Se o tecido for grande demais para ser pipetado com uma ponta p1000, a ponta pode ser cortada com um bisturi estéril para alargar a abertura. O furo deve ser largo o suficiente para permitir a entrada da maioria (>50%), mas não de todas, as peças de tecido, criando um efeito de cisalhamento.
8. Transfira a placa de Petri contendo fragmentos de EM e tecido ovariano para um incubador de cultura tecidal (ambiente umidificado, 37 °C com 5% de_CO2) e incube por um total de 30 minutos, removendo a placa e pipeteando repetidamente (100× ou por 3 minutos) após 15 minutos, e depois novamente ao final da incubação de 30 minutos (Figura 2Biii).
   NOTA: Após os primeiros 15 minutos de incubação, os pedaços de tecido devem ser digeridos o suficiente para que >80% passem pela ponta de uma pipeta p1000, sem a necessidade de cortar a ponta para alargar a abertura. A duração total da digestão e a quantidade de pipeteamento necessária dependerão do tamanho inicial dos pedaços de tecido rasgados. Além disso, a idade e a tensão do camundongo, a variabilidade de lote a lote na atividade das enzimas e o tamanho do furo da pipeta podem impactar a taxa de degradação do tecido. A digestão deve ser interrompida quando os pedaços de tecido ovariano forem quebrados em fragmentos de aproximadamente 1 mm que ainda são visíveis a olho (Figura 2Biv). A digestão excessiva pode resultar em perda celular e diminuição da viabilidade celular.
9. Dilua as enzimas para retardar a digestão dos tecidos adicionando 20 mL de MQ pré-equilibrada (Figura 2Ci).
10. Passe a suspensão celular por um peneiro de 40 μm colocado sobre um tubo cônico de 50 mL para remover pedaços de tecido não digeridos (Figura 2Cii). Centrifuge o filtrado a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar as células (Figura 2Ciii).
11. Lave as células removendo o sobrenadante por aspiração, ressuspendendo o pellet celular em 1 mL de PM pré-equilibrado, transferindo a suspensão celular para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugando a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar novamente as células (Figura 2Civ).
12. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PM, tinga uma aliquota de 10 μL de células com azul de tripano para avaliar a viabilidade celular e conte as células usando um hemocitômetro.
    NOTA: Veja a Tabela 1 para o número previsto de células somáticas ovarianas primárias, dependendo da cepa e idade do camundongo, nesta fase do protocolo de isolamento. A viabilidade celular nessa fase deve ser >80%.
13. Placar as células em um vaso tratado com cultura de tecido a uma densidade aproximadamente de 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/^cm2 (por exemplo, para contagens celulares de aproximadamente 3 × 10⁶, células de placa em uma placa de 60 mm tratada por cultura de tecido, e para contagens celulares de aproximadamente 1 × 10,6, células de placas em um poço de uma placa de 6 poços tratada por cultura de tecido).
    1. Adicione PM adicional dependendo do volume total da placa ou recipiente (por exemplo, adicione mais 4 mL de PM se usar um prato de 60 mm ou 2 mL adicionais de PM se usar um poço de uma placa de 6 poços).
       NOTA: A densidade de placas listada acima é recomendada se as células forem utilizadas para geração de organoides após a cultura 2D durante a noite. Para uma cultura 2D mais longa, as células podem ser placadas em densidade menor. Meios de banhagem extras que não foram equilibrados podem ser armazenados a 4 °C por até 1 semana. O PM é necessário tanto para a geração de organoides quanto para manter as células somáticas ovarianas em cultura 2D. Neste ponto do protocolo, as células somáticas ovarianas podem ser mantidas em uma cultura monocamada 2D (passo 2.14) ou podem ser usadas para gerar organoides (prossiga para a Seção 3). É necessária uma cultura 2D durante a noite antes da geração do organoide para remover quaisquer oócitos dos folículos em estágio inicial que possam ter passado pelo peneiro celular de 40 μm.
14. Após a colocação durante a noite (mínimo de 16 horas), lave as células com solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS; Mg/Ca-free (pH 7,0–7,3) para remover células mortas e detritos (Figura 3A). Adicione PM fresco após a lavagem e substitua a mídia por PM fresco dia sim, dia não, ao longo da cultura (Figura 3B).
    NOTA: Apesar da alta viabilidade celular após o isolamento, uma grande perda na contagem celular total é tipicamente observada após o revestimento durante a noite, devido à morte celular ou à incapacidade de se fixar ao vaso de cultura tecidular (Figura 3A).

Figura 2: Esquema do isolamento das células somáticas do ovário do camundongo. (A) Imagens representativas da dissecção do ovário do camundongo (i,ii) e (iii,iv) enriquecimento estromalógico. O ovário do camundongo é contornado com uma linha tracejada em Ai. (B) Imagens representativas de pedaços de tecido ovariano durante a digestão mecânica e enzimática. Ovários enriquecidos com estroma (i) antes e (ii) após o rasgo, (iii) pedaços de tecido ovariano durante a pipeteação e (iv) pedaços de tecido ovariano após a digestão. (C) Imagens representativas de (i) a secção da digestão, (ii) a filtragem da suspensão celular e (iii,iv) a granulação das células somáticas ovarianas primárias do camundongo. Os encaixes em Cii e Ciii mostram pedaços de tecido não digeridos capturados pelo peneiro celular e pelo pellet celular após a centrifugação, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Células somáticas primárias do ovário podem ser cultivadas em 2D. (A) Imagens representativas de luz transmitida das células somáticas primárias do ovário placadas em um prato de 60 mm 16 horas após o placagem, antes e depois da lavagem com PBS. (B) Imagens representativas de luz transmitida de células somáticas primárias do ovário placadas em uma placa de 24 poços durante 3 dias em cultura. Barras de escala = 400 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação de micromoldes e meios de agarose para geração e cultura de organoides

NOTA: Organoides somáticos ovarianos são gerados e cultivados em micromoldes de agarose sem andaimes com meios organoides ovarianos. Micromoldes de agarose e meios organoides ovarianos devem ser preparados usando técnica asséptica em um gabinete de segurança biológica esterilizado Classe II ou capela de fluxo laminar.

1. Preparação de micromoldes de agarose
   1. Coloque moldes de silicone para micromoldes e pinças Graefe em uma bolsa de esterilização e autoclave usando um ciclo de secagem para esterilizar (Pressão da jaqueta: 20 psi, Temperatura da câmara: 250 °F (121,11 °C, Tempo de esterilização: 15 min).
      NOTA: Vários moldes de silicone podem ser autoclavados e usados ao mesmo tempo para uma geração mais rápida de micromoldes de agarose.
   2. Adicione 1 mL de PBS contendo 1% de PS a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para armazenamento dos micromoldes de agarose.
   3. Dissolva 1,5% (v/v) de agarose estéril em PBS aquecendo em micro-ondas, em banho-maria quente ou em uma placa elétrica.
      NOTA: Dissolver a agarose por micro-ondas em um tubo cônico de 50 mL colocado em um béquer de 100 mL cheio de água funciona bem (Figura 4Ai). Além de permitir o controle da ebulição, o banho de água quente criado no béquer retarda a resolidificação da agarose.
   4. Deixe a agarose líquida esfriar até aproximadamente 50 °C até que o tubo possa ser manuseado confortavelmente.
   5. Pipete lentamente 300–350 μL de 1,5% de agarose na moldura de silicone, tomando cuidado para não preencher demais ou preencher menos do molde e evitar a criação de bolhas (Figura 4Aii). Certifique-se de que a agarose crie uma camada plana no topo da fundição, em vez de uma borda côncava ou convexa (Figura 4Aiii,iv). Estoure as bolhas usando uma ponta de pipeta p10 estéril antes que a agarose comece a solidificar (Figuras 4Bi–iii).
   6. Deixe a agarose solidificar na fundição de silicone por 2–3 minutos em temperatura ambiente (Figura 4Biv).
   7. Quando solidificado, inverta o silicone fundido sobre um poço da placa de cultura de tecido de 24 poços contendo PBS + 1% de PS. Flexione cuidadosamente o silicone para liberar o micromolde de agarose na placa (Figura 4Ci).
      NOTA: Micromoldes de agarose submersos em PBS +1% PS em uma placa de cultura de tecido de 24 poços envolvida em parafilme podem ser armazenados a 4 °C até 1 mês antes do uso (Figura 4Cii). Micromoldes de agarose devem ser preparados pelo menos 16 horas antes do uso, pois micropoços frequentemente contêm bolhas de ar imediatamente após a fundição e submersão em PBS + 1% de PS (Figura 4Ciii). No entanto, essas bolhas de ar se dissipam durante o armazenamento (Figura 4Civ). Antes do uso para cultura de organoides, inserções de micropoços de agarose devem ser cuidadosamente examinadas ao microscópio para confirmar que os micropoços não foram fundidos ou interrompidos durante a fundição (Figura 4Di–iv). Micromoldes defeituosos não são recomendados para a geração e cultura de organoides. Recomenda-se que um excesso de micromoldes de agarose seja preparado para responder por ~25% que terão defeitos
2. Preparação de meios organoides ovarianos
   1. Em um gabinete de biossegurança, adicione suplementos de meio de crescimento organoide (Mouse) 1 e 2 e 1% de PS ao meio basal conforme as instruções do fabricante. Armazene o meio organoide ovariano preparado a 4 °C por até 2 semanas antes do uso.
      NOTA: Os suplementos 1 e 2 podem ser alicotados e armazenados a -20 °C.

Figura 4: Esquema mostrando a preparação de micromoldes de agarose. (A) Imagens representativas de (i) preparação de 1,5% de agarose, (ii) pipetagem em moldes de silicone, (iii) moldes de silicone devidamente preenchidos e (iv) moldes de silicone sobrecarregados. Linhas tracejadas em Aiii e Aiv mostram, respectivamente, fundos planos e convexos de micromoldes de agarose. (B) Imagens representativas de (i,ii) moldes de silicone preenchidos com bolhas na agarose, (iii) estourando bolhas com a ponta de uma pipeta antes da solidificação da agarose, e (iv) um micromolde de agarose solidificado dentro da moldura de silicone. (C) Imagens representativas de (i) remoção de micromoldes de agarose solidificados de moldes de silicone, (ii) armazenamento de micromoldes de agarose em placas de 24 poços contendo PBS + 1% de PS, (iii) bolhas presentes nos micropoços imediatamente após a fundição, e (iv) micromolde de agarose sem bolhas e devidamente fundido após 16 horas de armazenamento. (D) Imagens representativas de micromoldes com (i,ii) poços combinados, (iii) poços perturbados ou (iv) danos. Abreviações: PBS = soro tamponado com fosfato; PS = penicilina-estreptomicina. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Geração e cultura dos organoides

NOTA: Após a cultura 2D durante a noite, células somáticas primárias do ovário são colhidas da cultura 2D e semeadas em micromoldes de agarose para gerar organoides. Os passos a seguir devem ser realizados usando técnica asséptica em um armário de segurança biológica esterilizado Classe II.

1. Aqueça o PM e o meio organoide até 37 °C em banho-maria e aqueça 0,05% de tripsina até a temperatura ambiente.
2. Usando pinças Graefe, transfira cuidadosamente os micromoldes para os poços de uma nova placa de 24 poços (Figura 5Ai).
3. Adicione 500 μL de meio organoide ovariano a cada poço da placa de 24 poços contendo um micromolde de agarose (Figura 5Aii). Certifique-se de que os micromoldes estejam totalmente submersos na mídia e equilibre os micromoldes e a mídia por pelo menos 30 minutos em uma incubadora (ambiente umidificado, 37 °C com 5% de_CO2).
4. Remova PM das células somáticas ovarianas aderentes aspirando e lave as células com PBS livre de Mg/Ca.
5. Adicione 0,05% de tripsina (1–2 mL de tripsina para uma placa de 6 poços ou placa de 60 mm) para colher as células da cultura 2D. Incube as células com tripsina por 2–3 minutos a 37 °C em uma incubadora.
6. Confirme que as células se separaram sob o microscópio e iative a tripsina adicionando dois volumes de PM aquecido para cada volume de tripsina utilizado.
7. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e faça pellets nas células por centrifugação a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
8. Resuspenda as células em 1 mL de PM aquecido, tinga uma alíquota de células com azul de tripano para avaliar a viabilidade celular e conte as células usando um hemocitômetro.
   NOTA: Veja a Tabela 1 para o número previsto de células somáticas primárias do ovário, dependendo da cepa e idade do camundongo, após a cultura 2D durante a noite e a tripsinização subsequente. A viabilidade das células tripsinizadas é tipicamente maior que 90%.
9. Faça pellets nas células por centrifugação (300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente) e resuspenda o pellet celular em meio organoide ovariano até uma densidade de 3,33 × 10⁶ células vivas por 1 mL de meio, ou seja, 2,5 ×^{10 5} células vivas por 75 μL de meio.
   NOTA: Aqui, 2,5 × 10⁵ células são semeadas por cada micromolde de agarose. Assim, o número total de micromoldes que podem ser gerados dependerá da contagem total de células. Organoides podem ser gerados com menos de 2,5 × 10^{células 5} por micromolde de agarose, mas o tamanho dos organoides, a cinética de agregação, a composição celular relativa e as funções, incluindo a produção de hormônios, podem ser impactados.
10. Remova os micromoldes de agarosa equilibrados da incubadora, certifique-se de que os micromoldes estejam orientados de modo que a câmara de semeadura da célula fique voltada para cima e remova o meio organoide ovariano das câmaras de semeadura celular (Figura 5Aiii).
    1. Remova o meio das câmaras de semeadura celular dos micromoldes usando pinças Graefe para levantar e inclinar os micromoldes ou pipeteando. Para remover o meio das câmaras de semeadura celular por meio da pipetagem, coloque suavemente a ponta da pipeta sobre o canto da câmara de semeadura enquanto puxa o substrato. Não entre em contato direto com o micromolde de agarose para evitar perturbar os micropoços.
       NOTA: As câmaras de semeadura celular devem estar o mais secas possível, de modo que os micropoços sejam visíveis a olho nu, mas o exterior dos micromoldes ainda deve estar cercado por meio organoide ovariano (Figura 5Aiii).
11. Dispense 75 μL da suspensão da célula (ou seja, 2,5 × 10⁵ células) diretamente para a câmara de semeadura celular de cada micromolde de agarose e evite criar bolhas (Figura 5Bi). Devolva a placa de 24 poços à incubadora.
12. Uma a duas horas após a semeadura celular, adicione mais 250 μL de meio organoide ovariano aquecido ao redor do lado externo dos micromoldes de agarose, tomando cuidado para não perturbar as câmaras de semeadura celular (Figura 5Bii).
    NOTA: As células somáticas ovarianas primárias devem começar a se agregar em 1–24 horas após a semeadura em micromoldes de agarose (Figura 5Biii).
13. Substitua o meio ao redor dos micromoldes de agarose por 750 μL de meio organoide ovariano fresco no dia seguinte à semeadura celular e, posteriormente, dia sim, dia não, durante a cultura.
    1. Para trocar o meio, segure a placa em um leve ângulo para remover o meio gasto ao redor dos micromoldes de agarose. Não remova o meio das câmaras de semeadura celular. Pipete suavemente o meio fresco em direção à parede do poço para evitar perturbar as câmaras de semeadura celular.
       NOTA: Meios condicionados provenientes de alterações no meio podem ser salvos e armazenados a -80 °C para análise de fatores secretados por organoides. Uma vez formados os organoides (1–3 dias após o semeadura celular), o meio pode ser substituído por meios contendo proteínas recombinantes, inibidores, etc., para examinar os efeitos de vários tratamentos na função organoide ou para triagem de compostos.

Figura 5: Esquema da geração de organoides somáticos ovarianos. (A) Imagens representativas de (i) transferência de micromoldes de agarose para a placa de cultivo com pinças de Graefe, (ii) equilíbrio de micromoldes de agarose em Meios Organoides Ovarianos, e (iii) remoção de meios de câmaras de semeadura celular. A seta em Aiii indica câmara de semeadura de células vazia. (B) Imagens representativas de (i,ii) semeadura de células em micromoldes de agarose e (iii) uma varredura de luz transmitida de um micromolde de agarose contendo células somáticas ovarianas agregadoras. Barra de escala (Biii): 2500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Utilização de organoides para aplicações posteriores

NOTA: Organoides podem ser utilizados para uma variedade de aplicações posteriores, incluindo histologia, aplicações em biologia molecular (por exemplo, análises de RNA/proteínas), análise de mídia condicionada e co-cultura.

1. Histologia
   NOTA: Organoides podem ser processados para fins histológicos sem necessidade de remoção dos micromoldes de agarose. Na verdade, organoides dentro de micromoldes de agarose agem de forma semelhante aos microarrays de tecido, permitindo assim uma avaliação histológica de alto débito de vários organoides espaçados de forma consistente ao mesmo tempo.
   1. Dissolva 1,5% (p/v) de agarose estéril em PBS fervendo.
   2. Após a cultura dos organoides somáticos ovarianos, segure a placa em um ângulo e remova o meio ao redor dos micromoldes de agarose.
   3. Sob um microscópio de dissecação, remova o meio das câmaras de semeadura celular pairando suavemente a ponta de uma pipeta sobre o canto de cada câmara de semeadura e cuidadosamente puxando o meio sem perturbar os organoides ou perturbar o micromolde.
   4. Pipete-se cuidadosamente 100–125 μL de agarose líquida 1,5% resfriada a aproximadamente 50 °C no canto de cada câmara de semeadura celular para preencher e selar as câmaras de semeadura celular, tomando cuidado para não perturbar os organoides (Figura 6Ai).
   5. Deixe a agarose solidificar por 2–3 minutos em temperatura ambiente.
   6. Adicione 750 μL de Davidson Modificado ou paraformaldeído a 4% em cada poço e fixe os organoides dentro dos micromoldes de agarose selados durante a noite a 4 °C.
   7. Após a fixação, remova o fixador e lave os micromoldes de agarose com etanol a 70%.
      NOTA: Micromoldes podem ser armazenados em etanol a 70% a 4 °C até o processamento do tecido (desidratação, limpeza e infiltração de cera). Durante o processamento de tecidos, acompanhe a orientação dos micromoldes de agarose.
   8. Após o processamento de tecidos, incorpore os micromoldes de agarose na parafina de modo que fiquem planos dentro dos blocos de parafina e que a base dos micromoldes seja a primeira a ser seccionada (Figura 6Aii).
   9. Bloqueia parafina a 5 μm e coloque as seções de tecido sobre lâminas carregadas de microscópio.
      NOTA: A presença de micropoços pode ser visualizada a olho do lado durante a secção tanto em seções de tecido quanto em blocos de parafina (Figura 6Aiii,iv). A presença de organoides nas seções do micromolde pode ser verificada examinando lâminas seccionadas sob um microscópio (Figura 6Av). Em vez de colocar 2–3 seções consecutivas no mesmo slide, colocar 2–3 seções separadas por 50 μm (ou seja, a cada^10ª seção) em um único slide aumenta a probabilidade de que a maioria dos organoides esteja representada em pelo menos uma seção de cada slide. Os organoides estão consistentemente espaçados dentro das seções do tecido, aumentando a facilidade de obtenção de imagens após a coloração histológica (Figura 6Avi).
   10. Deixe os slides secarem no forno a 37 °C durante a noite.
   11. Prossiga com coloração histológica ou imunohistoquímica ou armazene lâminas à temperatura^{ambiente 19}.
2. Colheita de organoides para aplicações moleculares
   NOTA: Após a cultura, organoides podem ser removidos dos micromoldes de agarose e processados para diversas aplicações posteriores em biologia molecular, incluindo extração de RNA ou proteínas para avaliar a expressão gênica ou proteica.
   1. Segure a placa contendo os micromoldes de agarose em um leve ângulo e remova o meio ao redor dos micromoldes de agarose pipeteando.
   2. Adicione 750 μL de PBS em temperatura ambiente aos poços que contêm os micromoldes de agarosa.
   3. Use pinças Graefe para inverter e agitar os micromoldes de agarosa e liberar os organoides para o PBS ao redor. Confirme a liberação dos organoides dos micromoldes de agarose sob um microscópio.
   4. Remova os micromoldes vazios de agarose usando pinças Graefe e transfira o PBS contendo os organoides para tubos de microcentrífuga por pipeteamento.
   5. Faça pellets nos organoides por centrifugação a 10.000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   6. Remova o sobrenadante aspirando e prossiga para a extração de RNA ou proteína. Alternativamente, congele rapidamente a célula e armazene a -80 °^{C 19}.
3. Salvando mídia condicionada por organoides para análise
   NOTA: Meios condicionados de organoides podem ser preservados ao longo da cultura para a análise de fatores secretados por organoides, incluindo hormônios, citocinas e fatores de crescimento. Resultados representativos da análise de citocinas em meios condicionados por organoides são mostrados na Figura 7A.
   1. Segure a placa contendo os micromoldes de agarose em um leve ângulo e remova o meio condicionado ao redor dos micromoldes pipetando. Não remova o meio das câmaras de semeadura celular para evitar perturbar os organoides.
   2. Transfira o meio condicionado para tubos microcentrífugas e prossiga para a análise do meio ou congelamento rápido e armazene a -80 °^{C 19,22}.
      NOTA: Opcionalmente, centrifuge o meio condicionado a 10.000 × g por 5 minutos para pelletar quaisquer células mortas ou detritos. Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga antes da análise ou armazenamento do meio.
4. Cocultura de organoides
   NOTA: Organoides somáticos ovarianos podem ser co-cultivados com outras células e tecidos por vários métodos. Resultados representativos da co-cultura de organoides com células e folículos do câncer de ovário, pelos métodos descritos nos passos 5.4.1 e 5.4.3, respectivamente, são apresentados em Figura 7B,C.
   1. Para gerar organoides usando uma combinação de células somáticas ovarianas primárias de camundongo e outros tipos celulares para investigar os efeitos das interações diretas célula-célula, siga os passos 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Siga os passos 4.1–4.9 para lavar as células somáticas primárias do ovário após a cultura 2D durante a noite, colher as células da cultura 2D usando 0,05% de tripsina, pellet, contagem e ressuspender as células em meio organoide ovariano com densidade de 2,5 ×^10,5 células vivas por 75 μL de meio.
      2. Se o outro tipo celular de interesse for aderente, colhe-as de uma cultura 2D. Conte as células, faça pellets por centrifugação e ressuspenda em meio organoide ovariano com densidade de 2,5 × 10⁵ células vivas por 75 μL de meio.
      3. Combine a suspensão das células somáticas primárias do ovário com a suspensão do outro tipo celular de interesse em uma razão conhecida.
      4. Siga os passos 4.10–4.13 para semear a suspensão celular resultante em micromoldes de agarose e cultivar organoides.
   2. Para transferir micromoldes de agarose contendo organoides formados para placas de 24 poços contendo outras células ou organoides, siga os passos 5.4.2.1–5.4.2.2.4.
      NOTA: Para avaliar os efeitos de fatores secretados derivados de organoides em outros tipos celulares e vice-versa, organoides formados podem permanecer dentro dos micromoldes de agarose, e micromoldes inteiros de agarose podem ser transferidos para uma placa de 24 poços contendo outras células ou organoides. Esses métodos de co-cultura podem ser utilizados quando meios organoides ovarianos podem ser usados para cultivar ambos os tipos celulares/tecidos.
      1. Meio organoide ovariano quente a 37 °C em banho-maria.
      2. Segure a placa contendo os micromoldes de agarose em ângulo e remova o meio ao redor dos micromoldes de agarose pipetando.
      3. Usando pinças Graefe, transfira cuidadosamente os micromoldes para placas de 24 poços contendo outras células ou organoides.
      4. Adicione 750 μL de meio organoide ovariano fresco para envolver os micromoldes de agarose.
   3. Para remover organoides formados dos micromoldes de agarose e transferi-los para novos micromoldes de agarose, siga os passos 5.4.3.1–5.4.3.3.13.
      NOTA: Se o meio organoide ovariano não for o meio desejado para experimentos de co-cultura, o paradigma descrito no passo 5.4.2 apresenta o desafio de um transporte significativo de meio, dado que micromoldes de agarose são saturados com meios organoides ovarianos. Organoides formados (1-3 dias após a semeadura inicial das células) podem ser movidos de seus micromoldes de agarose e transferidos para novos micromoldes de agarose para cultura adicional ou cocultura, a fim de evitar o transporte do meio.
      1. Aqueça o meio desejado para cocultura a 37 °C em banho-maria.
         NOTA: Meios baseados em DMEM, αMEM e F12 foram usados com sucesso em experimentos de co-cultura com organoides somáticos ovarianos.
      2. Usando pinças Graefe, transfira cuidadosamente os novos micromoldes de agarose do PBS +1% PS para poços de uma placa de 24 poços contendo outras células ou organoides para cocultura.
      3. Certifique-se de que os micromoldes estejam totalmente submersos na mídia, adicione o meio adicional desejado para co-cultura conforme necessário e equilibre os micromoldes e meios por pelo menos 30 minutos em uma incubadora (ambiente umidificado, 37 °C com 5% de CO₂).
      4. Segure a placa contendo os micromoldes de agarose com organoides formados em um leve ângulo e remova o meio ao redor dos micromoldes de agarose pipetando.
      5. Adicione o meio desejado para co-cultura ao redor dos micromoldes de agarose com os organoides formados.
      6. Use pinças Graefe para inverter e agitar os micromoldes de agarose e liberar os organoides no meio ao redor. Confirme a liberação de organoides dos micromoldes de agarose sob um microscópio.
         NOTA: Se as células somáticas primárias do ovário não se agregaram adequadamente, os organoides podem não permanecer intactos quando removidos dos micromoldes de agarose. A montagem dos organoides pode levar de 1 a 3 dias, dependendo da tensão e idade dos camundongos dos quais as células somáticas ovarianas foram isoladas.
      7. Remova os micromoldes vazios de agarose usando pinças Graefe e transfira o meio contendo os organoides para tubos de microcentrífuga por pipeta.
      8. Centrifuge os organoides a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
      9. Sob um microscópio dissecante, remova o sobrenadante pipeteando, deixando 50–75 μL de meio contendo os organoides.
      10. Remova os micromoldes equilibrados da incubadora e certifique-se de que os micromoldes estejam orientados de forma que a câmara de semeadura da célula fique voltada para cima.
      11. Remova o meio das câmaras de semeadura celular usando pinças Graefe ou pipeteando.
          NOTA: Os poços não devem conter mais de 500 μL de meio para que as câmaras de semeadura celular dos micromoldes possam ser esvaziadas.
      12. Transfira os organoides diretamente para a câmara de semeadura celular de cada novo micromolde de agarose, pipetando. Devolva a placa de 24 poços à incubadora.
      13. Após 1–2 horas, adicione mais 250 μL do meio desejado ao redor do lado externo dos micromoldes de agarose, tomando cuidado para não perturbar as câmaras de semeadura celular.

Figura 6: Tipos celulares ovarianos chave são preservados em organoides somáticos ovarianos. (A) Imagens representativas de (i) selar um micromolde com agarose no final da cultura, (ii) um micromolde não cortado, e (iii) um micromolde seccionado embutido em um bloco de parafina. Micropoços podem ser visualizados em seções montadas (iv), e a presença de organoides dentro de micromoldes seccionados pode ser (v) confirmada ao microscópio antes da coloração histológica (vi). (B) Imagens representativas de seções de tecido ovariano de camundongo e seções organoides somáticas ovarianas após coloração imunohistoquímica usando anticorpos contra Vimentina, F4/80, Foxl2 e 3β-HSD. Barras de escamas = 20 μm. Abreviações: H&E = hematoxilina e eosina. Essa figura foi adaptada com permissão de Dipali et ^al.19. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Co-cultura de organoides somáticos ovarianos com folículos e células de câncer de ovário. (A) A secreção de citocinas organoides foi medida por micromolde de agarose no quinto dia de cultura e normalizada para meios condicionados a partir de micromoldes de agarose sem organoides. N = 4 micromoldes de agarose. (B) Imagens representativas de luz transmitida dos folículos ovarianos nos dias 0, 4 e 8 de cultura, com ou sem organoides (controle) e (i) um esquema do paradigma de cocultura. Barras de escala = 400 μm. Quantificação de (ii) sobrevivência folicular e (iii) crescimento ao longo de 8 dias de cultura com ou sem organoides (controle). Os dados são mostrados como média ± SD. Algumas barras de erro são pequenas demais para serem visualizadas. N = 56 folículos por grupo. **P < 0,01. (C) Imagens representativas de luz transmitida (superior) e fluorescente (inferior) de células somáticas ovarianas primárias cultivadas em proporção 10:1 com células de câncer de ovário marcadas com proteína fluorescente vermelha (OVCAR8-RFP) em organoides nos dias 1, 3 e 5 de cultivo. Barras de escala = 400 μm. Abreviação: RFP = proteína fluorescente vermelha. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Dicas de solução de problemas

1. Problema 1: O número de células somáticas primárias ovarianas isoladas é menor do que o esperado.
   NOTA: Se os fragmentos de tecido ovariano forem consistentemente menores que 1 mm ou não visíveis a olho após a digestão enzimática, o número de células isoladas pode ser baixo devido à diminuição da viabilidade causada pela digestão excessiva. Se os fragmentos de tecido ovariano forem maiores que 1 mm após a digestão enzimática, o número de células isoladas pode ser baixo devido à digestão insuficiente do tecido ovariano.
   1. Se os fragmentos de tecido ovariano forem maiores que 1 mm após a digestão enzimática, siga os passos 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. Confirme que a colagênase IV e a DNase I estão dentro do prazo de validade recomendado e não perderam atividade enzimática devido ao armazenamento inadequado ou, no caso da DNase I, ciclos repetidos de congelação-descongelamento.
      2. Aumente a quantidade de pipeteamento repetido do tecido ovariano, diminua o tamanho do furo da ponta p1000 se ela foi cortada para alargar a abertura e/ou aumente o tempo de incubação na EM.
   2. Se os fragmentos de tecido ovariano forem consistentemente muito menores que 1 mm após a digestão enzimática, diminua a quantidade de pipeteamento repetido do tecido ovariano, aumente o tamanho do furo da ponta p1000 cortando para alargar a abertura e/ou diminua a incubação total na EM.
2. Problema 2: Mais de ~25% dos micromoldes de agarose fundidos apresentam defeitos
   1. Confirme que o molde de silicone está livre de qualquer agarose residual e detritos. Se necessário, lave os moldes de silicone em PBS e esterilize novamente por autoclav. Se necessário, reaqueça a agarose a 1% usada para a fundição, pois a agarose que está solidificando pode não preencher uniformemente a fundição de silicone e/ou resultar em bolhas.
   2. Uma vez pipetada na moldura de silicone, deixe a agarose solidificar completamente, pois a remoção prematura do micromolde de agarose do molde pode resultar em micropoços interrompidos.
   3. Confirme que os moldes de silicone não estão subpreenchidos, pois isso pode reduzir a integridade estrutural do micromolde de agarose, causando danos quando o silicone for flexado para remover o micromolde de agarose.
   4. Além disso, o fabricante dos moldes de silicone recomenda que sejam autoclavados no máximo 12 vezes. Se o molde de silicone passou por esterilização excessiva, substitua-o.
3. Problema 3: Organoides não se formam em mais de 10% dos micropoços
   1. Confirme que os moldes de silicone não estão superpreenchidos ao fundir os micromoldes de agarose, pois isso pode levar à distribuição irregular das células nos micropoços, favorecendo os micropoços centrais do micromolde de agarose em detrimento dos micropoços externos.
   2. Evite criar bolhas ao dispensar a suspensão celular na câmara de semeadura dos micromoldes de agarose, pois as bolhas podem interromper a distribuição das células nos micropoços.
   3. Se necessário, comece com uma suspensão de células superiores a 75 μL (com densidade de 3,33 × 10⁶ células vivas por 1 mL) por micromolde para garantir que não se formem bolhas devido ao volume insuficiente na ponta da pipeta.
   4. Aumente o intervalo entre a semeadura celular e a adição de meio organoide ovariano ao lado externo do micromolde de agarose para garantir tempo suficiente para que as células se depositem nos micropoços.

Resultados

Para determinar a composição celular dos organoides somáticos ovarianos, realizamos imunohistoquímica de seções de tecido organoide após 6 dias de cultivo, utilizando anticorpos contra os principais tipos de células ovarianas. Os organoides continham fibroblastos vimentin-positivos, macrófagos F4/80-positivos, bem como populações celulares esteroidogênicas (Figura 6B)¹⁹. Utilizamos um anticorpo contra Foxl2 para marcar granulosa e cél...

Discussão

Este artigo descreve métodos para isolar células somáticas ovarianas primárias de camundongos a partir de uma fração do ovário enriquecida com estroma, de maneira que mantenha a heterogeneidade do compartimento somático ovariano. Células somáticas ovarianas primárias de camundongos podem ser cultivadas em uma monocamada 2D ou podem ser utilizadas para gerar organoides somáticos ovarianos usando micromoldes de agarose sem andaime. Micromoldes de agarose contêm 96 micropoços para formação ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2 µm, Filtro de seringa de polietersulfona	Corning	431229
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	MIDSCI	PR-MCT15
Bêquer de vidro de 100 mL	Fisherbrand	FB100100
Pratos Petri de 100 mm	Corning	351029
Tubo cônico de 15 mL	ThermoFisher Scientific	339651
Placas de 24 poços (tratadas com TC)	Corning	353047
Agulhas de insulina de 28 calibre	Exel International	26027
Pratos Petri de 35 mm	Corning	351008
Anticorpo 3β-HSD	Cosmo Bio	K0607	1:1000
Paraformaldeído 4%	Electron Microscopy Sciences	1574100
Peneira de células de 40 µm	Corning	431750
Relógio de vidro de 45 mm	Electron Microscopy Sciences	7054345
Tubo cônico de 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
Seringa estéril de 60 mL	Air-Tite	ML60
Placas de 60 mm tratadas com TC	Corning	353037
Placas de 6 poços (tratadas com TC)	Corning	353046
Agarrose	Hoefer	GR140-500	Força do gel >1200 g/cm2; Temperatura do gel 36 °C
Bolsa de esterilização por autoclave	Fisherbrand	01-812-55
Biotina Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotina Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotina Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Reagente azul	Fisherbrand	23-245681
Centrífuga com rotor de balde oscilante para tubos cônicos de 50 mL	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Gabinete de biossegurança classe II	The Baker Company	SG403A
Anticorpo Cleaved Caspase-3 (CC3)	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
Incubadora de CO2	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Colagenase, Tipo IV, pó	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
Kit C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Desoxirribonuclease I de pâncreas bovino	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Tesoura microdissecadora	World Precision Instruments	WPI-14003
Tesouras de dissecação	World Precision Instruments	WPI-15922
Microscópio de dissecação	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosina	Fisherbrand	23-314631
Anticorpo F4/80	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Soro Bovine Fetal, certificado, inativado por calor, Estados Unidos	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fórceps de dissecação de ponta fina	World Precision Instruments	WPI-14098
Anticorpo FOXL2	Abcam	ab246511	1:200
Fórceps Graefe	Fine Science Tools	1105010
Hematoxilina	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocitómeter	MedOne	DHCN015
Sistema de Imagem	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Meio basal, Suplementos 1 e 2
Capa de fluxo laminar	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Lâminas de microscópio	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold esferoides	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Moldes de silicone para micromoldagens de agarosa
Fixativo de Davidson modificado	Electron Microscopy Sciences	6413350
Células OVCAR8-RFP			Doação da Dra. Joanna Burdette PhD, Universidade de Illinois em Chicago
Penicilina-Estreptomicina	Millipore Sigma	P4333-100ML
Solução de coloração Picrosirius Red	StatLab	STPSRPT
Meio RPMI 1640 (modificação ATCC)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Centrífuga de mesa	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Azul de Tripano	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0,05%), fenol vermelho	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Anticorpo de Vimentina	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, Suplemento GlutaMAX, sem nucleosídeos	Gibco, Fisher Scientific	32561102