Progresso em pesquisa sobre estratégias de avaliação da eficiência da reparação de danos ao DNA

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Artigo de revisão

Progresso em pesquisa sobre estratégias de avaliação da eficiência da reparação de danos ao DNA

DOI:

10.3791/71031

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23 de junho de 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Os ensaios de eficiência de reparação de danos ao DNA podem ser amplamente categorizados em três grupos: ensaios funcionais baseados em células, ensaios bioquímicos in vitro e ensaios com marcadores moleculares. Essas abordagens permitem uma avaliação qualitativa ou quantitativa da eficiência do reparo em múltiplas vias de reparação de danos ao DNA.

Resumo

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O DNA genômico celular é continuamente exposto a fatores endógenos e exógenos que induzem várias formas de dano ao DNA. Em células de mamíferos, a carga diária de danos ao DNA pode atingir 10⁴–^{10 5} lesões por célula. Danos ao DNA que persistem na fase S podem levar a mutações. Quando tais mutações ocorrem em oncogenes, genes supressores de tumores ou genes envolvidos na proliferação celular, podem promover a transformação celular e a carcinogênese. Portanto, a reparação de danos no DNA desempenha um papel fundamental na manutenção da estabilidade genômica e na prevenção do desenvolvimento de câncer. A avaliação da capacidade de reparo do DNA é melhor alcançada medindo a atividade funcional dos sistemas de reparo do DNA. As vias de reparação de danos ao DNA e suas eficiências de reparo são altamente relevantes para o desenvolvimento de medicamentos quimioterapêuticos, validação da função gênica e terapia contra o câncer. Assim, a investigação da eficiência de reparo de vias individuais de reparo de danos ao DNA tem importância teórica e prática importante. Esta revisão resume as principais vias de reparação de danos ao DNA, os métodos usados para avaliar a eficiência do reparo e as vantagens e limitações dessas abordagens.

Introdução

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O sistema de reparação de danos ao DNA é um mecanismo crítico de defesa celular que mantém a estabilidade genômica ao reduzir a frequência das mutações e suprimir a^{carcinogênese 1}. Diferentes tipos de dano ao DNA são reparados por vias de reparo distintas, porém^{interconectadas.} Por exemplo, descompassos de base gerados durante a replicação do DNA são corrigidos por meio do reparo de descorrespondência (MMR), enquanto bases quimicamente modificadas, como bases alquiladas, são principalmente reparadas por reparação por excisão de bases (BER⁾³. Os 6-4 fotoprodutos induzidos pelo ultravioleta (UV) e os adutos nucleotídeos volumosos gerados por certos agentes químicos são removidos por meio do reparo por excisão de nucleotídeos (NER). O dano da ligação cruzada entre fitas (ICL) é reparado por meio das atividades coordenadas das proteínas associadas à via⁴ da anemia de Fanconi. Quebras de fita simples (SSBs) são reparadas pelo caminho de reparo de quebra de fita simples (SSBR), enquanto rupturas de fita dupla (DSBs) são principalmente reparadas por união de extremidades não homólogas (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR). Na maioria dos casos, lesões complexas de DNA são resolvidas por meio de interações coordenadas entre múltiplas vias de reparação do DNA⁵.

A avaliação do dano ao DNA e da eficiência de reparo em células normalmente depende de uma combinação de abordagens experimentais, incluindo o ensaio Cometa, imunofluorescência (IF), Western blotting (WB), reativação da célula hospedeira (HCR) e ensaios de reparação baseados em plasmídeos. Esses métodos avaliam o dano e o reparo do DNA detectando quebras de fitas de DNA, marcadores de dano ao DNA e a expressão ou localização de proteínas associadas ao^{reparo 6}. No entanto, a quantificação precisa da eficiência do reparo celular geralmente requer ensaios dinâmicos baseados em desafio. Nessas abordagens, lesões específicas de DNA são induzidas experimentalmente, e as células são amostradas em pontos de tempo sequenciais para monitorar a formação e eliminação dos sinais de dano. A comparação dos níveis de dano residual ao longo do tempo em relação à carga inicial do dano permite uma avaliação quantitativa da cinética do reparo e da funcionalidade das vias.

Para comparar sistematicamente as características e aplicações dos ensaios de eficiência de reparação de danos ao DNA atualmente disponíveis, esta revisão resume os principais métodos de detecção de acordo com cinco parâmetros: especificidade de lesão/substrato, resolução analítica, sensibilidade, capacidade quantitativa e requisitos de instrumentação (Tabela 1). Esta revisão tem como objetivo fornecer um guia metodológico prático para selecionar abordagens adequadas para investigar vias de reparação de danos no DNA em pesquisas básicas, translacionais e clínicas.

Método de detecção	Especificidade de lesão/substrato	Resolução analítica	Limiar de sensibilidade/detecção	Produção quantitativa vs. qualitativa	Requisitos de instrumentação
Western blot	CPDs, 6-4PPs, proteínas de reparação (ex.: MGMT, RAD51)	População	Moderado	Semi-quantitativo	Eletroforese proteica, transferência de membrana, sistema de imagem por quimioluminescência
Imunofluorescência	CPDs, focos DSB (por exemplo, γ-H2AX, RAD51)	Célula única	Moderado	Semi-quantitativo	Microscópio de fluorescência
HPLC-MS/MS	DPC, 6-4PPs, danos na base oxidativa e alquilativa	População/In vitro	Extremamente alto	Quantitativo	HPLC-MS/MS
Ensaio de atividade enzimática MGMT	Dano por alquilação O⁶-meG	População/In vitro	Alto	Quantitativo	Leitor de microplacas
Ensaio de cometa	SSBs, DSBs, bases oxidadas (com pré-tratamento FPG/OGG)	Célula única	Alto	Quantitativo	Sistema de microscópio de fluorescência/eletroforese
Ensaio de incisão	Locais de AP, incisões NER, incisões BER	População/In vitro	Alto	Quantitativo	Imagem em gel, radiomarcação/detecção de fluorescência
Sistema de reparo reconstituído	Dano base específico do local, pontos de AP, quebras de fio	In vitro	Alto	Quantitativo	Eletroforese em gel, detecção de fluorescência/EM
Ensaio de reparo baseado em plasmídeos	Danos específicos do local	População	Moderado	Quantitativo	Leitor de microplacas, citômetro de fluxo, contagem de colônias
Ensaio do repórter	Danos específicos do local; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	População	Alto	Quantitativo	Leitor de microplaca, citômetro de fluxo, microscópio de fluorescência
HCR/FM-HCR	Danos por UV, cruzamentos de platina, danos específicos para o local	População	Alto	Quantitativo	Citômetro de fluxo, detector de fluorescência/quimioluminescência
RADD	Dano ao DNA em amplo espectro	Célula única	Extremamente alto	Quantitativo	Microscópio de fluorescência de molécula única
qPCR	Dano por raios UV, lesões que bloqueiam a cadeia	População	Moderado	Quantitativo	Instrumento qPCR em tempo real
Detecção de MSI	Instabilidade associada à deficiência MMR de microssatélites	População	Moderado	Qualitativo	Instrumento de PCR/Eletroforese capilar
DR-GFP/EJ5-GFP	Reparo DSB mediado por HR e NHEJ	População	Alto	Quantitativo	Citômetro de fluxo/microscópio de fluorescência
BÊNÇÃO/FELICIDADE	Mapeamento de DSB em todo o genoma	Célula única	Extremamente alto	Quantitativo	Sequenciador de alta taxa de transferência
iPOND	Proteínas DDR em reparos associados a forks de replicação/TLS	Fork/proteoma de replicação	Alto	Semi-quantitativo	Plataforma de espectrometria/sequenciamento de massa

Tabela 1: Comparação sistemática dos métodos para detectar a eficiência de reparação de danos no DNA. Comparação de métodos comumente usados para avaliar a eficiência da reparação de danos ao DNA em múltiplas vias de reparo. A tabela resume a especificidade de lesões ou substratos, resolução analítica, sensibilidade, capacidade quantitativa e requisitos de instrumentação para cada ensaio, incluindo abordagens bioquímicas, moleculares e baseadas em células.

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Revisão e perspetiva

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1. Reparo direto (DR)

Reparo direto (DR) é a forma mais simples de reparo do DNA e refere-se à restauração direta do DNA danificado sem a remoção de bases ou^{nucleotídeos.} A DR repara principalmente dois tipos principais de lesões de DNA. A primeira é o dano do dímero de ciclobutano pirimidina (DPC) induzido pela radiação ultravioleta (UV). Em muitos organismos, a fotoliase reconhece e liga dímeros de pirimidina. Após a exposição à luz visível, a fotoliase é ativada, reverte diretamente o dano ao DNA e então se dissocia da molécula de DNA. Esse mecanismo de fotoreativação é particularmente importante em plantas e organismos inferiores. No entanto, mamíferos placentários, incluindo humanos, não possuem fotoliase funcional e, portanto, não conseguem realizar a fotoreativação. Consequentemente, o dano à DPC induzido por UV em células humanas é reparado principalmente por meio da reparação por excisão de nucleotídeos (NER⁾⁸.

O segundo grande tipo de dano reparado por DR é o dano base induzido por alquilação. O reparo é mediado pela O 6-alquilguanina-DNA alquiltransferase (AGT), também conhecida como O^{6-metilguanina-DNA} metiltransferase (MGMT). Essa enzima transfere grupos alquilos da posição^O6 dos resíduos de guanina para si mesma, restaurando assim diretamente a base de DNA danificada.

Métodos para detectar eficiência de DR

Detecção da eficiência do reparo para danos em DPC induzidos pela radiação ultravioleta (UV)
1. Ensaio Western blot (WB) para detectar mudanças no conteúdo do CPD
  Usando anticorpos específicos para DPC, os investigadores podem detectar mudanças na abundância de DPC em diferentes momentos após a irradiação UV e inferir a eficiência do reparo a partir do nível de dano residual. Maior eficiência de reparo corresponde a uma remoção mais rápida de DPC. A detecção de DPC baseada em WB é uma abordagem clássica e eficaz para avaliar a atividade de reparo do DNA; No entanto, existem várias limitações. Primeiro, o ensaio mede os níveis médios de dano entre populações celulares e, portanto, não possui resolução de célula única. Segundo, e mais importante, o ensaio não pode distinguir entre vias de reparo. Como as DPCs em células humanas são principalmente reparadas por meio de NER, a análise de BB sozinha não pode diferenciar se a atividade de reparo observada reflete reparação mediada pela fotoliase ou a atividade de NER sem contexto experimental adicional.
2. Posicionamento da imunofluorescência (IF) Mudanças dinâmicas no foco da DPC
  Células submetidas à irradiação UV e ao tratamento de fotorreparo podem ser coradas usando anticorpos específicos para CPD, e mudanças nos focos nucleares de CPD podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência. A análise quantitativa da formação e eliminação dos focos de DPC permite avaliar a capacidade de reparo do DNA tanto em nível populacional quanto em célula única. A taxa de desaparecimento dos focos de CPD reflete diretamente a eficiência do reparo. O FI fornece visualização espacial e temporal da dinâmica de reparo dentro de células individuais e permite a detecção da heterogeneidade célula para célula. No entanto, sinais de fluorescência são suscetíveis à extinção, e a análise quantitativa frequentemente depende da contagem manual, que introduz subjetividade. Em células de mamíferos que não possuem atividade de fotoreativação, esse método reflete principalmente a eficiência de reparo mediada pelo NER.
3. Cromatografia líquida de alta performance com espectrometria de massas (HPLC-MS/MS) para análise quantitativa de DPC
  O DNA extraído é digerido enzimaticamente em nucleosídeos, após o que as DPCs são separadas dos nucleossídeos normais por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A análise quantitativa é posteriormente realizada usando espectrometria de massa em tandem (MS/MS). A eficiência do reparo é determinada comparando a abundância de CPD antes e depois do^{reparo 9}. O HPLC-MS/MS oferece especificidade extremamente alta e sensibilidade em nível picomolar; no entanto, o método requer instrumentação cara, preparação complexa da amostra e não reflete o estado de reparo in situ das células intactas. Em amostras de células humanas, o resultado de reparação medido reflete predominantemente a atividade do NER.
Eficácia da reparação de danos na base do DNA induzida por agentes alquilantes
1. Ensaio de Atividade Enzimática MGMT
  A eficiência de reparo do dano ao DNA induzido por agentes alquilantes é comumente avaliada medindo a atividade^{MGMT 10}. Substratos de DNA metilado marcados radioativamente são usados para monitorar a transferência de grupos metilo do DNA danificado para a proteína MGMT, permitindo assim uma avaliação quantitativa da eficiência do reparo.
2. Relatando ensaio gênico para detectar eficiência de reparo de O^6-meG
  Plasmídeos repórteres contendo lesões de O 6-metilguanina (O^6-meG) podem ser construídos para avaliar a eficiência do reparo. A lesão introduzida suprime a expressão gênica do repórter até que o reparo mediado por MGMT restaure a atividade do repórter. A eficiência do reparo é subsequentemente quantificada medindo os níveis de expressão gênica dos repórteres. Ensaios genéticos repórteres fornecem avaliação intuitiva e quantitativa da atividade de reparo em células^{vivas 11}. No entanto, esses ensaios exigem a construção de vetores específicos para lesões e envolvem ciclos experimentais relativamente^{longos 12}.
Eficiência de reparo de danos após a detecção de quebra da corrente
1. Ensaio do Cometa
  O ensaio Cometa, também conhecido como eletroforese em gel de célula única (SCGE), é um método sensível para detectar quebras de fitas de DNA no nível de célula única. Fragmentos de DNA danificados migram do núcleo durante a eletroforese, formando caudas semelhantes às de cometas, enquanto o DNA intacto permanece concentrado na região nuclear. Parâmetros como comprimento da cauda do cometa, conteúdo de DNA da cauda e momento caudal podem ser quantificados usando microscopia de fluorescência e softwares de análise de imagens. Essas métricas permitem a avaliação quantitativa da gravidade da quebra da fita de DNA. Ao comparar os perfis dos cometas imediatamente após a indução de danos ao DNA com os obtidos após o reparo, a eficiência do reparo pode ser^{estimada em 13}.
  O ensaio Cometa oferece várias vantagens, incluindo operação simples, custo relativamente baixo, alta sensibilidade e resolução de célula única. O aprimoramento adicional desse método levou ao desenvolvimento de variantes modificadas por enzimas e ensaios de reparo de DNA in vitro baseados em cometas, que podem ser usados para avaliar as atividades do BER e NER.

2. Reparo por excisão de base (BER)

O reparo por excisão de bases (BER) é uma via de reparação do DNA altamente conservada que remove principalmente pequenas lesões de base geradas por oxidação, alquilação e^{desaminação 14}. O BER compartilha uma sobreposição mecanicista substancial com o reparo de quebra de fita única (SSBR), e certos eventos SSBR são considerados extensões do BER. De acordo com o comprimento do patch de reparo, o BER é categorizado em BER de patch curto (SP-BER) e BER de patch longo (LP-BER).

A BER é iniciada por glicosilases de DNA que reconhecem e excisam as bases danificadas ao cortar a ligação N-glicosídica entre a base e a desoxirribose, gerando assim os sítios apurínicos/apirimidínicos^{(AP) 15}. A endonuclease AP 1 (APE1) subsequentemente cliva a espinha dorsal do DNA no lado 5′ do sítio AP, produzindo terminais fosfato 3′-OH e 5′-desoxirriboso (dRP). Durante o SP-BER, o grupo dRP é removido, a DNA polimerase β (Polβ) preenche a lacuna do nucleotídeo único e a ligase de DNA III (LigIII) completa a ligação.

O reparo de quebras de fita simples induzidas por alquilação contendo terminais bloqueados em 3′ segue um mecanismo semelhante, mas requer processamento adicional nas extremidades. A polinucleotídea quinase 3′-fosfatase (PNKP) primeiro remove terminais anormais 3′ para gerar um grupo 3′-OH adequado. O Polβ então preenche o nucleotídeo ausente, e o LigIII sela a marca para completar o reparo.

Métodos para detectar eficiência do BER

Ensaio de cometa modificado por enzimas
O ensaio Comet modificado por enzimas estende o ensaio padrão ao incorporar enzimas reparadoras específicas para lesão. Essas enzimas reconhecem e clivam as bases danificadas, convertendo lesões que de outra forma não seriam detectadas em quebras de fio detectáveis. A intensidade resultante da cauda do cometa reflete o nível de dano ao DNA¹⁶˒¹⁷.
Para avaliar a eficiência da BER, formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG) ou seu homólogo mamífero, a 8-oxoxanina DNA glicosilase (OGG1), é usada para converter lesões de bases oxidadas em quebras de fita simples, que são posteriormente analisadas usando o ensaio^{Comet 18}.
Ensaio de incisão
O ensaio de incisão é uma abordagem central in vitro para avaliar a atividade da BER. Substratos de DNA contendo sítios AP são incubados com enzimas purificadas ou extratos celulares, e a proporção de substratos de DNA clivado é quantificada. Este ensaio reflete diretamente a atividade incisiva mediada por APE1 e oferece alta especificidade e sensibilidade, minimizando a interferência do ambiente intracelular¹⁹.
No entanto, o ensaio de incisão não recapitula totalmente a atividade da BER em células vivas porque não consegue avaliar a regulação dinâmica do processo completo de reparo, incluindo reconhecimento de lesões, excisão de bases, clivagem do sítio AP, síntese de DNA e^{ligadura 20}.
Sistema de reparo reconstituído
O sistema de reparo reconstituído é uma plataforma experimental in vitro que reconstrói vias de reparo do DNA usando proteínas purificadas de reparação. Esse sistema permite uma análise detalhada das funções moleculares e interações das proteínas individuais de reparação e é amplamente utilizado em estudos mecanicistas e triagem de medicamentos.
Para avaliar a eficiência da BER, glicosilases purificadas, endonucleases AP, DNA polimerases e ligases são incubados sequencialmente com substratos de DNA danificados para reconstituir o reconhecimento, excisão, síntese e ligação de lesões. Os produtos de reparo são analisados por eletroforese em gel, marcação por fluorescência ou espectrometria^{de massa 21}. Embora essa abordagem permita estudos mecanicistas altamente controlados, ela não leva em conta a estrutura da cromatina nem a regulação celular global da atividade de^{reparo 22}.
Ensaio de reparo baseado em plasmídeos
Ensaios de reparo baseados em plasmídeos envolvem a introdução de plasmídeos contendo lesões de DNA definidas em células hospedeiras ou incubação com extratos celulares contendo enzimas de reparação, seguida de avaliação da eficiência do reparo usando ensaios repórteres, citometria de fluxo ou análise de formação^{de colônias 23}.
Para avaliar a eficiência do BER, plasmídeos contendo danos oxidativos ao DNA são incubados com extratos celulares e posteriormente transformados em cepas bacterianas deficientes em reparo, como Escherichia coli. A eficiência do reparo é então estimada a partir das taxas de formação de colônias.
Ensaio gênico do repórter
Os ensaios de genes repórteres avaliam indiretamente a eficiência da reparação do DNA ou a atividade reguladora do gene medindo a restauração da expressão gênica^{repórter 24}. Nesses ensaios, lesões de DNA ou elementos regulatórios são incorporados aos construtos do repórter, e a eficiência do reparo é quantificada por meio de mudanças na atividade do repárter após o reparo.
Para a análise BER, uma lesão 8-oxoG pode ser inserida na região codificante de um gene repórter de luciferase. Se a lesão permanecer sem reparação, a translação é interrompida; O reparo bem-sucedido restaura a expressão proteica repórter de comprimento completo. Plasmídeos não danificados, como vetores luciferase de Renilla pRL-TK, são comumente usados como controles internos.
Reativação da célula hospedeira (HCR)
A reativação da célula hospedeira (HCR) é um ensaio clássico que avalia indiretamente a eficiência da reparação do DNA ao medir a capacidade das células hospedeiras de restaurar a expressão a partir de plasmídeos repórteres^{danificados 25}. Plasmídeos que carregam lesões definidas, como dímeros de pirimidina induzidos por UV ou cruzamentos quimicamente induzidos, são transfectados nas células hospedeiras. A eficiência do reparo é subsequentemente quantificada medindo a expressão gênica do repórter.
Os ensaios HCR proporcionam alta sensibilidade e permitem a avaliação da atividade de reparação em relação a tipos específicos de lesão. No entanto, é necessário um transfecção eficiente e preparação de plasmídeos danificados de alta qualidade. Uma limitação importante da HCR convencional é que o tratamento de plasmídeos com agentes que prejudicam o DNA frequentemente gera populações heterogêneas de lesões em todo o plasmídeo, complicando assim a interpretação^{mecanicista 26}.
Para abordar essas limitações, foram desenvolvidos ensaios de reativação de células hospedeiras baseados em citometria de fluxo (FM-HCR), utilizando plasmídeos específicos de lesão única. O FM-HR permite uma análise quantitativa rápida da atividade de reparo em células vivas, embora o ensaio exija instrumentação especializada e tenha limitações para análise mecanicista simultânea de múltiplas vias^{BER 27}.
Ensaios de reativação de células hospedeiras de placas (PL-HCR) baseados em substratos específicos de BER para lesões também foram desenvolvidos para investigar mecanismos de BER em células vivas (Figura 1)²⁸. Nessa abordagem, plasmídeos contendo uma única lesão de^1,N 6-etenoadenina (εA) são introduzidos nas células de mamíferos. Após o reparo, o DNA plasmídico é recuperado, digerido com enzimas de restrição, transformado em E. coli e quantificado por análise de formação de placas. Plasmídeos completamente reparados tornam-se linearizados após a digestão de restrição e deixam de gerar placas, enquanto plasmídeos não reparados ou incompletamente reparados permanecem circulares e formam placas. Portanto, a eficiência do BER é determinada pela quantificação das placas.
Detecção de danos assistida por reparo
A detecção de danos assistida por reparo (RADD) é um método de molécula única para detectar e quantificar danos ao DNA²⁹. Nessa abordagem, enzimas de reparação específicas de lesões reconhecem e excisam as bases danificadas, após o que as DNA polimerases incorporam nucleotídeos marcados fluorescentemente nas lacunas resultantes. As moléculas de DNA são posteriormente visualizadas por microscopia de fluorescência, permitindo a detecção e quantificação direta de lesões de DNA (Figura 2)³⁰.
O RADD fornece análises qualitativas e quantitativas altamente sensíveis de danos ao DNA em nível de molécula única. No entanto, o método mede principalmente a carga de dano ao DNA, em vez de avaliar diretamente a cinética de reparo ou a eficiência geral do reparo em populações celulares.

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Figura 1: Reativação da célula hospedeira da placa (PL-HCR). O DNA circular de fita simples M13mp18 contendo uma lesão definida é transfectado em células competentes. Após a transfecção, as células são cultivadas em placas de ágar para permitir a formação da placa. O DNA M13 replicativo é posteriormente isolado das placas, digerido com enzimas de restrição e analisado por eletroforese em gel para distinguir produtos mutantes e selvagens e determinar se a reparação da lesão ocorreu. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Detecção de danos assistida por reparo (RADD). Lacunas de fita simples geradas durante o reparo do DNA são preenchidas com nucleotídeos marcados com biotina. Avidina ou estreptavidina marcada fluorescentemente é então usada para detectar nucleotídeos incorporados, permitindo avaliação quantitativa dos níveis de dano ao DNA por meio de análise de fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

A reparação por excisão de nucleotídeos (NER) é uma importante via de reparo do DNA responsável por remover lesões volumosas de DNA que distorcem a dupla hélice³¹ do DNA. Substratos de NER incluem dímeros ciclobutano pirimidina induzidos por UV (CPDs), fotoprodutos de 6-4 pirimidina-pirimidona (6-4PPs), lesões oxidativas de purinas, adutos químicos volumosos e ligações intrastrand induzidas por^{cisplatina 32}. Defeitos na NER estão associados a distúrbios como a xeroderma pigmentosa, caracterizada por extrema sensibilidade aos raios UV e maior suscetibilidade ao câncer.

O NER consiste em dois principais subcaminhos: o genoma global NER (GG-NER⁾³³ e o NER acoplado à transcrição (TC-NER⁾³⁴. O GG-NER examina todo o genoma em busca de lesões que distorcem a hélice, suprimindo assim a mutagênese e a carcinogênese. Em contraste, o TC-NER remove seletivamente lesões bloqueadoras de transcrição de genes transcritos ativamente e é essencial para manter a integridade transcricional. Defeitos no TC-NER contribuem para distúrbios como a síndrome de Cockayne e a síndrome sensível aos raios UV³⁵.

Métodos para detectar eficiência do NER

Ensaio de incisão
O ensaio de incisão avalia a eficiência do NER detectando incisões em fitas introduzidas em locais de dano ao DNA por proteínas de reparação. Neste ensaio, substratos de DNA danificados, como DNA irradiado UV contendo DPCs, são incubados com proteínas de reparação ou extratos celulares, e produtos de incisão são posteriormente^{detectados 36}.
A radiomarcação ou marcação por fluorescência podem ser usadas para melhorar a sensibilidade e permitir o monitoramento preciso da atividade^{incisiva 37}. O ensaio mede diretamente a atividade das principais proteínas NER responsáveis pelo reconhecimento e excisão de danos. No entanto, a implementação bem-sucedida requer a preparação de substratos danificados de alta qualidade e extratos de proteína ativa.
Ensaio de reparação enzimática de cometa
A eficiência do NER também pode ser avaliada usando ensaios Comet modificados por enzimas. Nessa abordagem, a endonuclease T4 V é incubada com células danificadas para converter dímeros de pirimidina em quebras de fita simples detectáveis, que são posteriormente analisadas usando o ensaio^{Cometa 38}.
PCR quantitativa de fluorescência em tempo real (qPCR)
A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) avalia indiretamente a eficiência da reparação do DNA ao medir os efeitos inibitórios das lesões de DNA na amplificação da^{PCR 39}. Durante a análise de NER, a irradiação UV é usada pela primeira vez para induzir dímeros de pirimidina. Essas lesões impedem a progressão da DNA polimerase e reduzem a eficiência da amplificação, resultando em aumento dos valores do limiar do ciclo (Ct). Após o reparo pela via NER, a integridade do DNA é restaurada e a eficiência da amplificação melhora, levando a valores de Ct mais baixos. A eficiência do reparo pode, portanto, ser quantificada comparando a amplificação antes e depois do reparo em relação a uma região de controle^{interno 40} intacta.
Além disso, a qPCR pode ser usada para avaliar os níveis de expressão de genes envolvidos nas vias de sinalização e reparo de danos ao DNA, incluindo ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A e XPC, refletindo indiretamente a capacidade de reparo^{do DNA 41}.
Reativação de células hospedeiras baseada em citometria de fluxo (FM-HCR)
Os ensaios FM-HCR utilizam plasmídeos específicos de local contendo lesões transfectados nas células hospedeiras e quantificam a eficiência de reparo por meio de análise citométrica de fluxo da intensidade de fluorescência e da proporção de células fluorescentes (Figura 3)⁴²˒⁴³. O aumento da intensidade da fluorescência geralmente reflete uma maior capacidade de reparo do DNA⁴⁴˒⁴⁵.
Sequenciamento de reparo por excisão (XR-seq)
O sequenciamento por reparação por excisão (XR-seq) é uma técnica genômica ampla para mapear a atividade do NER com resolução de nucleotídeo único. Esse método enriquece e sequencia seletivamente oligonucleotídeos contendo danos removidos durante o NER, gerando assim mapas de alta resolução da atividade de reparo em todo o genoma. O XR-seq permite uma análise quantitativa da eficiência do reparo e dos padrões de distribuição associados tanto às vias GG-NER quanto TC-NER, e representa um grande avanço tecnológico na pesquisa sobre NER.
Como a NER consiste em duas vias mecanicamente distintas e envolve numerosas proteínas de reparação, são necessários múltiplos métodos complementares para uma avaliação abrangente da atividade de^{reparo 46}˒⁴⁷. Além dos métodos descritos acima, a eficiência do NER também pode ser avaliada usando Western bloting, ensaios de imunofluorescência, ensaios de reparação baseados em plasmídeos e ensaios com genes repórteres.

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Figura 3: Princípio de detecção da reativação da célula hospedeira baseada em citometria de fluxo (FM-HCR). Plasmídeos contendo quatro tipos distintos de dano ao DNA são co-transfectados em células de mamíferos cultivadas. A capacidade de reparo do DNA (DRC) é subsequentemente quantificada por citometria de fluxo com base na intensidade de fluorescência do repórter. DRC, capacidade de reparo de DNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Reparo de desajuste (MMR)

O reparo de descorrespondência (MMR) é uma via pós-replicativa de correção de erros responsável por reparar descompassos de base, como os despares G-T e A-C, bem como pequenos laços de inserção-deleção gerados durante a replicação do DNA⁴⁸. O MMR é iniciado quando o MutS reconhece bases incompatíveis, após o que o MutL recruta fatores de reparo posteriores e exonucleases para ativar o processo^{de reparo 49}. Um passo crítico na MMR é a discriminação entre as cadeias de DNA parental e as recém-sintetizadas⁵⁰.

Nos procariotos, a discriminação das fitas é alcançada por meio da metilação do DNA, que marca a fita parental. Nos eucariotos, a identidade da cadeia é determinada por cortes transitórios em DNA recém-sintetizado e interações com antígeno nuclear celular proliferante (PCNA). A MMR melhora substancialmente a fidelidade da replicação e desempenha um papel essencial na manutenção da estabilidade^{genômica 51}. Defeitos na MMR estão fortemente associados a múltiplos tipos de câncer, incluindo a síndrome de Lynch.

Métodos para avaliar a eficiência da MMR

Testes de instabilidade de microssatélites
MMR defeituosa resulta em falha em corrigir erros de deslizamento de replicação em loci de microsatélites, levando à instabilidade de microssatélites (MSI). O teste MSI envolve amplificação por PCR de marcadores microssatélites representativos seguida de análise de fragmentos baseada em eletroforese capilar. Instabilidade em múltiplos loci indica atividade MMR comprometida, enquanto perfis estáveis de microssatélites indicam função MMR intacta. O teste MSI oferece alta sensibilidade e especificidade para identificar deficiência de MMR; no entanto, continua sendo uma medida indireta da função da MMR e não avalia quantitativamente a eficiência do reparo.
Plasmídeos repórteres contendo desajustes definidos ou laços de inserção-deleção também podem ser usados para avaliar a eficiência da MMR por meio de ensaios com genes repórteres. Além disso, ensaios de Western blot e imunofluorescência direcionados a proteínas associadas à MMR podem fornecer avaliação indireta da atividade das vias.

5. Reparo por quebra de fio duplo (DSB)

Quebras de fita dupla (DSBs) estão entre as formas mais citotóxicas de dano ao DNA. A falha em reparar os DSBs com precisão pode resultar em mutações, deleções cromossômicas, translocações, instabilidade genômica e tumorigênese. O reparo do DSB ocorre principalmente por meio da recombinação homóloga (HR) e da união final não homóloga (NHEJ), que operam preferencialmente durante diferentes fases do ciclo celular⁵².

Métodos para avaliar a eficiência do reparo do DSB

Ensaio de focos gamma-H2AX
O ensaio de focos γ-H2AX é um dos métodos mais amplamente utilizados para detectar DSBs de forma indireta. Após a formação do DSB, a histona H2AX é rapidamente fosforilada em Ser139 para gerar focos γ-H2AX. O número de focos γ-H2AX correlaciona-se com a extensão da formação de DSB, e a eficiência do reparo pode ser inferida monitorando a taxa de desaparecimento dos focos ao longo do tempo usando microscopia de imunofluorescência.
Este ensaio oferece várias vantagens, incluindo alta sensibilidade, resolução de célula única e protocolos experimentais estabelecidos, tornando-o um método central na pesquisa sobre resposta a danos ao DNA (DDR).
BÊNÇÃO E FELICIDADE
BLESS (Marcagem de Quebras, Enriquecimento em Estreptavidina e Sequenciamento) e BLISS (Marcagem In Situ e Sequenciamento de Quebras) são métodos de mapeamento de DSB em todo o genoma baseados em marcação in situ e sequenciamento de alta produtividade. Ambas as abordagens identificam sítios DSB por meio da ligação direta de adaptadores de sequenciamento em extremidades de DNA quebradas, permitindo a localização e quantificação precisas em todo o genoma dos DSBs. Esses métodos também podem ser usados para avaliar a cinética geral de reparo do DSB.
Além disso, ensaios geneais repórteres específicos para DSB podem avaliar quantitativamente a eficiência da reparação da DSB e distinguir a reparação mediada pela HR da reparação mediada pela NHEJ (Figura 4). No entanto, embora os ensaios γ-H2AX, BLESS e BLISS meçam efetivamente a carga global do DSB e a cinética de reparo, eles não podem determinar se o reparo ocorreu especificamente por meio das vias HR ou NHEJ.

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Figura 4: Ensaio do gene repórter para reparo de quebra de fita dupla (DSB). Plasmídeos repórteres do DSB são introduzidos nas células-alvo. Após um período de reparo apropriado após a transfecção, a fluorescência do gene repórter é monitorada usando microscopia de fluorescência para avaliar a eficiência do reparo do DSB. DSB, quebra de dupla linha. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Reparo por recombinação homóloga (HR)

A recombinação homóloga (HR) é uma via de reparação do DNA de alta fidelidade que funciona principalmente durante as fases S e G2 do ciclo celular, quando uma cromátida irmã não danificada está disponível como molde de^{reparo 53}. Após a formação do DSB, o complexo MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) reconhece as extremidades do DNA e inicia a resseção das extremidades do DNA em cooperação com a CtIP⁵⁴. Esse processo gera saliências de DNA de fita simples de 3′ (ssDNA).

O ssDNA resultante é inicialmente revestido pela proteína de replicação A (RPA), que protege o DNA da degradação da nuclease e impede a formação de estruturas^{secundárias 55}. Subsequentemente, o BRCA2 media a substituição da RPA pela recombinase RAD51, resultando na formação de um filamento de nucleoproteína^{RAD51 56}. Esse filamento busca sequências de DNA homólogas na cromátida irmã e promove a invasão da fita no molde de DNA duplex homólogo, gerando uma estrutura de loop de deslocamento (D-loop)⁵⁷˒⁵⁸. A síntese de DNA e a troca de fitas então prosseguem para o reparo completo.

A eficiência da frequência cardíaca pode ser avaliada quantitativamente usando sistemas de repórter DR-GFP em ensaios de genes repórteres. Alternativamente, avaliações indiretas podem ser realizadas usando ensaios de Western blot ou imunofluorescência direcionados a proteínas associadas à HR.

7. Junção de extremidades do DNA não homóloga (NHEJ)

A união de extremidades não homólogas (NHEJ) repara DSBs sem exigir extensa homologia de sequência entre as extremidades⁵⁹ do DNA. Em vez disso, as extremidades quebradas do DNA são processadas e ligadas diretamente, tornando o NHEJ uma via de reparo inerentemente propensa a erros. Como as extremidades do DNA podem sofrer degradação antes da ligação e as extremidades de DSBs não relacionadas podem ser unidas, o NHEJ pode levar a mutações, deleções e rearranjos^{cromossômicos 60}.

São reconhecidas três formas principais de reparo não homólogo: NHEJ clássico, recozimento de fita simples (SSA) e união de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ).

NHEJ Clássico
O NHEJ clássico opera durante todo o ciclo celular. O heterodímero Ku70/Ku80 primeiro reconhece e liga as extremidades^{DSB 61}. Esse complexo recruta a subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PKcs), levando à ativação da sinalização quinase e à iniciação da NHEJ. Enzimas de processamento final, incluindo nucleases e fosfatases, processam posteriormente terminais de DNA danificados antes que o complexo ligase XRCC4-DNA IV mede a ligação do DNA no^{final 62}. Como o processamento terminal frequentemente resulta em perda de nucleotídeos ou reintegrações imprecisas, o NHEJ é considerado uma via de reparo^{mutagênica 63}˒⁶⁴.
Recozimento de fio simples (SSA)
O recozimento de fita simples (SSA) repara DSBs que ocorrem entre sequências homólogas repetidas. Após a formação do DSB, as nucleases ressecam as extremidades do DNA 5′, gerando saliências estendidas de ssDNA 3′. RAD52 media o recozimento entre repetições homólogas^{complementares 65}. Subsequentemente, o complexo endonuclease XPF-ERCC1 remove retalhos de DNA não emparelhados, e o complexo SLX1-SLX4 também pode participar do processamento final. A ligase de DNA então fecha as lacunas restantes. Como sequências localizadas entre repetições homólogas são excluídas durante o reparo, a SSA é considerada um mecanismo de reparo rápido, mas inerentemente^{mutagênico 66}.
Junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ)
A união de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ), também chamada de NHEJ alternativo (Alt-NHEJ), é outra via de reparação da DSB propensa a^{erros 67}. No MMEJ, sequências microhomólogas curtas localizadas próximas às extremidades de quebra do DNA são usadas para alinhar terminais de DNA quebrados antes do reparo. Após o reconhecimento dessas regiões microhomólogas, as extremidades do DNA são unidas por meio de um processo semelhante à^{recombinação 68}. Como o MMEJ depende de sequências homólogas muito curtas, deleções e rearranjos genômicos ocorrem frequentemente durante o reparo.
A eficiência do NHEJ pode ser avaliada quantitativamente usando sistemas repórteres EJ5-GFP em ensaios de genes repórteres. Alternativamente, a atividade de reparo pode ser avaliada indiretamente por meio de Western blot e análise de imunofluorescência de proteínas associadas à NHEJ.

8. Reparo de ligação cruzada Interstrand (ICL)

Ligações cruzadas entre fitas (ICLs) são lesões altamente tóxicas de DNA que ligam covalentemente as duas fitas da dupla hélice do DNA, bloqueando assim a replicação e transcrição do DNA. O reparo do ICL é mecanicamente complexo e envolve principalmente a via da anemia de Fanconi (FA) e a via^{NEIL3 69}.

Na via FA, o FANCM reconhece lesões de ICL e promove a monoubiquitinação do complexo FANCI-FANCD2, ativando assim as proteínas de reparo^{a jusante 70}. Nucleases específicas da estrutura subsequentemente incisam o DNA próximo à ligação cruzada para separar as duas fitas de DNA, e os DSBs resultantes são reparados por meio de vias HR ou NHEJ.

Na via NEIL3, a glicosilase de DNA NEIL3 cliva ligações glicosídicas associadas à lesão ICL, gerando sítios AP que são posteriormente ignorados pelas polimerases 71 de síntese de translesão (TLS^). Como as ICLs impedem a separação das fitas necessária para replicação e transcrição, essas lesões são altamente citotóxicas e contribuem para o envelhecimento, neurodegeneração e câncer⁷²˒⁷³.

A eficiência do reparo da ICL pode ser avaliada usando ensaios de reparo baseados em plasmídeos, ensaios com genes repórteres, ensaios de reativação de células hospedeiras e sistemas de reparo reconstituídos in vitro .

9. Síntese de translesão (TLS)

A síntese de translesão (TLS) é um mecanismo de tolerância ao dano ao DNA que permite que a replicação continue através de lesões de DNA não^{reparadas 74}. A TLS envolve principalmente DNA polimerases especializadas, incluindo as polimerases κ, η, ι e ζ. Quando a replicação do DNA estagna nos locais danificados, as polimerases TLS contornam a lesão e permitem que a replicação prossiga, mantendo assim a estabilidade^{do genoma 75}.

Ao contrário do BER, NER, MMR, HR e NHEJ, que removem ou reparam diretamente lesões de DNA, o TLS não elimina danos ao DNA. Em vez disso, ele contorna lesões não reparadas durante a replicação do DNA e, portanto, é classificado como um mecanismo de tolerância a danos, em vez de uma via canônica de^{reparo do DNA 76}.

O TLS pode ser dividido em caminhos de desvio sem erros e propensos a erros. O TLS sem erros insere o nucleotídeo correto oposto à lesão, enquanto o TLS propenso a erros frequentemente introduz nucleotídeos incorretos e contribui para a mutagênese. A TLS propensa a erros é considerada um dos principais mecanismos pelos quais os carcinogênicos ambientais induzem mutações genômicas. Consequentemente, a modulação das vias TLS propensas a erros pode representar uma estratégia potencial para prevenção e terapia do câncer⁷⁷.

Métodos para avaliar a eficiência do TLS

Isolamento de Proteínas em DNA Nascente (iPOND)
O isolamento de proteínas em DNA nascente (iPOND) é uma técnica usada para analisar proteínas associadas ao DNA recém-sintetizado em forquilhadores de replicação parados. Como a atividade do TLS ocorre frequentemente em forquilhadas paradas, o iPOND possibilita a análise dinâmica do recrutamento e montagem das polimerases TLS e das proteínas de resposta ao dano ao DNA (DDR) durante o estresse de replicação. Esse método, portanto, pode ser usado para avaliar a atividade do TLS e os processos de reparo acoplado por replicação.
A eficiência do TLS também pode ser avaliada usando plasmídeos repórteres contendo lesões de DNA específicas do TLS em ensaios geneicos repórteres. Além disso, ensaios de Western blot e imunofluorescência direcionados a proteínas associadas à TLS podem fornecer avaliação indireta da atividade das vias.

10. Considerações de controle de qualidade e reprodutibilidade no desenho experimental

Replicação biológica e replicação técnica
Uma distinção clara entre réplicas biológicas e réplicas técnicas é essencial para garantir confiabilidade e reprodutibilidade em estudos de reparo de DNA. Em geral, pelo menos três réplicas biológicas independentes devem ser incluídas para cada experimento, enquanto o número de réplicas técnicas deve ser determinado de acordo com a variabilidade da plataforma de detecção.
Para ensaios de célula única, como o ensaio Cometa e a análise de focos baseada em imunofluorescência, pelo menos 50–100 células devem ser analisadas por réplica biológica para minimizar o viés de amostragem. Em ensaios repórteres baseados em citometria de fluxo, incluindo ensaios DR-GFP e FM-HCR, um mínimo de 10.000 eventos de células vivas deve ser coletado por amostra para garantir robustez estatística.
Estratégia de padronização
A comparação quantitativa precisa da eficiência do reparo entre diferentes amostras ou lotes experimentais requer rigorosos procedimentos de normalização para minimizar a variação sistemática decorrente de diferenças na eficiência da transfecção, viabilidade celular, carga de amostras e desempenho do instrumento. Estratégias comuns de normalização incluem as seguintes:
1. Co-transfecção de plasmídeos de normalização
  Em ensaios HCR, ensaios de reparo baseados em repórteres e ensaios de reparo baseados em plasmídeos, recomenda-se a co-transfecção com um plasmídeo de normalização não afetado por danos ao DNA. Controles comumente usados incluem plasmídeos de luciferase Renilla pRL-TK ou vetores GFP expressos constitutivamente. A eficiência do reparo é normalizada calculando a razão entre o sinal experimental do repórter e o sinal do repórter de controle.
2. Normalização usando proteínas de manutenção ou coloração total de proteínas
  Em análises Western blot que avaliam a expressão proteica de reparo ou os níveis residuais de CPD, a normalização deve ser realizada usando proteínas de armazenamento, como GAPDH, β-actina ou histona H3, ou por métodos de coloração total de proteínas, incluindo coloração Ponceau S ou REVERT.
3. Controles intactos
  Em ensaios de reparo baseados em qPCR, regiões genômicas não danificadas devem ser coamplificadas como controles internos, e os níveis relativos de dano devem ser calculados usando o método ΔCt. De forma semelhante, os ensaios HCR devem incluir controles de plasmídeos não danificados representando a máxima expressão do repórter, permitindo que a eficiência de reparo seja expressa em relação aos plasmídeos de referência não danificados.
4. Normalização de número de células
  Em ensaios baseados em citometria de fluxo, incluindo ensaios FM-HCR e DR-GFP, números iguais de células viáveis devem ser analisados entre amostras. A eficiência do reparo deve ser posteriormente reportada como a porcentagem de células positivas ou mudanças relativas na intensidade de fluorescência.
Dimensão cinética da medição da eficiência de reparo
O reparo do DNA é um processo dinâmico, e medições obtidas a partir de um único ponto temporal podem não distinguir entre reparação atrasada e deficiência completa da via. Portanto, desenhos experimentais por curso temporal são fortemente recomendados.
Após a indução do dano ao DNA, as amostras devem ser coletadas em múltiplos pontos de tempo sequenciais, como 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para monitorar o acúmulo e a eliminação de marcadores de danos ou produtos de reparo. A cinética do desaparecimento do sinal fornece informações importantes sobre taxa de reparo, integridade das vias e eficiência geral do reparo.
Correção de múltiplas hipóteses:
Abordagens de alto rendimento e multiplexadas frequentemente envolvem análise simultânea de múltiplas vias de reparo ou condições experimentais, aumentando assim o risco de resultados falsos positivos devido a múltiplas comparações estatísticas. Exemplos incluem a avaliação simultânea das atividades BER, NER, RH e NHEJ usando ensaios FM-HCR; análise de DSB genômica usando BLESS ou BLISS; e análise baseada em matriz qPCR da expressão gênica de reparação de DNA.
Assim, métodos de correção estatística para testes múltiplos de hipóteses devem ser pré-definidos durante o desenho experimental. Os métodos de correção selecionados e os limiares ajustados de significância devem ser claramente reportados nas seções de Materiais e Métodos e análise estatística.

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Conclusões

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Detecção precisa e análise quantitativa dos processos de reparação de danos ao DNA são essenciais para entender os mecanismos moleculares subjacentes à reparação do DNA, avaliar os efeitos biológicos das exposições ambientais e avaliar respostas terapêuticas⁷⁸. Portanto, a investigação aprofundada das vias de reparação de danos ao DNA e da eficiência do reparo tem grande importância tanto em pesquisas básicas quanto em aplicações^{clínicas 79}...

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Divulgações

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Os autores declaram que não há interesses financeiros ou relacionamentos pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste estudo.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa em Engenharia da Província de Jiangsu para o Desenvolvimento e Tradução de Tecnologias-Chave para a Prevenção e Controle de Doenças Crônicas; a Equipe de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021); o Programa do Centro de Pesquisa em Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023); a Fundação Natural Science Key das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (Bolsa nº 24KJA310008); o Programa Chave da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (Bolsa nº szwzy202406); e o Laboratório Estadual Chave de Medicina e Proteção por Radiação, Universidade Soochow (Bolsa nº GZK1202506).

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