Um protocolo de montagem em fita para imagem em Z-stack de alta resolução de olhos compostos de Drosophila

Summary

O objetivo principal deste protocolo é possibilitar a imagem não destrutiva e a análise quantitativa dos olhos compostos de Drosophila. Ele combina uma estratégia de montagem em fita com aquisição estereomicroscópica de pilha Z e reconstrução por Profundidade de Foco Estendida para produzir imagens de alta resolução e sem artefatos.

Abstract

Aqui, apresentamos um protocolo de montagem e imagem não destrutivo para análise fenotípica de alta resolução do olho composto de Drosophila. A fenotipagem precisa do olho composto de Drosophila é frequentemente limitada por sua geometria convexa e fragilidade mecânica durante o manuseio. Para resolver isso, detalhamos um fluxo de trabalho de imagem versátil e não invasivo que permite visualização em alta resolução a partir de múltiplas perspectivas. O protocolo utiliza uma estratégia personalizada de fixação adesiva em uma plataforma de fita invertida, prendendo as moscas pelo corpo e pelas asas, deixando a cabeça completamente intocada. Crucialmente, essa configuração flexível suporta orientações de montagem distintas: uma posição lateral para capturar toda a convexidade dos olhos individuais e uma posição frontal para avaliar a simetria da cabeça inteira. Esse método também facilita o arranjo de matrizes de alta densidade, permitindo o processamento rápido de 20–30 amostras por sessão. Ao integrar a estereomicroscopia de luz refletida com a aquisição por pilha Z e a reconstrução por Profundidade de Foco Estendida (EDF), o fluxo de trabalho gera imagens compostas quase 3D uniformemente nítidas. Essa abordagem preserva a pigmentação natural e produz imagens de alta fidelidade e ricas em contraste, adequadas para análise fenotípica quantitativa em escala de órgãos.

Introduction

O olho composto de Drosophila melanogaster é um modelo clássico e poderoso para estudar o crescimento, o padrão e a robustez dos órgãos durante o desenvolvimento. Composto por aproximadamente 800 ommatídios altamente ordenados, o olho da mosca fornece uma leitura sensível e quantificável das perturbações genéticas que afetam proliferação, diferenciação e organização dos^{tecidos 1,2,3}. A manipulação genética do desenvolvimento ocular historicamente forneceu insights fundamentais sobre vias de sinalização conservadas. Estudos seminais d....

Protocol

1. Coleta e sincronização de amostras

NOTA: Para garantir a comparabilidade experimental, é necessário um controle rigoroso do tempo da eclosão. Em condições padrão de cultivo a 25 °C, a eclosão ocorre tipicamente de 10 a 12 dias após a postura. As pupas devem ser monitoradas de perto durante esse período, pois o escurecimento da casula pupal indica eclosão iminente.

1. Método de tapping direto (método padrão)
   1. Bata suavemente o frasco de cultura plástica padrão de Drosophila 24 x 95 mm (selado com um plugue de espuma) contra uma almofada macia para deslocar as mo....

Results

O pipeline experimental completo, desde a coleta de amostras até a aquisição de imagens, é resumido na Figura 1. A eficiência do protocolo modificado é demonstrada pela criação de arrays de amostras de alta densidade. Como mostrado na Figura 2A, 20–30 moscas anestesiadas podem ser organizadas em um padrão em grade sobre uma única plataforma de fita invertida. Marcadores de orientação escritos nas extremidades não adesivas da fit.......

Discussion

O olho composto de Drosophila serve como uma poderosa leitura fenotípica para triagem genética, onde mudanças observáveis no tamanho dos olhos, rugosidade ou^{pigmentação 2,3,8} frequentemente indicam perturbações em vias fundamentais de sinalização como Hippo ^5,6 ou ^{Hedgehog 7}. No entanto, a eficiência dess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cilindro de gás de dióxido de carbono (CO2)	Fornecedor local	N/A
CO2 aspirante anestesia	T& L	DG-08
Câmera de microscópio digital	Leica	DMC6200
Pinça fina	VETUS	MOS-167B
Plugues de espuma	Dongpeng	N/A
Software de aquisição de imagem (LAS X)	Leica	3.7.1
Software de processamento de imagem (FIJI/ImageJ)	NIH	Código aberto
Iluminador de Cúpula LED	Leica	LED5000 IDH
Iluminador LED Gooseneck	Cossim	LG-10
Estereoscópio motorizado	Leica	M205 FCA
Lente objetiva	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Válvula pneumática de pedal de pé	DELIXI	FV-320
Frascos padrão de cultura de Drosophila	LAIBOER	2424951
Meio alimentar padrão para Drosophila	N/A	Farinha de milho-ágar-melaço
Lâminas padrão de vidro para microscópio	Citotest	10127101P-G
Estereomicroscópio padrão	Nikon	SMZ745
Fita de proteção de papel branco	UBWIN	25mm de largura