Um protocolo de montagem em fita para imagem em Z-stack de alta resolução de olhos compostos de Drosophila

Summary

O objetivo principal deste protocolo é possibilitar a imagem não destrutiva e a análise quantitativa dos olhos compostos de Drosophila. Ele combina uma estratégia de montagem em fita com aquisição estereomicroscópica de pilha Z e reconstrução por Profundidade de Foco Estendida para produzir imagens de alta resolução e sem artefatos.

Abstract

Aqui, apresentamos um protocolo de montagem e imagem não destrutivo para análise fenotípica de alta resolução do olho composto de Drosophila. A fenotipagem precisa do olho composto de Drosophila é frequentemente limitada por sua geometria convexa e fragilidade mecânica durante o manuseio. Para resolver isso, detalhamos um fluxo de trabalho de imagem versátil e não invasivo que permite visualização em alta resolução a partir de múltiplas perspectivas. O protocolo utiliza uma estratégia personalizada de fixação adesiva em uma plataforma de fita invertida, prendendo as moscas pelo corpo e pelas asas, deixando a cabeça completamente intocada. Crucialmente, essa configuração flexível suporta orientações de montagem distintas: uma posição lateral para capturar toda a convexidade dos olhos individuais e uma posição frontal para avaliar a simetria da cabeça inteira. Esse método também facilita o arranjo de matrizes de alta densidade, permitindo o processamento rápido de 20–30 amostras por sessão. Ao integrar a estereomicroscopia de luz refletida com a aquisição por pilha Z e a reconstrução por Profundidade de Foco Estendida (EDF), o fluxo de trabalho gera imagens compostas quase 3D uniformemente nítidas. Essa abordagem preserva a pigmentação natural e produz imagens de alta fidelidade e ricas em contraste, adequadas para análise fenotípica quantitativa em escala de órgãos.

Introduction

O olho composto de Drosophila melanogaster é um modelo clássico e poderoso para estudar o crescimento, o padrão e a robustez dos órgãos durante o desenvolvimento. Composto por aproximadamente 800 ommatídios altamente ordenados, o olho da mosca fornece uma leitura sensível e quantificável das perturbações genéticas que afetam proliferação, diferenciação e organização dos^{tecidos 1,2,3}. A manipulação genética do desenvolvimento ocular historicamente forneceu insights fundamentais sobre vias de sinalização conservadas. Estudos seminais demonstraram que a expressão ectópica do fator de transcrição eyeless é suficiente para induzir a formação ocular em tecidos não retinianos, estabelecendo o olho como um paradigma para especificação e plasticidade^{de órgãos 4}. Trabalhos posteriores identificaram a via de sinalização do hipopótamo de D. melanogaster como um regulador central do tamanho dos olhos e do número celular por meio do controle coordenado da proliferação e apoptose ^5,6. Paralelamente, a sinalização Hedgehog e BMP demonstrou regular a progressão morfogenética, a precisão do crescimento e o padrão espacial dentro da retina^{em desenvolvimento 7,8}.

No entanto, capturar imagens de alta fidelidade do olho composto adulto apresenta desafios ópticos significativos devido à sua geometria convexa e hemisférica. A microscopia padrão de campo claro é limitada por uma profundidade de campo rasa, tornando impossível focar simultaneamente no ponto mais dorsal (polo) e nas bordas marginais (equador) do olho em uma única^{exposição 9}. Essa limitação frequentemente resulta em imagens onde porções significativas da superfície retiniana ficam borradas, dificultando a aplicação de análise de imagens de alta resolução e ferramentas de aprendizado de máquina projetadas para quantificar fenótipos variegados. Para caracterizar completamente a superfície retiniana, toda a curvatura deve ser visualizada sem artefatos ópticos. Portanto, é necessário um método de imagem que preserve a morfologia ocular nativa enquanto permita visualização em alta resolução de toda a superfície curva da retina.

Além disso, os métodos tradicionais de preparação de amostras para microscopia frequentemente comprometem a integridade estrutural da cabeça da mosca. Técnicas convencionais de montagem frequentemente dependem de adesivos que podem obscurecer detalhes da superfície ou envolvem manipulação física com pinças que aplicam pressão na cápsula cefálica. Como observado em estudos sobre morfogênese retiniana, a integridade estrutural do olho é fundamental. Pressão direta ou perfuração causa vazamento de hemolinfa, levando à perda de pressão interna e ao subsequente colapso ou "amassagem" da superfície ocular. Esses artefatos mecânicos podem imitar fenótipos neurodegenerativos ou defeitos genéticos, levando a resultados falsos positivos em triagens em grande escala. O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho de montagem e imagem não destrutivo para visualização em alta resolução dos olhos compostos intactos de Drosophila.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho de imagem rápido e reprodutível que permite visualização em alta resolução dos olhos compostos intactos de Drosophila e da morfologia da cabeça inteira, sem contato direto com a cabeça. Nesse método, as moscas adultas são imobilizadas usando uma estratégia flexível de fixação adesiva que fixa o corpo e as asas, permitindo uma posição estável em uma orientação lateral — para capturar a curvatura completa de um único olho — ou frontal — para avaliar a simetria da cabeça total e as características interoculares. Essa estratégia versátil de montagem minimiza danos mecânicos e preserva a geometria ocular nativa em três dimensões. Quando combinada com estereomicroscopia de luz refletida, aquisição por pilha Z e reconstrução estendida de profundidade^{de foco 9}, essa abordagem gera imagens uniformemente nítidas e de alta qualidade a partir de múltiplas perspectivas, adequadas tanto para inspeção qualitativa quanto para análise fenotípica quantitativa. Esse método é particularmente adequado para estudos de perturbações genéticas, fenótipos do desenvolvimento e triagem de alta produtividade da morfologia ocular em Drosophila.

Protocol

1. Coleta e sincronização de amostras

NOTA: Para garantir a comparabilidade experimental, é necessário um controle rigoroso do tempo da eclosão. Em condições padrão de cultivo a 25 °C, a eclosão ocorre tipicamente de 10 a 12 dias após a postura. As pupas devem ser monitoradas de perto durante esse período, pois o escurecimento da casula pupal indica eclosão iminente.

1. Método de tapping direto (método padrão)
   1. Bata suavemente o frasco de cultura plástica padrão de Drosophila 24 x 95 mm (selado com um plugue de espuma) contra uma almofada macia para deslocar as moscas adultas até o fundo.
   2. Remova rapidamente o tampão e alinhe a boca de um frasco de coleta nova com o frasco de cultura.
   3. Inverta a configuração para que o frasco de cultura fique por cima. Bata suavemente nas paredes para transferir as moscas para o frasco de coleta.
      NOTA: Este método não é recomendado se o meio padrão de farinha de milho e ágar for úmido, pois moscas recém-fechadas são facilmente capturadas e mortas. Para minimizar a mortalidade, inicialmente colete as moscas em um frasco vazio de 24 x 95 mm. Após a anestesia (Passo 3), transfira as moscas para a parede interna de um frasco de 24 x 95 mm contendo meio alimentar fresco.
2. Método de transferência de geotaxia negativa (método anti-aderência)
   1. Remova o plugue de um frasco de coleta novo e o inverta na bancada para evitar que moscas perdidas entrem.
   2. Segure o frasco de cultura com a abertura voltada para baixo. Moscas vão subir em direção ao lado da comida, afastando-se da abertura.
   3. Quando a abertura estiver livre de moscas, destape rapidamente o frasco de cultura e alinhe-o com o frasco de coleta vazio invertido de 24 x 95 mm na bancada.
   4. Toque suavemente o ponto de conexão contra a bancada para colocar as moscas no frasco de coleta.
      NOTA: Este método reduz significativamente a mortalidade causada pela adesão alimentar, mas é mais demorado do que a extração direta.
3. Método de anestesia por CO₂ (Método de alta eficiência)
   1. Inverta o frasco de cultura para que o plugue fique voltado para baixo.
   2. Insira cuidadosamente a agulha da pistola de anestesia CO₂ entre o plugue e a parede do frasco.
   3. Acione suavemente o pedal e a válvula de mão para liberar 100% de CO₂ em uma vazão baixa e suave.
   4. Depois que as moscas estiverem anestesiadas e caírem sobre o plugue, coloque o frasco de cultura na horizontal. Remova o tampão, alinhe-o com um frasco de coleta vazio e toque suavemente no frasco de cultura para transferir as moscas anestesiadas para o frasco de coleta.
      NOTA: Fluxo excessivo de ar pode soprar moscas para a superfície do alimento, causando adesão e morte; manter estritamente um fluxo suave de_CO2 suficiente para anestesiar as moscas sem deslocá-las fisicamente. O monitor voa de perto para sinais iniciais de recuperação, como espasmos sutis ou movimentos das asas e pernas.
4. Rotulagem e manutenção
   1. Rotule o frasco de coleta com o sexo, data da coleta, data de eclosão, genótipo e condições de cultura.
   2. Separação Sexual: Se a imagem de moscas tiver mais de 10 dias, separe machos e fêmeas em diferentes frascos de cultura contendo alimento para evitar o acasalamento e o surgimento de uma geração F2, que poderia interferir no ambiente experimental.
      NOTA: Moscas podem ser mantidas nesses frascos contendo alimento sob condições de cultura anterior (por exemplo, 25 °C) até atingirem a idade desejada para imagem.

2. Preparação da placa de montagem

1. Obtenha uma lâmina de vidro padrão limpa.
2. Corte uma tira de fita adesiva branca de papel aproximadamente 2 cm mais longa que a lâmina.
3. Coloque a fita no ferrolho com o lado adesivo voltado para cima (lado não adesivo contra o vidro). Certifique-se de que a fita passe aproximadamente 1 cm sobre o ferrolho em ambas as extremidades.
4. Prenda as extremidades salientes enrolando duas tiras adicionais de fita de ~5 mm firmemente ao redor da parte de trás do ferrolho.
5. Certifique-se de que a superfície adesiva esteja plana, esticada e livre de rugas.
6. Rotulagem: Marque indicadores de orientação (por exemplo, "Cima/Cima" e "Baixo/Baixo") ou identificadores de amostra nas extremidades não adesivas da fita para facilitar a orientação e o acompanhamento da amostra ao microscópio.
   NOTA: Ao selecionar moscas para imagem, evite escolher indivíduos com disparidades significativas no tamanho do corpo. Mesmo com a mesma ampliação, variações no tamanho do corpo podem resultar em áreas compostas de superfície ocular não comparáveis.

3. Eutanásia e montada

1. Eutanásia
   1. Transfira as moscas para um frasco de coleta lacrado e vazio.
   2. Coloque o frasco lacrado em um freezer a -80 °C por 15–20 minutos.
      ATENÇÃO: Nunca fure ou aperte a bragueta com as pontas afiadas de uma pinça fina. Mesmo um vazamento leve de hemolinfa causa uma rápida perda de pressão hidrostática interna, levando a amassação imediata e colapso irreversível do olho composto, que destrói a qualidade da imagem.
2. Montagem para visão lateral (olho composto único)
   1. Posicionamento: Sob um estereoscópio padrão (por exemplo, Nikon SMZ745), use pinças de ponta fina para orientar a mosca eutanasiada em uma posição lateral (deitada de lado).
   2. Transferência: Usando pinças de ponta fina, segure suavemente a mosca pela asa (mantendo a postura lateral) e transfira-a para a placa de fixação adesiva preparada.
   3. Fixação: Fixe um lado do corpo da mosca na fita adesiva. Abra as asas e cole-as planas contra a fita para aumentar a estabilidade.
   4. Controle do Apêndice: Durante a montagem, certifique-se de que as pernas não obstruam o olho composto. Se as patas dianteiras bloquearem o campo de visão, use uma pinça para puxá-las cuidadosamente para longe do olho e prendê-las firmemente à fita (por exemplo, estendendo-as para baixo ou escondendo-as sob o tórax).
   5. Fixação: Incline a pinça e use o lado da ponta (não a ponta afiada) para pressionar suavemente o corpo contra a fita e garantir uma fixação segura.
   6. Ajuste Final: Verifique se a cabeça está na horizontal. Se o olho não estiver em um único plano focal, use uma pinça para microajustar o ângulo do corpo.
3. Montagem para visão frontal (cabeça inteira)
   1. Posicionamento: No almofada anestésica, oriente a mosca em posição ventral-deitada para baixo.
   2. Transferência: Use uma pinça para segurar uma asa e levantar a mosca. Transfira para a placa de fixação adesiva.
   3. Fixação inicial: Abra suavemente ambas as asas para fora (esquerda e direita) e pressione-as firmemente na superfície adesiva para ancorar a mosca.
   4. Estabilização do Corpo: Pressione suavemente o tórax para garantir contato total com a placa adesiva. Use uma pinça para segurar levemente a parte posterior do abdômen (cauda) e puxe delicadamente para esticar o eixo do corpo antes de fixar o abdômen na fita.
   5. Orientação da cabeça: Ajuste o ângulo da cabeça usando pinças finas para garantir que o plano frontal (face) fique paralelo à superfície adesiva. Ambos os olhos compostos devem estar nivelados e visíveis no mesmo plano focal.
4. Arranjo
   1. Monte múltiplas moscas em fileiras paralelas ou em uma matriz em grade na superfície adesiva. Certifique-se de que moscas individuais não se sobreponham para evitar interferência na pilha Z, embora o empacotamento próximo seja permitido para maximizar o débito (por exemplo, 20–30 moscas por slide). Alinhe todas as moscas com a cabeça voltada na mesma direção (conforme indicado pelos rótulos no passo 2.6) para facilitar a obtenção sistemática de imagens.
   2. Prepare arranjos de amostras separados para imagem lateral e frontal usando diferentes conjuntos de moscas eutanasiadas da mesma coorte. Uma vez que a mosca é aderida à fita, ela não pode ser removida ou reposicionada com segurança sem causar danos mecânicos graves à amostra; portanto, múltiplas visões não podem ser sequencialmente imaginadas a partir do mesmo indivíduo.
      NOTA: É altamente recomendado capturar as amostras imediatamente após a eutanásia e a montagem para evitar a dessecação tecidual.

4. Aquisição de imagem

1. Inicialização e inicialização do sistema de imagem motorizado de estereomicroscópio
   1. Ligue o PC, o monitor e a unidade do microscópio em sequência.
   2. Inicie o software LAS X.
   3. Quando o prompt "Inicializar/Autotestar" aparecer, certifique-se de que o espaço sob o objetivo está livre de obstáculos e clique em Confirmar. Deixe o microscópio completar todo o movimento de calibração do eixo Z.
      NOTA: Os passos a seguir são otimizados para um Estereoscópio com o sistema de software LAS X.
2. Colocação de amostras e iluminação
   1. Transfira a placa de montagem preparada para a plataforma base do estereoscópio motorizado, posicionando-a manualmente para centralizar a primeira amostra no arranjo sob o objetivo da câmera digital.
   2. Ligue as fontes de Luz Transmitida (base) e Luz Incidente (superior). Para imagem ocular composta, use principalmente Luz Refletida. Ajuste a abertura para garantir uma iluminação uniforme.
3. Configuração de software
   1. Defina o modo de aquisição para Z-stack. Nas configurações do projeto, defina a prioridade de movimento multidimensional para 'Z-primeiro' para garantir uma operação contínua e estável do motor.
   2. Defina o modo de imagem para Luz Refletida.
   3. Permitir a Profundidade de Foco Estendida (EDF) para permitir a síntese de uma imagem totalmente focada.
   4. Nas Configurações Avançadas de Imagem, ative o Alto Alcance Dinâmico (HDR). Isso é altamente recomendado para mitigar os reflexos especulares e a superexposição comumente causados pela superfície altamente refletora e quitinosa do olho composto.
4. Posicionamento e balanço de branco
   1. Ajuste o botão de ampliação para o nível apropriado (por exemplo, um fator de zoom de 16x para a visão lateral de um olho e 12,5x para a visão frontal de cabeça inteira), garantindo que a região específica de interesse ocupe de 1/2 a 2/3 do campo de visão.
   2. Posicione manualmente a placa de montagem para trazer o tórax da mosca para o centro do campo de visão.
   3. Realize calibração de balanço de brancos usando o tórax para corrigir a temperatura de cor.
5. Parâmetros de exposição e imagem (valores de referência)
   Exposição: 60–80 ms.
   Ganho: 0–5 (mantenha-se baixo para minimizar o ruído).
   Intensidade: 60%–80%.
   Tamanho do Passo da Pilha Z: Padrão: 8–12 μm.
   NOTA: Para olhos compostos lisos e saudáveis (por exemplo, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), tamanhos de degraus de até 15 μm podem ser suficientes, pois a curvatura contínua e regular requer menos seções ópticas. No entanto, para fenótipos oculares ásperos ou irregulares caracterizados por mudanças topológicas abruptas, passos menores (a partir de 5 μm) são necessários para capturar detalhes estruturais finos e melhorar significativamente a precisão da reconstrução da EDF.
6. Definição e captura do Z-Stack
   1. Para Visão Lateral: Defina o intervalo do Z-stack do bordo orbital (Início) até o centro dos ommatidias (Fim) usando um passo de 8–12 μm.
   2. Para a Visão Frontal: Ajuste o botão de foco até que o contorno externo dos olhos compostos esteja apenas em foco (Start). Ajuste o foco na direção oposta até que os ocelos centrais (olhos simples amarelos) no topo da cabeça estejam apenas em foco (Extremidade). Clique em Finalizar.
   3. Clique em Stop Live para congelar a prévia.
   4. Clique em Iniciar Aquisição. O sistema capturará automaticamente os planos focais definidos e sintetizará uma imagem totalmente focada e de alta resolução.
7. Salvamento de arquivos:
   1. Ao concluir a reconstrução do EDF, clique no ícone Salvar na interface do software (ou navegue até Arquivo > Salvar Como).
   2. Selecione o diretório de destino, insira o nome do arquivo designado e clique em Salvar.
   3. Note que cada aquisição gera três arquivos de imagem distintos: a. Imagem raw/canal (escala de cinza); b. Imagem de pré-visualização colorida; c. Imagem composta EDF (com o sufixo "_Composite")
      NOTA: Tanto a imagem raw/canal quanto a imagem composta EDF devem ser mantidas para análise e documentação

Results

O pipeline experimental completo, desde a coleta de amostras até a aquisição de imagens, é resumido na Figura 1. A eficiência do protocolo modificado é demonstrada pela criação de arrays de amostras de alta densidade. Como mostrado na Figura 2A, 20–30 moscas anestesiadas podem ser organizadas em um padrão em grade sobre uma única plataforma de fita invertida. Marcadores de orientação escritos nas extremidades não adesivas da fit...

Discussion

O olho composto de Drosophila serve como uma poderosa leitura fenotípica para triagem genética, onde mudanças observáveis no tamanho dos olhos, rugosidade ou^{pigmentação 2,3,8} frequentemente indicam perturbações em vias fundamentais de sinalização como Hippo ^5,6 ou ^{Hedgehog 7}. No entanto, a eficiência dess...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cilindro de gás de dióxido de carbono (CO2)	Fornecedor local	N/A
CO2 aspirante anestesia	T& L	DG-08
Câmera de microscópio digital	Leica	DMC6200
Pinça fina	VETUS	MOS-167B
Plugues de espuma	Dongpeng	N/A
Software de aquisição de imagem (LAS X)	Leica	3.7.1
Software de processamento de imagem (FIJI/ImageJ)	NIH	Código aberto
Iluminador de Cúpula LED	Leica	LED5000 IDH
Iluminador LED Gooseneck	Cossim	LG-10
Estereoscópio motorizado	Leica	M205 FCA
Lente objetiva	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Válvula pneumática de pedal de pé	DELIXI	FV-320
Frascos padrão de cultura de Drosophila	LAIBOER	2424951
Meio alimentar padrão para Drosophila	N/A	Farinha de milho-ágar-melaço
Lâminas padrão de vidro para microscópio	Citotest	10127101P-G
Estereomicroscópio padrão	Nikon	SMZ745
Fita de proteção de papel branco	UBWIN	25mm de largura