Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Summary

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Abstract

Tecnologias multiômicas espaciais combinadas com perfil de célula única oferecem oportunidades sem precedentes para elucidar a arquitetura molecular e celular de tecidos complexos. Combinar o código de barras espacial dos núcleos dentro de crioseções individuais preparados a partir de blocos de tecido embutidos em meio congelante à temperatura ótima de corte (OCT) com ensaios multiômicos de célula única em um fluxo de trabalho simples e eficiente pode facilitar a anotação e a análise molecular espacialmente resolvida de células em tipos de tecido. Este estudo relata uma abordagem multioma de clivagem espacial sob alvos & tagmentation (CUT&Tag) que simultâneamente perfila a modificação da histona H3K27ac e a expressão gênica em uma única seção cerebral congelada. Após o código de barras espacial, núcleos individuais são isolados e submetidos ao CUT&Tag, captura combinada de DNAs, RNAs e códigos de barras espaciais marcados, preparação de bibliotecas e sequenciamento. O fluxo de trabalho gera perfis epigenômicos e transcriptômicos anotados espacialmente a partir dos mesmos núcleos, permitindo a atribuição das informações multiômicas às coordenadas anatômicas. Integrar informações epigenômicas com dados transcriptômicos espaciais aumenta a fidelidade da identificação do tipo celular e revela programas regulatórios espacialmente organizados e interações célula-célula dentro dos tecidos intactos.

Introduction

A biologia espacial é um campo em rápido avanço que mapeia a localização, organização e interações de moléculas, células e tecidos em seus ambientes ^{nativos 1,2,3}. Ao contrário dos métodos convencionais de célula única ou em massa, que exigem dissociação tecidual e resultam na perda de informação posicional, as abordagens espaciais preservam as coordenadas físicas de analitos ou células/núcleos, permitindo a investigação direta de como a arquitetura tecidar influencia a identidade celular, a comunicação intercelular e a função biológica 4,5,6,7 . Embora a transcriptômica espacial e a proteômica espacial sejam atualmente as modalidades mais amplamente adotadas, o campo está se expandindo rapidamente para o perfil multiômico^{espacial 3,8,9}. A co-profilagem da expressão gênica e dos estados epigenômicos dentro do mesmo tecido é especialmente poderosa, pois vincula diretamente a saída transcricional a mecanismos regulatórios — como acessibilidade à cromatina e modificações de histonas — que governam a atividade gênica e que se sabe variar entre domínios^espaciais 10,11,12 . Assim, a análise integrada de epigenoma espacial e transcriptoma fornecerá insights críticos sobre como os programas regulatórios moldam a identidade celular e a organização dos tecidos.

Diversas estratégias multiômicas espaciais foram desenvolvidas para possibilitar o perfilamento epigenômico e transcriptômico simultâneo. O código de barras determinístico no sequenciamento de tecidos (DBiT-seq) emprega canais microfluídicos para entregar códigos de barras espaciais direta ou indiretamente, por meio de carimbagem com placas de gel, em seções de tecido, permitindo a anotação espacial dos analitos. Essa abordagem facilita o co-perfilamento espacialmente resolvido de características epigenômicas e^{transcriptômicas} 12,13,14,15. O método Slide-tag, comercializado como plataforma Takara Trekker, introduz diretamente códigos de barras espaciais no tecido intacto antes da dissociação, permitindo que núcleos espacialmente indexados sejam processados usando fluxos de trabalho padrão de célula única e projetados computacionalmente de volta às suas coordenadas originais do^{tecido 16}. Em contraste, o ensaio espacial para cromatina acessível, linhagens celulares e expressão gênica com sequenciamento (SPACE-seq) emprega uma estratégia de direcionamento para fora na qual alvos epigenéticos com cauda poli(A) e mRNAs são capturados em uma sequência de captura poli-dT nos tiles¹⁷ de transcriptômica espacial.

Cliavage under targets & tagmentation (CUT&Tag) é uma ferramenta poderosa para mapear interações entre DNA e proteínas de histonas ou não histonas a partir de amostras de entrada extremamente^{baixas 18}. O CUT&TAG baseia-se na fragmentação da cromatina mediada pela transposase Tn5 e na marcação de DNA (marcação), empregando Tn5 conjugado com proteína A guiado por anticorpos para clivagem específica do locus e marcação molecular. Enquanto o ensaio convencional CUT&Tag envolve múltiplas etapas de incubação e lavagem, um fluxo de trabalho simplificado e simplificado do CUT&Tag foi utilizado para aumentar a eficiência do CUT&Tag em aplicações multioma de célula única a^{jusante 19}.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho e controle de qualidade do ensaio espacial Trekker–CUT&Tag multiome. (A) Diagrama esquemático do fluxo de trabalho espacial Trekker–CUT&Tag multiome. Uma seção coronal de tecido cerebral de camundongo recém-congelado é montada em um bloco espacial Trekker e submetida a código de barras espaciais. Após a lise tecidual, núcleos são isolados e avaliados quanto ao rendimento e qualidade. Aproximadamente 50.000 núcleos são usados para H3K27ac CUT&Tag, e núcleos marcados são submetidos a código de barras de célula única usando 10x esferas de gel Genomics Chromium Multiome após a contagem. O DNA unicelular codificado em barras é pré-amplificado e dividido em duas frações. A biblioteca indexada CUT&Tag é gerada diretamente por PCR de índice. Para a expressão gênica e bibliotecas espaciais de códigos de barras, o DNA pré-amplificado é ainda mais amplificado e selecionado pelo tamanho. Fragmentos correspondentes aos tamanhos típicos de cDNA são usados para a preparação da biblioteca de expressão gênica, enquanto fragmentos de DNA mais curtos são usados para gerar a biblioteca de códigos de barras espaciais. As bibliotecas são sequenciadas e mapeadas seguindo 10x diretrizes de Genômica e Curio Trekker. A linha do tempo experimental esperada está indicada à esquerda. (B) Pontos de controle de qualidade (QC) chave e considerações críticas ao longo do fluxo de trabalho. O controle de qualidade dos núcleos inclui avaliação de rendimento, integridade, agregação e conteúdo de detritos. O controle de qualidade pré-sequenciamento inclui avaliação das distribuições de tamanho do DNA e contaminação por dímeros de primer para todas as bibliotecas. A especificidade da biblioteca CUT&Tag é avaliada por PCR quantitativa (qPCR), que mede o enriquecimento das regiões genômicas-alvo sobre o fundo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Este estudo apresenta um ensaio espacial Trekker CUT&Tag multioma que simultâneamente perfila a modificação de histonas H3K27ac associada a elementos cis-reguladores ativos e expressão gênica em seções de tecido fresco congelado. Este protocolo fornece procedimentos passo a passo para o código de barras espacial Takara Trekker, dissociação de tecidos e isolamento de núcleos, contagem e controle de qualidade de núcleos, perfil CUT&Tag de baixa entrada da modificação H3K27ac, captura de alvos moleculares em 10x esferas de gel multiome monocelulares Genômics e preparação de bibliotecas. O fluxo de trabalho foi demonstrado usando uma seção coronal de tecido cerebral de camundongo. Diferentemente do fluxo padrão 10x Genomics Multiome, no qual a acessibilidade da cromatina é medida por meio de ensaio para cromatina acessível por transposase com sequenciamento de alto débito (ATAC-seq), esse protocolo substitui fragmentos de DNA derivados do CUT & Tag por fragmentos de ATAC, permitindo a interrogação direta de paisagens de modificação de histonas em resolução de célula única. Para ligar códigos espaciais Trekker com códigos de barras unicelulares 10x da Genômica, códigos de barras espaciais com cauda poli(A) e transcritos de mRNA são capturados pelas sequências poli-dT das esferas de gel Multiome, enquanto fragmentos de DNA CUT&Tag são capturados pelas sequências espaçadoras. Essa estratégia de captura dupla permite a recuperação simultânea de informações epigenômicas, transcriptômicas e espaciais a partir do mesmo núcleo individual. Até onde sabemos, este é o primeiro fluxo de trabalho multiômico espacial espacial que integra diretamente a anotação espacial Trekker com código de barras com um ensaio multioma de célula única para co-perfilar a distribuição genômica em toda a marca de histona e o transcriptoma. As paisagens multiomática espacialmente resolvidas resultantes, integrando dados de ocupação e expressão gênica do H3K27ac, permitem a projeção dos perfis de células individuais de volta às suas coordenadas originais do tecido e fornecem uma ligação direta entre mecanismos regulatórios epigenômicos e programas transcricionais em relação à arquitetura do tecido intacto.

Protocol

Camundongos adultos foram eutanasiados por inalação de CO₂ (IACUC #: A48315-15-R24) antes da colheita de tecido. Os cérebros foram removidos totalmente após craniotomia sagital e remoção da calvaria dividida ao meio. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Montar uma seção de tecido no bloco de código de barras Trekker para codificação de barras espacial

1. Prepare o seguinte antes de começar.
   1. Equilibre o bloco de tecido embutido com temperatura ótima de corte (OCT) em um criostato antes da secção. Prepare os buffers para clivagem UV, dissociação de tecidos e isolamento de núcleos.
      NOTA: A temperatura ideal para seccionamento pode variar dependendo do tipo de tecido.
   2. Para isolamento dos núcleos, pré-resfrie a centrífuga com baldes de oscilação para tubos de 1,5 mL a 4 °C. Pré-resfrie uma placa de 12 poços com um anel O-ring Trekker sobre gelo.
   3. Ajuste o medidor de UV para o limite máximo de corrente (1,2 A) e potência máxima.
2. Registre o ID do mosaico de código de barras espacial (por exemplo, U0001_001) do bloco Trekker a ser usado.
   NOTA: Cada tile de Trekker contém coordenadas únicas de código de barras. O ID do tile é necessário para recuperar o arquivo correto para o mapeamento espacial de códigos de barras dos dados de sequenciamento.
3. Corte o tecido. A seção coronal de 25 μm de espessura na posição aproximada de bregma -1 mm foi realizada a −18 °C (Figura 1A).
   NOTA: A espessura pode ser aumentada para 30 μm ao trabalhar com tecidos de baixa celularidade.
4. Posicione a seção (ou a região de interesse) sobre o azulejo espacial e derreta colocando suavemente um dedo na parte inferior do vidro deslizante.
   ATENÇÃO: Se necessário, verifique os procedimentos através das medições de controle de qualidade dos núcleos usando o bloco de treinamento Trekker.
5. Use uma pinça para remover o azulejo do adesivo transparente e coloque-o em um poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços sobre gelo sobre o anel de vedação Trekker. Imediatamente pipete 30 μL de buffer de clivagem UV Trekker sobre o azulejo, garantindo que todo o tecido esteja coberto por buffer.
6. Coloque a lâmpada UV (ajuste de 1,2 A) na placa diretamente acima do poço. Ilumine por 1 minuto para liberar os códigos de barras enquanto mantém tudo no gelo.
   ATENÇÃO: Use óculos UV protetores ao trabalhar com a lâmpada UV.
7. Desligue a lâmpada UV e incube o bloco no gelo por 7,5 minutos. Durante a incubação, retire uma câmara de lavagem Trekker 10 x 10 e encha as câmaras 1 e 2 com 400 μL de tampão de lavagem de núcleos frios Trekker para uma amostra em gelo.
8. Pegue cuidadosamente o azulejo com uma pinça sem tocar nas contas e lave o azulejo na câmara 1 por 5 segundos. Lave o azulejo na câmara 2 por 5 segundos. Coloque cuidadosamente o azulejo em um poço na placa de 12 poços sobre gelo. A seção de tecido deve ser tingida de azul e facilmente visível.

2. Dissociação de tecidos e isolamento de núcleos

1. Dispense 175 μL do buffer Invent Minute A mirando o tecido. Repita mais 3 vezes para fazer um total de 700 μL. A cada dispensação, mire em diferentes partes do azulejo para destacar todo o tecido do azulejo.
   NOTA: Evite contaminação por miçangas por riscos nos azulejos ou por contas caindo.
2. Continue dissociando o tecido do azulejo aspirando o tampão da lateral do poço e dispensando-o nas regiões do azulejo cobertas por tecido, mantendo a placa no gelo o máximo possível. Repita até que não reste nenhum papel de papel no azulejo. Depois que todo o tecido do azulejo for removido, use cuidadosamente uma pinça para transferir o azulejo para um poço vazio.
3. Use uma pipeta P1000 para dissociar mecanicamente núcleos com trituração repetida no mesmo poço. Repita até que não restem pedaços de tecido visíveis.
4. Transfira cuidadosamente a suspensão dos núcleos para um cartucho filtrante com um tubo coletor do kit de isolamento de núcleo único Invent Minute para tecidos/células neuronais. Incube o tubo com a tampa aberta a –20 °C por 10 minutos. Tape o cartucho do filtro e centrifuge imediatamente a 13.000 x g por 30 segundos em uma microcentrífuga refrigerada.
5. Descarte o cartucho do filtro e ressuspenda o pellet pipetando suavemente de 10 a 20 vezes. Gire o tubo na centrífuga pré-refrigerada com baldes de giro a 600 x g por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 μL do buffer Trekker C.
6. Adicione 1 mL de buffer Minute Invent B frio a um tubo Eppendorf de 1,5 mL de baixa ligação e sobreponha cuidadosamente 200 μL de suspensão de núcleos sobre o buffer Minute B, expelindo lentamente contra a parede do tubo para evitar a mistura das camadas. Gire o tubo na centrífuga pré-refrigerada com baldes de giro a 500 x g por 10 minutos. Remova cuidadosamente a camada leitosa e o sobrenadante.
7. Resuspenda suavemente os núcleos com 24 μL de buffer Trekker C e prossiga para medições de controle de qualidade dos núcleos isolados.

Figura 2: Avaliação de controle de qualidade dos núcleos isolados. Imagens representativas de campo claro de núcleos isolados de tecido cerebral de camundongo. Os núcleos foram corados com 0,4% de azul de Tripano e visualizados com ampliação de 40x para avaliar a integridade nuclear e a presença de detritos. A preparação de núcleos mostrada à esquerda apresenta núcleos de alta qualidade e intactos, adequados para ensaios posteriores, enquanto a preparação mostrada à direita ilustra núcleos de baixa qualidade com agregados de tecido parcialmente lisados. Núcleos danificados ou rompidos são indicados por pontas de flecha preenchidas. A barra de escala é 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Medições de contagem e controle de qualidade de núcleos isolados

1. Para contar núcleos, retire 2 μL da suspensão de núcleos em 8 μL do tampão Trekker C. Misture 10 μL da suspensão de núcleos diluídos com 10 μL de solução de coloração AO/PI. Conte os núcleos conforme as instruções do fabricante.
2. Para avaliar a qualidade dos núcleos isolados, diluir 2 μL da suspensão do núcleo em 8 μL de solução de azul de tripano a 4%. Examine os núcleos sob o microscópio de fluorescência com ampliação de 40X, verificando a morfologia intacta da membrana nuclear e o conteúdo de detritos não nucleares (Figura 2).
3. Proceda imediatamente ao ensaio multioma CUT&Tag de núcleo único (CUT&Tag em H3K27ac + expressão gênica).
   ATENÇÃO: Prossiga para os próximos passos se pelo menos 30.000 núcleos de alta qualidade forem recuperados.

4. Marcação CUT&Tag em núcleos isolados

1. Prepare o buffer de incubação CUT&Tag I. Coloque no gelo.
2. Prepare anticorpo primário e transposase ativada pelo conjugado da enzima guia (TAG).
   1. Adicione 46,23 μL de tampão de incubação CUT&Tag I e 1,33 μL da enzima TAG em um tubo de PCR sobre gelo. Adicione uma quantidade otimizada de anticorpo primário ao tubo. Misture lentamente, pipetando 10 vezes.
      NOTA: 2,43 μL de anticorpo anti-H3K27ac foram adicionados à reação. O lote de anticorpos foi validado para ensaios CUT&Tag em volume e in situ . Otimize a quantidade de anticorpos para conjugação da enzima TAG por meio de ensaio em massa. O anticorpo ideal foi definido como a menor concentração que atingiu o máximo sinal-ruído, conforme determinado por qPCR em loci alvo positivo e negativo.
   2. Gire brevemente e coloque o tubo em um rotador de 18 rpm. Incube em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura resultante pode ser pré-preparada e colocada no gelo por até 5 horas.
      NOTA: A incubação de anticorpos-TAG pode ser realizada simultaneamente ou antes do isolamento do núcleo.
3. Incubação de núcleos isolados com conjugado enzimático anticorpo-TAG.
   1. Gire o tubo (Passo 2.7) dos núcleos isolados na centrífuga pré-refrigerada com baldes de oscilação a 500 x g por 10 minutos. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e deixe para trás ~5 μL de sobrenadante.
   2. Adicione 25 μL de tampão de incubação CUT&Tag I (Passo 4.1) e resuspenda pipetando suavemente 10 vezes. Transfira os núcleos para o tubo (Passo 4.2.2) contendo conjugado anticorpo-TAG usando a mesma ponta da pipeta. Misture suavemente pipetando 10 vezes e coloque o tubo em um rotador suave.
   3. Incube durante a noite a 4 °C.
4. No dia seguinte (Dia 2), prepare 1X CUT&Tag nuclei buffer e coloque no gelo.
5. Marcação CUT&Tag
   1. Recupere o tubo de reação (Passo 4.3.3) do rotador. Adicione 5 μL de ativador CUT&Tag e transfira a mistura para um novo tubo de 1,5 mL. Incube por 1 hora a 37 °C no ThermoMixer a 550 rpm.
   2. Retire o tubo, adicione 20 μL de tampão de tampão de têmpera CUT&Tag e misture suavemente a reação pipetando 10 vezes. Centrifuge o tubo na centrífuga pré-refrigerada com baldes oscilantes a 500 x g por 10 minutos. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de núcleos, deixando ~5 μL de sobrenadante no fundo do tubo.
   3. Adicione 100 μL de buffer de núcleos 1X CUT&Tag e ressuspenda os núcleos pipeteando suavemente 10 vezes. Gire o tubo na centrífuga pré-refrigerada com baldes de giro a 500 x g por 10 minutos. Remova 85 μL do sobrenadante, deixando para trás ~15 μL. Resuspenda os núcleos pipetando suavemente e lentamente 10 vezes.
6. Contagem de núcleos marcados e determinação do número de direcionamento
   1. Adicione 1 μL da suspensão de núcleos marcados em 9 μL de soro salino tamponado com fosfato e misture com 10 μL de solução de coloração AO/PI. Conte núcleos marcados conforme descrito no Passo 3.1.
   2. Use 1,6x o número alvo de núcleos para geração de GEM em célula única para obter o número desejado de núcleos capturados.
   3. Gire o tubo na centrífuga pré-refrigerada com baldes de giro a 500 x g por 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando um volume final de 8 μL.

5. Codificação de barras de célula única de núcleos marcados e pré-amplificação de DNAs codificados por código de barras

1. Adicione 7 μL de buffer ATAC B a 8 μL dos núcleos marcados com o número esperado de núcleos direcionados para seu experimento.
   NOTA: Veja mais detalhes sobre configurações de reação e operação do instrumento Chromium X no protocolo "GEM Generation & Barcoding" do Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. Geração de GEM e código de barras usando o instrumento Chromium X.
   1. Adicione 60 μL de mistura master GEM ao tubo contendo núcleos marcados. Misture suavemente pipetando e coloque na fileira 1 do chip J do Chromium Next GEM.
   2. Prepare as esferas de gel Multiome de célula única e coloque 50 μL de esferas de gel na linha 2. Dispense 45 μL de óleo de partição nos poços na fila 3.
   3. Coloque o chip montado J com a junta na bandeja do instrumento Chromium X e execute o instrumento.
   4. Aspire lentamente 100 μL de GEMs a partir dos pontos mais baixos dos poços de recuperação na fileira superior 3. Distribua lentamente os GEMs no novo tubo de PCR sobre gelo com as pontas da pipeta contra as paredes laterais dos poços.
   5. Incube os GEMs coletados em um termociclador (temperatura da tampa a 50°C) seguindo o seguinte protocolo: um ciclo de 37 °C por 45 minutos, um ciclo de 25 °C por 30 minutos e 4 °C para retenção.
   6. Adicione 5 μL de agente de têmpera e misture lentamente, pipetando 10 vezes.
3. Limpeza da incubação pós-GEM e purificação do DNA
   NOTA: Veja mais detalhes no protocolo "Post GEM Incubation Cleanup" do Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. Adicione 125 μL de agente de recuperação de cor rosa ao tubo em temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo 10 vezes. Centrifuge brevemente. Remova lentamente e descarte 125 μL de agente de recuperação/óleo de partição (rosa) do fundo do tubo.
   2. Adicione 200 μL de mistura de limpeza Dynabeads ao tubo e misture pipetando 10 vezes. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo no suporte magnético até a solução desaparecer. Remova o sobrenadante.
   3. Adicione 300 μL de etanol 80% recém-preparado ao pellet. Incube por 30 segundos e remova o sobrenadante. Adicione 200 μL de etanol 80% ao pellet, incube por 30 segundos e remova o sobrenadante. Gire o tubo brevemente e coloque-o no ímã. Remova o sobrenadante restante.
   4. Remova o tubo do ímã. Adicione imediatamente 50,5 μL de solução de elução I. Misture pipetando e incube por 1 minuto em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque o tubo no ímã até a solução desaparecer. Transfira 50 μL de solução liberada para um novo tubo.
   5. Purificação do DNA por esferas paramagnéticas
      1. Adicione 90 μL de esferas paramagnéticas (1,8X) a cada amostra e misture pipetando cuidadosamente. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque o tubo no ímã até a solução desaparecer. Remova o sobrenadante.
      2. Adicione 200 μL de etanol 80% ao pellet. Incube por 30 segundos. Remova o etanol. Repita isso mais uma vez.
      3. Gire brevemente e coloque o tubo no ímã. Remova o sobrenadante restante.
      4. Remova o tubo do ímã. Adicione 46,5 μL de EB do tampão e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      5. Transfira 46 μL de DNA purificado para um novo tubo.
4. Pré-amplificação de DNAs com código de barras.
   1. Adicione 54 μL de mistura de pré-amplificação a cada amostra. Mistura de pipetas e centrifuge brevemente.
   2. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 105 °C) seguindo o seguinte protocolo: um ciclo de 72 °C por 5 minutos; um ciclo de 98 °C por 3 minutos; um total de 7 ciclos de 98 °C por 20 s, 63 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; um ciclo de 72 °C por 1 minuto; e uma retenção a 4 °C. Armazene a 4 °C durante a noite.
   3. No dia seguinte (Dia 3), purifique os DNAs pré-amplificados por esferas paramagnéticas (1,6X), conforme descrito no Passo 5.3.5. Adicione 80,5 μL de EB do tampão ao tubo e misture pipetando. Incube por 2 minutos a 22 °C (temperatura ambiente). Gire brevemente e coloque o tubo no ímã até a solução desaparecer.
   4. Transfira 80 μL de DNAs pré-amplificados para um novo tubo. Use 40 μL para gerar a biblioteca CUT&Tag. Armazene os DNAs pré-amplificados restantes a 4 °C.
      NOTA: 40 μL dos DNAs pré-amplificados restantes serão usados posteriormente para expressão gênica e bibliotecas de códigos de barras espaciais.

6. Preparação de bibliotecas para CUT&Tag, expressão gênica e códigos de barras espaciais

1. Preparação da biblioteca scCUT&Tag
   1. Transfira 40 μL de DNAs pré-amplificados para um novo tubo e adicione 60 μL de mistura PCR de índice da amostra. Misture pipetando e fiando brevemente.
   2. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 105 °C) com o seguinte protocolo: um ciclo de 98 °C por 45 s; um total de 12 ciclos de 98 °C por 20 s, 67 °C por 30 s, 72 °C por 20 s; um ciclo de 72 °C por 1 minuto; 4 °C para retenção).
      NOTA: O número ótimo de ciclos depende do número inicial de núcleos e da marca de histona a ser perfilada. Doze ciclos de amplificação foram usados para a marca H3K27ac no experimento.
   3. Seleção dupla de tamanho e purificação do DNA por esferas paramagnéticas (0,6X, 1,55X)
      1. Adicione 60 μL de esferas paramagnéticas (0,6X) a cada amostra e misture pipetando cuidadosamente. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque o tubo no ímã até a solução desaparecer.
      2. Transfira 150 μL de sobrenadante para um novo tubo. Adicione 95 μL de esferas paramagnéticas (1,55X) a cada amostra (sobrenadante) e misture por pipeteamento. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo sobre o ímã até a solução se dissipar. Remova o sobrenadante.
      3. Adicione 300 μL de etanol 80% ao pellet. Espere 30 segundos. Remova o etanol. Repita mais uma vez. Gire brevemente e coloque o tubo no ímã. Remova o sobrenadante restante.
      4. Remova o tubo do ímã. Adicione 20,5 μL de EB do tampão ao tubo e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      5. Transfira 20 μL de bibliotecas CUT&Tag purificadas e indexadas para novos tubos.
2. Verificação de controle de qualidade para a biblioteca CUT&Tag
   1. Análise da distribuição do tamanho do DNA na biblioteca
      1. Misture 1 μL de DNA purificado da biblioteca com 1 μL de tampão de baixo TE.
      2. Misture o DNA diluído com o tampão de trabalho do Fragment Analyzer e execute o instrumento com o Kit de Fragmentos HS NGS de Alta Sensibilidade (1-6000bp) (Figura 3A).
   2. Avalie o enriquecimento de um locus genômico positivo para H3K27ac antes de sequenciar e mapear.
      1. Misture 1 μL de DNA da biblioteca purificado com 4 μL de água sem nuclease. Use 1 μL de DNA de biblioteca diluído para medições qPCR de três loci genômicos.
         NOTA: Para H3K27ac CUT&Tag, o primer positivo foi projetado a partir do locus Actb-TSS, enquanto os primers direcionados ao T1-TSS e um locus intergênico serviram como controles^{negativos 20} (Tabela 1). DNA genômico de camundongo foi usado como controle de entrada para normalizar a eficiência da PCR (Figura 3B).
      2. Prepare um total de 20 μL da mistura da reação da seguinte forma: 1 μL de DNA da biblioteca diluído, 2 μL de mistura de primer de 10 μM, 10 μL de 2X SYBR Green Master Mix e 7 μL de água sem nuclease.
      3. Execute a placa de qPCR preparada no Sistema de PCR em Tempo Real CFX Opus usando o programa de ciclagem apropriado para a detecção de SYBR Green.
3. Amplificação de cDNAs e DNAs de código de barras espaciais.
   1. Transfira 35 μL de DNAs pré-amplificados (Passo 5.4.4) para um novo tubo e adicione 65 μL da mistura de reação de amplificação de cDNA. Misture pipetando e fiando brevemente. O primer usado para amplificação de DNA cDNA e código de barras espacial é o Feature cDNA Primers 2.
   2. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 105 °C) com o seguinte protocolo: um ciclo de 98 °C por 45 s; um total de 8 ciclos de 98 °C por 20 s, 63 °C por 30 s, 72 °C por 1 minuto; um ciclo de 72 °C por 1 minuto; 4 °C para retenção.
      NOTA: O número ótimo do ciclo deve ser determinado com base no tipo celular, conteúdo de RNA e número inicial de núcleos. Neste experimento, foram realizados 8 ciclos de amplificação.
   3. Purificação de cDNAs amplificados
      1. Seleção dobrada de tamanho e purificação do DNA por esferas paramagnéticas (0,6X, 2,0X) conforme descrito no Passo 6.1.3. Adicione 60 μL de esferas paramagnéticas (0,6X) a cada amostra e misture pipetando. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Coloque o ímã na solução até que ela limpe.
      2. Transfira e economize 75 μL de sobrenadante em um tubo novo sem perturbar o pellet. Mantenha em temperatura ambiente.
         ATENÇÃO: Não descarte o sobrenadante, pois ele contém DNA enriquecido para fragmentos mais curtos que serão usados para gerar a biblioteca de códigos de barras espaciais.
      3. Remova o sobrenadante restante do comprimido. Lave com etanol 80% duas vezes, conforme descrito no Passo 6.1.3.
      4. Adicione 40,5 μL de EB do tampão ao tubo e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      5. Transfira 40 μL de cDNAs amplificados para um novo tubo. Guarde no gelo para preparar uma biblioteca de expressão gênica indexada.
         NOTA: Essa fração enriquece os DNAs para o tamanho típico dos cDNAs.
   4. Purificação de DNAs de código de barras espaciais amplificados
      1. Adicione 70 μL de esferas paramagnéticas (2,0X) a 75 μL do sobrenadante previamente salvo (Passo 6.3.3.2). Misture pipetando e fiando brevemente. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo sobre o ímã até a solução se dissipar. Remova o sobrenadante.
      2. Lave com etanol 80% duas vezes, conforme descrito no Passo 6.1.3.
      3. Adicione 40,5 μL de EB do tampão ao tubo e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      4. Transfira 40 μL de DNAs de código de barras espaciais amplificados e purificados para um novo tubo. Armazene a −20 °C para a geração subsequente da biblioteca de códigos de barras espacial indexada.
   5. Análise dos tamanhos de cDNA pelo Analisador de Fragmentos. Misture 1 μL de cDNA amplificado com 1 μL de tampão de baixo TE. Rodar os DNAs diluídos pelo Fragment Analyzer conforme descrito no Passo 6.2.1.
   6. Preparação de uma biblioteca de expressão gênica indexada
      1. Transfira 10 μL de cDNAs amplificados (Passo 6.3.3.5) para um novo tubo. Adicione 25 μL de EB tampão e 15 μL de mistura de fragmentação. Misture pipetando no gelo. Gire brevemente e transfira o tubo para o ciclador térmico pré-resfriado a 4 °C.
      2. Incubar em um ciclador térmico (temperatura da tampa a 65 °C) iniciando o seguinte protocolo: um ciclo de 32 °C por 5 minutos; um ciclo de 65 °C por 30 minutos; 4 °C para retenção.
      3. Dobra a seleção de tamanho e purificação do DNA por esferas paramagnéticas (0,6X, 0,8X) conforme descrito no Passo 6.1.3. Adicione 50,5 μL de EB do tampão e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      4. Transfira 50 μL de amostra para um novo tubo. Adicione 50 μL de mistura de ligação de adaptadores e misture pipetando. Gire brevemente. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 30 °C) seguindo o seguinte protocolo: um ciclo de 20 °C por 15 minutos e 4 °C para retenção.
      5. Purificação de DNA por esferas paramagnéticas (0,8X) conforme descrito no Passo 5.3.5. Adicione 30,5 μL de EB do tampão e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer. Transfira 30 μL da amostra para um novo tubo.
      6. PCR de índice da biblioteca de expressão gênica. Adicione 50 μL de mistura de amperes e adicione 20 μL de um conjunto individual A de TT de índice duplo a cada amostra.
      7. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 105 °C) com o seguinte protocolo: um ciclo de 98 °C por 45 s; um total de 11 ciclos de 98 °C por 20 s, 54 °C por 30 s, 72 °C por 20 s; um ciclo de 72 °C por 1 minuto; 4 °C para retenção.
         NOTA: O número ótimo do ciclo precisa ser determinado com base no tipo celular, conteúdo de RNA e número inicial de núcleos. Neste experimento, foram usados um total de 11 ciclos de amplificação.
      8. Dobra a seleção de tamanho e purificação do DNA por esferas paramagnéticas (0,6X, 0,8X) conforme descrito no Passo 6.1.3. Adicione 35,5 μL de EB do tampão ao tubo e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Gire brevemente e coloque sobre o ímã até a solução desaparecer.
      9. Transfira 35 μL de biblioteca de expressão gênica purificada e indexada para um novo tubo.
4. Análise da distribuição do tamanho do DNA na biblioteca de expressão gênica. Misture 1 μL de DNAs da biblioteca com 1 μL de tampão de baixo TE. Rodar os DNAs diluídos conforme descrito no Passo 6.2.1. (Figura 3A).
5. Preparação de biblioteca de códigos de barras espaciais indexados
   1. Prepare um total de 100 μL da mistura PCR índice da amostra da seguinte forma: 50 μL de mistura Amp (do GEM-X Single-Cell 3' Feature Bar Code Kit, 25 μL de Buffer EB, 20 μL de primer do Dual Index Plate TT Set A e 1 μL de DNAs de código de barras espaciais purificados (Passo 6.3.4.4) diluídos em 4 μL de buffer EB.
   2. Incubar em um termificador (temperatura da tampa a 105 °C) com o seguinte protocolo: um ciclo de 98 °C por 45 s; um total de 7 ciclos de 98 °C por 20 s, 54 °C por 30 s, 72 °C por 20 s; 72 °C por 1 minuto; 4 °C para retenção.
   3. Purificação de DNA por esferas paramagnéticas (1,2X) conforme descrito no Passo 5.3.5. Adicione 35,5 μL de buffer EB ao tubo e misture pipetando. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Coloque o tubo sobre o ímã até a solução estar clara.
   4. Transfira 35 μL de DNAs purificados e indexados de bibliotecas de códigos de barras espaciais para um novo tubo. Armazene a 4 °C por até 72 horas ou a −20 °C para armazenamento a longo prazo.
6. Verifique a distribuição dos tamanhos de DNA na biblioteca de códigos de barras espaciais indexados. Misture 1 μL de DNA purificado da biblioteca com 1 μL de tampão de baixo TE. Execute os DNAs diluídos pelo Analisador de Fragmentos conforme descrito na Etapa 6.2.1 (Figura 3A).

Figura 3: Avaliações de controle de qualidade de bibliotecas indexadas. (A) Perfis de tamanho em DNAs amplificados e bibliotecas indexadas. O DNA é analisado por um Analisador de Fragmentos para avaliar a qualidade e a distribuição do tamanho do DNA. Apresentados estão perfis representativos para a biblioteca CUT&Tag indexada, DNA amplificado usado para expressão gênica e preparação de bibliotecas de códigos de barras espaciais, biblioteca de expressão gênica indexada e biblioteca de códigos de barras espaciais indexados. (B) A biblioteca CUT&Tag é analisada por qPCR para avaliar o enriquecimento de uma região genômica positiva para H3K27ac (ou seja, ACTB) sobre o sinal de fundo negativo para H3K27ac (ou seja, T1 e um locus intergênico). A diferença de dobra entre regiões positiva/negativa é calculada como enriquecimento²¹. Um enriquecimento de dobras maior que 10 é considerado ideal neste^{ensaio 20}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

7. Sequenciamento das bibliotecas

1. Sequencie a biblioteca de códigos de barras espaciais do Trekker a uma profundidade de 5.000 pares de leitura por núcleo capturado.
2. Sequencie a biblioteca CUT&Tag do H3K27ac a uma profundidade de 25.000 pares de leitura por núcleo capturado.
3. Sequencie a biblioteca de expressão gênica a uma profundidade de pelo menos 20.000 pares de leitura por núcleo capturado.

8. Bioinformática e análise de dados

1. Processe a expressão gênica e as leituras CUT&Tag usando o Cell Ranger ARC v2.0.2 com --min-atac-count=100 e --min-gex-count=1000. Integre as saídas ARC do Cell Ranger com informações do código de barras do Trekker usando o pipeline Trekker v1.3.0 com parâmetros padrão para atribuir posições espaciais.
2. Realize o controle de qualidade usando o Signac. Células que atenderam a qualquer um dos seguintes critérios foram removidas da análise a jusante: para CUT&Tag, contagem total de fragmentos ≥ 1.000.000 ou ≤ 100, e enriquecimento TSS ≤ 2; para expressão gênica, a contagem total de UMI ≥ 100.000 ou ≤ 1.000, e o número total de genes detectados ≥ 10.284 ou ≤ 200.
3. Remova doublets usando scDblFinder para expressão gênica e AMULET para CUT&Tag. Células que atenderam a qualquer um dos seguintes critérios foram classificadas como doublets: (1) pontuação scDblFinder ≥ 0,6; (2) pontuação no scDblFinder ≥ 0,3 e AMULET ≤ 0,01; e (3) em aglomerados com alta porcentagem de doublets.
4. Normalize dados de expressão gênica usando dados LogNormalize e CUT&Tag usando TF-IDF. Calcule as incorporações de RNA PCA e CUT&Tag LSI, usando as dimensões LSI 2–50 para a modalidade de cromatina. Construa um grafo de vizinho mais próximo ponderado usando FindMultiModalNeighbors e gere embeddings UMAP com base no grafo de vizinhos multimodais.
5. Anote dados pós-QC do Trekker usando transferência de rótulos Seurat baseada no FindTransferAnchors e em uma estratégia de mapeamento de projeção PCA com parâmetros padrão. Dados scRNA-seq do ABC Atlas (versão 20230630) foram usados como referência. Previsões de tipos celulares inconsistentes com a anatomia dos tecidos conhecidas foram removidas durante a curadoria manual.
   NOTA: Os scripts para análise de bioinformática estão disponíveis no GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Utilizando uma seção coronal (25 μm de espessura, aproximadamente 70% de cobertura de um mosaico espacial de 10 × 10 mm) de tecido cerebral de camundongo fresco congelado, o fluxo de trabalho aqui descrito consistentemente produziu 50.100 núcleos de alta qualidade (DS = 12.200, n = 8), suficientes para o perfil multiômico de célula única a jusante (Figura 1). Após o código de barras espacial Trekker da seção de tecido, os núcleos foram isolados usando dissociação suave de tecidos e posteriormente purificados com o kit de isolamento de núcleo único da Invent. Esse procedimento resultou em detritos mínimos e baixos níveis de agregação nuclear, produzindo preparações de núcleos adequadas para ensaios de célula única. Imagens representativas dos núcleos isolados são mostradas na Figura 2.

Para ensaios de núcleo único a jusante, incluindo o perfil multioma CUT&Tag (CUT&Tag + expressão gênica), aproximadamente 50.000 núcleos eram tipicamente processados aqui. Para maximizar a recuperação nuclear, foi implementado um protocolo simplificado e simplificado de baixa entrada CUT&Tag, utilizando direcionamento direto anticorpo–pA/Tn5 e marcação, minimizando assim os tempos de incubação e as etapas^{de lavagem 19}. Usando essa abordagem, aproximadamente 25.000 núcleos marcados foram recuperados, correspondendo a um rendimento médio de 48,3% (DE = 6,1, n = 3). Esses núcleos foram posteriormente usados para codificação de barras de célula única com as 10x esferas de gel Genomics Chromium Multiome. Para a geração de GEM, aproximadamente 15.000 núcleos foram alvos com a expectativa de recuperar ~10.000 núcleos espacialmente indexados após filtragem de qualidade. Com base na decodificação de códigos de barras espaciais do Trekker, 81,3% dos núcleos (SD = 9, n = 3) do conjunto de dados de célula única puderam ser atribuídos com confiança a posições espaciais dentro do tile.

O fluxo de trabalho multioma espacial Trekker–CUT&Tag gera três bibliotecas indexadas: CUT&Tag, expressão gênica e bibliotecas de códigos de barras espaciais. O DNA pré-amplificado com código de barras foi dividido em duas frações, cada uma usada para preparação de bibliotecas de acordo com a química de captura dos alvos nas esferas de gel. As bibliotecas CUT&Tag foram amplificadas diretamente a partir de DNA pré-amplificado e apresentaram distribuições de tamanho de fragmentos características da marcação CUT&Tag, correspondentes a DNAs sem nucleossomos e nucleossomos (Figura 3A). A biblioteca mostrou um bom enriquecimento do locus Actb positivo para H3K27ac sobre os loci genômicos negativos para H3K27ac^20,21 (ou seja, diferença de 68 vezes, excedendo o corte de 10 vezes previamente estabelecido para a análise de imunoprecipitação por imunoprecipitação de cromatina^{em H3K27ac 20}) (Figura 3B). Para expressão gênica e bibliotecas de códigos de barras espaciais, o DNA pré-amplificado foi inicialmente amplificado seguindo o protocolo de amplificação de cDNA 10x da Genômica e depois separado em duas frações baseadas no tamanho do fragmento usando purificação por esferas paramagnéticas. A biblioteca de códigos de barras espaciais indexados foi preparada a partir da fração enriquecida para fragmentos mais curtos e exibiu um pico acentuado no tamanho esperado do fragmento. Bibliotecas de expressão gênica mostraram uma distribuição de tamanho característico centrada em fragmentos de cDNA amplificados (Figura 3A).

Figura 4: Representação de célula única e espacial do ensaio espacial Trekker–CUT&Tag multioma no tecido cerebral de camundongo. (A) Identificação de tipos celulares por análise de célula única. Os gráficos de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) mostram populações celulares anotadas derivadas apenas de H3K27ac CUT&Tag, expressão gênica isolada e o conjunto de dados multioma integrado (CUT&Tag + expressão gênica). (B) Representação espacial de dados espaciais do multioma Trekker–CUT&Tag. Núcleos do conjunto de dados multiomático integrado são atribuídos a coordenadas espaciais usando códigos de barras Trekker, revelando distribuições anatomicamente organizadas dos tipos celulares na seção de tecido cerebral do camundongo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O sequenciamento e mapeamento das bibliotecas CUT&Tag e expressão gênica foram realizados usando o Cell Ranger ARC v2.0.2 seguindo 10x diretrizes de Genômica, enquanto as bibliotecas de códigos de barras espaciais foram processadas usando o Trekker v1.3.0 segundo as recomendações do Takara Trekker. As opções sugeridas de mapeamento ATAC-seq de célula única foram aplicadas às bibliotecas CUT&Tag. Conjuntos de dados de núcleo único foram gerados apenas para CUT&Tag, expressão gênica isolada e o multioma combinado (CUT&Tag + expressão gênica). Células com UMIs totais para CUT&Tag (≥ 1.000.000 ou ≤ 100) ou expressão gênica (≥ 100.000 ou ≤ 1000) foram filtradas usando Signac²². A previsão de duplos foi realizada usando uma combinação de scDblFinder²³ para expressão gênica e AMULET²⁴ para CUT&Tag. Células que atendam a um dos seguintes critérios foram removidas: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score entre 0,3 e 0,6, e amulet.score < 0,01. A anotação do tipo celular foi realizada usando o FindTransferAnchors²⁵ de Seurat, baseado nos dados de referência²⁶ do Allen Brain Cell Atlas. Para a biblioteca de expressão gênica deste estudo, a contagem mediana de UMI por célula foi de 15.378, e o número mediano de genes por célula foi de 4.378. Para a biblioteca CUT&Tag, foram detectadas 11.860 células, com mediana de 6.631 fragmentos de alta qualidade por célula e um escore de enriquecimento TSS de 7,66. Para a biblioteca de códigos de barras espaciais do Trekker, 92,43% dos núcleos receberam posições espaciais e 51,54% foram designados a uma única localização espacial. Dados brutos de sequenciamento e dados processados de análises secundárias estão disponíveis via GEO sob o número de acesso GSE327406. O objeto final anotado de Seurat pós-QC está disponível no Zenodo sob o número de acesso 19475899. Incorporações representativas de UMAP com anotações de tipo de célula são mostradas na Figura 4A. Ao ligar códigos de barras de célula única com códigos de barras espaciais, núcleos individuais foram atribuídos de volta às suas localizações espaciais dentro do tecido para gerar um mapa espacial (Figura 4B). Este mapa corresponde de perto às características anatômicas observadas em seções adjacentes e se alinha com uma seção coronal do cérebro no Allen Brain^{Atlas 27}, uma referência padrão para a anatomia cerebral de camundongos. A análise conjunta da expressão gênica espacial e dos perfis H3K27ac em resolução de célula única permitiu a identificação dos principais tipos de células cerebrais e revelou padrões anatomicamente organizados de distribuição celular ao longo da seção tecidual.

Discussion

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho espacial multioma Trekker–CUT&Tag que integra código de barras espacial, perfilamento CUT&Tag de baixa entrada do H3K27ac, captura simultânea de múltiplos alvos moleculares nas 10x esferas de gel multioma de célula única da Genômica e preparação de biblioteca a jusante para sequenciamento Illumina. Ao acoplar a indexação espacial com leituras epigenômicas e transcriptômicas de célula única, essa abordagem aborda uma limitação fundamental dos ensaios multiomáticos convencionais de célula única, que carecem de contexto nativo do tecido. Este estudo demonstra com sucesso a viabilidade do perfilamento espacial multioma CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + expressão gênica) e estabelece uma base para o co-perfilamento espacial de alvos de expressão gênica e regulatórios, como marcas de histonas e proteínas associadas à cromatina.

Um rigoroso controle de qualidade em múltiplas etapas do fluxo de trabalho é essencial para a implementação bem-sucedida desse fluxo (Figura 1). Embora o procedimento descrito aqui comece com etapas pós-secção, a qualidade da própria seção de tecido é fundamental para resultados ótimos. A espessura da seção deve ser ajustada com base no tipo de tecido e na celularidade esperada. Durante a dissociação de tecidos e o isolamento de núcleos, maximizar o rendimento dos núcleos enquanto preserva a integridade nuclear é fundamental para o desempenho geral dos ensaios multiomas unicelulares baseados em Trekkers. Baixo rendimento de núcleos pode resultar de dissociação de tecidos subótima, isolamento ineficiente do núcleo ou espessura de seção insuficiente. A baixa integridade nuclear pode ocorrer de interrupções mecânicas excessivas, tempos de processamento prolongados ou sobrelisia. O isolamento de núcleos representa um ponto importante de resolução de problemas para a implementação bem-sucedida do fluxo de trabalho multioma de célula única baseado em Trekker. Portanto, a otimização específica do tecido do protocolo de isolamento de núcleos é fortemente recomendada antes de iniciar o ensaio multioma de célula única baseado em Trekker. Núcleos isolados devem ser avaliados quantitativa e qualitativamente. A contagem de núcleos usando corantes nucleares fornece uma estimativa do rendimento, enquanto o exame microscópico permite avaliar a integridade da membrana nuclear, agregação e a presença de detritos não nucleares. Após a preparação da biblioteca, todas as bibliotecas devem ser avaliadas quanto à distribuição do tamanho dos fragmentos e à ausência de dímeros adaptadores. Para bibliotecas CUT&Tag, o enriquecimento das regiões genômicas-alvo sobre o fundo deve ser avaliado por PCR quantitativa, fornecendo uma indicação precoce da especificidade do ensaio e da qualidade geral da biblioteca antes do sequenciamento. O controle de qualidade pós-sequenciamento é igualmente importante para a interpretação precisa dos dados multioma espaciais. Métricas como taxas de mapeamento, contagem de fragmentos por núcleo, enriquecimento do local de início da transcrição, pontuações fragmento no pico para CUT&Tag, complexidade gênica e profundidade de leitura por célula devem ser avaliadas seguindo as diretrizes recomendadas pela 10x Genomics e Takara Trekker. A avaliação conjunta dessas métricas em modalidades epigenômicas e transcriptômicas permite a identificação de artefatos técnicos e garante a integração confiável de informações espaciais, epigenômicas e transcricionais.

Embora a viabilidade da abordagem de entrada baseada em código de barras baseada em Trekker combinada com um ensaio multioma CUT&Tag de célula única seja demonstrada neste estudo, a abordagem descrita também apresenta limitações. Por exemplo, o método atualmente está restrito a tecido fresco congelado, e sua viabilidade só foi demonstrada para o perfil de uma única modificação de histona (H3K27ac) em um único tipo de tecido (cérebro de camundongo) sem réplicas biológicas. Além disso, a abordagem depende de duas plataformas comerciais proprietárias (Takara Trekker e 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Avaliações adicionais em diversos tipos de tecidos e marcas epigenéticas adicionais serão necessárias para avaliar a aplicabilidade, desempenho, generalização e reprodutibilidade mais amplas dessa tecnologia.

Em resumo, o protocolo espacial Trekker–CUT&Tag multioma apresentado aqui demonstra a capacidade para co-perfilamento espacialmente resolvido de células únicas de características epigenômicas e transcriptômicas. Ao combinar o código de barras espacial com a química multioma de célula única já estabelecida, ele possibilita a investigação mecanicista da regulação gênica dentro da arquitetura de tecidos intactos e oferece uma plataforma poderosa para futuras aplicações em biologia espacial. Usos potenciais notáveis incluem a avaliação do impacto de vários estímulos experimentais e ambientais no controle epigenético da expressão gênica em tipos celulares específicos — por exemplo, os efeitos das estimulações nervosas podem ser analisados em tipos específicos de neurônios nos sistemas nervoso central e periférico, ou o impacto em células próximas das células imunes pró- e anti-inflamatórias infiltradas pode ser revelado em doenças inflamatórias e cânceres.