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Artigo de investigação
Este estudo integra farmacologia em rede e experimentos in vivo para investigar os potenciais efeitos da Pílula de Yougui no tratamento da prostatite. A análise de farmacologia em rede e o tratamento com YGP em um modelo de prostatite em ratos sugeriram que os efeitos terapêuticos do YGP podem estar associados à regulação das respostas inflamatórias, indicando que o YGP exerce efeitos anti-inflamatórios na prostatite.
Prostatite é um distúrbio urológico comum com opções de tratamento limitadas. A Yougui Pill (YGP) tem demonstrado potencial de valor terapêutico, especialmente em condições relacionadas à inflamação. Este estudo teve como objetivo avaliar seus efeitos e explorar possíveis mecanismos subjacentes. Componentes ativos do YGP foram triados do TCMSP usando critérios de biodisponibilidade oral (OB ≥ 30%) e similaridade do medicamento (DL ≥ 0,18), e alvos correspondentes foram coletados. Alvos relacionados à prostatite foram obtidos a partir de GeneCards, e alvos sobrepostos foram analisados usando redes de interação proteína-proteína (PPI) e enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Um total de 126 compostos ativos e 208 alvos potenciais foram identificados, com 180 alvos sobrepostos associados à prostatite. A análise de IBP identificou TP53, IL6, AKT1, TNF e IL1B como genes centrais-chave. O enriquecimento KEGG sugeriu envolvimento de vias relacionadas à inflamação, incluindo vias de sinalização IL-17, TNF, MACK e PI3K-Akt. Um modelo de prostatite em rato foi estabelecido por injeção intraprostática de carragenina. Foram realizados exames histológicos e medições do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) para avaliar os efeitos terapêuticos. O tratamento com YGP melhorou a histopatologia prostática e reduziu os níveis de TNF-α e IL-6 tanto em proteínas quanto em mRNA. Esses achados sugerem que o YGP exerce efeitos anti-inflamatórios na prostatite, enquanto os mecanismos moleculares específicos ainda precisam ser validados.
Prostatite é uma condição em que a glândula prostática fica inflamada com inchaço eirritação 1. Ela representa aproximadamente 25% das consultas clínicas urológicasglobais 2. Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) estratificaram a prostatite em quatro classificações: bacteriana aguda, bacteriana crônica, prostatite crônica/síndrome da dor pélvica crônica (PC/CPPS) e prostatiteassintomática 3. Entre elas, a PC/CPPS é a forma mais prevalente e está intimamente associada à inflamação persistente e à desregulação imunológica. Apesar dos avanços na compreensão da natureza inflamatória da prostatite, as estratégias terapêuticas atuais continuam limitadas, especialmente para subtipos nãobacterianos 4,5. Antibióticos são comumente usados na prática clínica; no entanto, sua eficácia na prostatite não bacteriana é altamentecontroversa 6. Outros tratamentos, que vão de bloqueadores de α a anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), têm como principal alvo o alívio dos sintomas, mas frequentemente apresentam resultados subótimos, com riscos não desprezíveis de distúrbios gastrointestinais, hipotensão ortostática, entreoutros 7,8,9,10. Essas limitações destacam a necessidade de abordagens terapêuticas alternativas que possam modular efetivamente a inflamação na prostatite.
A medicina tradicional chinesa (MTC) pode oferecer uma gama mais ampla de benefícios terapêuticos, com um perfil de segurança e tolerabilidade maisfavoráveis 11. A Pílula Yougui (YGP), uma fórmula clássica documentada no Jingyue Quanshu, tem sido usada empiricamente por séculos para repor o yang renal e aliviar distúrbios relacionados12. Estudos anteriores relataram que alguns de seus constituintes possuem atividadesanti-inflamatórias 13,14,15,16. Evidências clínicas sugerem que a YGP pode aliviar efetivamente os sintomas da prostatite, embora o mecanismo subjacente permaneçaincerto 17. A farmacologia de redes serve como uma abordagem poderosa e integrativa que combina biologia de sistemas e farmacologia para desvendar os complexos mecanismos da medicinatradicional 18. Foi hipotetizado que o YGP poderia exercer efeitos anti-inflamatórios ao modular múltiplos alvos e vias relacionadas à inflamação. Essas previsões foram posteriormente avaliadas usando um modelo in vivo de prostatite, no qual a prostatite foi induzida por injeção de carragenina. Após o estabelecimento do modelo, os animais foram tratados com YGP. Tecidos prostáticos foram coletados para exame histopatológico por meio de coloração por hematoxilina e eosina (HE), bem como para avaliação quantitativa de marcadores inflamatórios por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (qRT-PCR).
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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM-2024110107-4103).
Coleta de constituintes e alvos ativos
O YGP consiste em Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla e Lycium barbarum. Esses nomes de ervas foram inseridos no banco de dados e plataforma de análise de sistemas de farmacologia da medicina tradicional chinesa (TCMSP) para recuperar seus compostos. Compostos ativos foram triados usando os critérios de biodisponibilidade oral (OB ≥ 30%) e de semelhança de fármaco (DL ≥ 0,18) 19,20,21. Os alvos correspondentes de cada composto foram obtidos a partir do TCMSP e padronizados para símbolos gênicos usando o banco de dados UniProt. Alvos relacionados à prostatite foram recuperados do banco de dados GeneCards usando "prostatite" como palavra-chave, e genes com pontuação de relevância superior à média foram selecionados para inclusão no estudo.
Construção da rede regulatória do YGP contra prostatite
A interseção entre alvos relacionados a YGP e prostatite foi identificada e definida como um conjunto de alvos terapêuticos potenciais. Esses alvos foram importados para o Cytoscape (versão 3.9.1) para construir uma rede composto-alvo-doença. A análise da topologia da rede foi realizada usando o plugin CytoHubba, e componentes-chave foram identificados com base nos valores de centralidade máxima de clique (MCC) 22.
Análise de redes de interação proteína-proteína (PPI)
Os alvos sobrepostos foram importados para o banco de dados STRING (versão 11.5), com o organismo definido como Homo sapiens. A pontuação mínima exigida de interação foi definida para ≥ 0,7, e nós desconectados foramocultos 23. Os dados de interação foram exportados no formato TSV e visualizados no Cytoscape. Genes hub foram ainda identificados usando o plugin CytoHubba com base na centralidade de graus.
Análise de enriquecimento da via KEGG e GO
Os alvos compartilhados foram enviados para a plataforma Metascape para análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). A entrada e a análise das espécies foram definidas para Homo sapiens. Foi realizada uma análise de enriquecimento de vias KEGG. As vias foram ainda mais filtradas com base em sua relevância para a prostatite, conforme determinado pela literatura publicada e anotações de bancos de dados. Os demais caminhos foram classificados de acordo com seus valores Log P. As vias superiores do KEGG enriquecido foram visualizadas usando gráficos de bolhas.
Acoplamento molecular
Os principais alvos foram selecionados da rede PPI com base na centralidade do grau, e os compostos ativos foram identificados a partir da rede regulatória YGP-prostatite com base nos valores MCC para análise subsequente de acoplamento. As estruturas proteicas foram obtidas do Banco de Dados de Estruturas de Proteínas AlphaFold no formato PDB, e as estruturas de ligantes foram baixadas do TCMSP no formatomol2 24. O acoplamento molecular foi realizado usando a plataforma online25 do CB-Dock2. Antes do acoplamento, as estruturas proteicas eram pré-processadas automaticamente removendo moléculas de água, adicionando átomos de hidrogênio e completando resíduos ausentes. As afinidades de vinculação eram registradas e os mapas de calor eram gerados usando o GraphPad Prism (versão 10.1.2). As estruturas tridimensionais dos complexos ligante-proteína com as menores pontuações Vina foram visualizadas usando ChimeraX, e diagramas de interação bidimensional foram gerados usando LigPlus.
Preparação de extrato aquoso YGP
Os componentes herbais do YGP foram preparados segundo a proporção tradicional de formulação, incluindo 24 g da raiz processada de Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g da raiz lateral processada de Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g da casca de Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g do rizoma de Dioscorea oposto (Shanyao), 9 g do fruto de Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g da semente de Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g da gelatina processada de galhadas de Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g do fruto de Lycium barbarum (Gouqi), 9 g da raiz de Angelica sinensis (Danggui) e 12 g da casca de Eucommia ulmoides (Duzhong). Todas as ervas, exceto Aconitum carmichaelii e Cervi Cornus Colla , foram deixadas de molho em 6 vezes o peso total de água destilada por 30 minutos, enquanto Aconitum carmichaelii foi embebida separadamente em 6 vezes o peso da água destilada. Aconitum carmichaelii foi decoctado primeiro usando um dispositivo elétrico de aquecimento por 1 hora, após o que as ervas restantes, exceto Cervi Cornus Colla, foram adicionadas e decoctadas duas vezes por 1 hora a cada ciclo. Cervi Cornus Colla foi posteriormente derretido em banho-maria a 60–70 °C até ser totalmente dissolvido e incorporado ao extrato. Após o resfriamento, a decocção era filtrada por gaze de dupla camada, alicotada, congelada a -20 °C por 48 horas e liofilizada para obter um extrato em pó.
Modelo animal e desenho experimental
Ratos machos de Sprague-Dawley (8 semanas de idade, 200–220 g) foram alojados sob condições específicas livres de patógenos, com ciclo de 12 horas de luz/escuro e livre acesso a comida e água. Após 1 semana de aclimatação, os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 6 por grupo): grupos-controle, modelo e YGP. A prostatite crônica foi induzida por injeção intraprostática de solução26 de carragenina a 3%. Brevemente, ratos foram anestesiados com isoflurano (3–4% para indução e 1,5–2% para manutenção), e uma incisão abdominal média foi feita para expor a próstata. Um total de 25 μL de solução de carragenina a 3% foi injetado em cada lobo ventral da próstata. O grupo controle recebeu apenas uma injeção intraprostática de soro fisiológico (solução fisiológica). Penicilina pós-operatória (2,5 × 105 U/kg) foi administrada intramuscularmente por 3 dias.
O pó de extrato liofilizado YGP foi preparado a partir da decocção e reconstituído em soro fisiológico normal estéril 0,9% para obter uma suspensão uniforme para a gavage oral (10,54 g/kg/dia). Ratos do grupo YGP receberam administração oral do extrato YGP (10 mL/kg), enquanto os grupos controle e modelo receberam um volume equivalente de 0,9% de soro fisiológico normal estéril. Após 4 semanas, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg, injeção intraperitoneal), e tecidos prostáticos foram coletados após serem sacrificados conforme as diretrizes éticas.
Exame histopatológico
Os tecidos prostáticos foram fixados com paraformaldeído a 4% por 24 horas, desidratados por etanol graduado (álcool 75% por 4 horas, álcool 85% por 2 horas, álcool 90% por 2 horas, álcool 95% por 1 hora, etanol absoluto por 1 hora), eliminados em xileno e incorporados em parafina. As seções (4–5 μm) foram então submetidas à coloração com HE, conforme os procedimentospadrão 27. Brevemente, as seções foram desparafinizadas, reidratadas, coradas com hematoxilina, diferenciadas e contra-coloridas com eosina. Após desidratação e montagem, as seções foram observadas sob um microscópio óptico para avaliação histopatológica.
A inflamação histopatológica foi avaliada usando um sistema de pontuação semi-quantitativo baseado na infiltração de células inflamatórias, proliferação de fibroblastos, morfologia acinar e status de secreção. A infiltração inflamatória de células foi pontuada como 0 (sem infiltração), 2 (infiltração leve), 4 (infiltração moderada) e 6 (infiltração severa). A proliferação de fibroblastos foi classificada como 0 (ausente), 1 (leve), 2 (moderada) e 3 (grave). A morfologia acinar foi avaliada como 0 (lúmen acinar grande), 1 (tamanho do lúmen moderadamente reduzido), 2 (tamanho do lúmen marcadamente reduzido) e 3 (oclusão ou desaparecimento acinar). O status de secreção foi pontuado como 0 (secreção abundante), 1 (secreção moderada), 2 (secreção escassa) e 3 (ausência de secreção). A pontuação histopatológica total foi calculada como a soma dos quatro parâmetros, com escores mais altos indicando lesão mais grave do tecido prostático einflamação 28.
ELISA
Os tecidos prostáticos (100 mg) foram enxaguados com solução salina fosfatada tamponada gelada (PBS) e homogeneizados em tampão de lise suplementado com inibidores de protease. Os homogenados foram incubados a 4 °C por 30–120 minutos e centrifugados a 5000 × g por 15 minutos a 4 °C para coletar os supernadantes. Os níveis de proteína de TNF-α e IL-6 foram medidos usando kits ELISA conforme as instruções do fabricante. Padrões e amostras foram adicionados a placas de 96 poços e incubados a 37 °C, seguidos por incubação sequencial com anticorpos biotinilados e conjugados enzimáticos. Após a lavagem, a solução de substrato era adicionada para o desenvolvimento da cor, e a reação era terminada com a solução de parada. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca. As concentrações de citocinas foram calculadas com base em curvas padrão.
qRT-PCR
O RNA total foi extraído dos tecidos prostáticos usando um método baseado em colunas e quantificado medindo a absorção em 260 e 280 nm para avaliar a pureza. Amostras de RNA foram transcritas reversamente em cDNA a 42 °C por 15 minutos usando um kit de transcrição reversa. qRT-PCR foi realizada usando um termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s. As sequências de primers utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela Suplementar 1. Sinais de fluorescência foram coletados durante a etapa de recozimento/extensão. Os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 foram normalizados para o gene de referência interno GAPDH. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2−ΔΔCt .
Análise estatística
Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism (versão 10.1.2). A distribuição dos dados foi avaliada quanto à normalidade antes da análise. As diferenças entre múltiplos grupos foram analisadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste post hoc de Tukey para múltiplas comparações. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Identificação de componentes bioativos e genes-alvo
Um total de 126 componentes bioativos no YGP atendendo aos critérios (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18) foram identificados. correspondentes a 208 genes-alvo previstos. O banco de dados GeneCards forneceu 9.845 genes associados à prostatite. A análise de Venn revelou 180 genes sobrepostos entre os alvos previstos do YGP e genes relacionados à prostatite, sugerindo que esses alvos compartilhados podem mediar os efeitos terapêutic...
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A prostatite é patologicamente definida pela presença aumentada de células inflamatórias no parênquima prostático oumesênquima 28,29. Em um estudo com mais de 5 milhões de homens coreanos acompanhados por nove anos, Kim et al. confirmaram por meio de análise multivariada que a prostatite aumenta significativamente o risco de desenvolver câncer de próstata30. No entanto, o manejo clínico atual permanece lim...
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Os autores não relatam conflitos de interesse nesta obra.
Os autores agradecem com gratidão o apoio financeiro dos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2022-JYB-JBZR-037).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldeído | Beyotime | P0099-3L | |
| Banco de Dados de Estrutura de Proteínas AlphaFold | Banco de Dados de Estrutura de Proteínas AlphaFold | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Mix verde qPCR (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Plataforma online de bioinformática | Plataforma online de bioinformática | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carragenino | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Citoscape | Citoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hematoxilina e Eosina (H&; E) Kit de Tingimento | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Balsâmico Neutro | Servicebio | WG10004160 | |
| Cera de Parafina (para embedding) | Servicebio | RP-15 | |
| Coquetel de Inibidores de Protease (100X) | Epizima | GRF101 | |
| Rat IL-6 ELISA Kit | Beyotime | PI328 | |
| Rat TNF-α Uniforme | Pequim & nbsp; 4A e nbsp; Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| Kit de Isolamento de RNA Longo de RNA para Animais RNAeasy com Coluna de Spin | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |