Janela de Crânio Opticamente Transparente Montada na Cabeça (HOTS) para Imagem Transcraniana Profunda do Córtex do Camundongo

Resumo

Este protocolo descreve uma janela de crânio opticamente transparente montada na cabeça (HOTS) baseada em um procedimento otimizado de limpeza do crânio em duas etapas. Essa abordagem resulta em um crânio altamente transparente, permitindo a obtenção de imagens com dois fótons do córtex cerebral adulto do camundongo até profundidades de até ~800 μm.

Resumo

A imagem de alta resolução com dois fótons do córtex cerebral adulto do camundongo é severamente limitada pela dispersão da luz do crânio, que atenua os sinais e restringe a profundidade da imagem in vivo. Embora métodos de limpeza do crânio tenham sido desenvolvidos para fornecer acesso óptico ao córtex através do crânio intacto, seu desempenho prático é limitado pelo tempo de limpeza limitado e por coquetéis de limpeza subótimos. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para implementar uma janela de crânio opticamente transparente montada na cabeça (HOTS). Nessa abordagem, uma tampa montada na cabeça era usada para manter as soluções de limpeza sobre o crânio, evitando assim anestesia prolongada ou restrição física e permitindo uma limpeza prolongada do crânio (várias horas) em camundongos acordados e de comportamento livre. Além disso, foi realizado um procedimento de eliminação em duas etapas usando reagentes (HOTS-S1: 10% peso/v EDTA, 15% peso por v D-manose, 10% peso por v sulfolane, 0,5% peso por v Tween 20; HOTS-S2: 70% em peso/v D-manose, 5% em peso/v sulfolane, 0,5% em peso/v Pré-adolescente 20) otimizado por triagem química sistemática. Fornecemos um protocolo passo a passo que inclui exposição e estabilização do crânio, criação e montagem da tampa montada na cabeça, administração e renovação dos reagentes de limpeza e preparação subsequente de imagens. Em camundongos de 6 semanas (~20 g), o protocolo HOTS produz rotineiramente um crânio altamente transparente que suporta imagens de dois fótons das estruturas corticais até profundidades de até ~800 μm abaixo do pia, aproximando-se do desempenho das janelas de crânio abertas. A janela HOTS permite a imagem estrutural em camundongos Thy1-GFP-M e a imagem funcional de cálcio em camundongos Thy1-GCaMP6s. Acreditamos que, como uma abordagem conveniente e minimamente invasiva, a janela HOTS facilitará significativamente a imagem transcraniana profunda e manipulações optogenéticas, fotofarmacológicas e outras baseadas na luz in vivo.

Introdução

O monitoramento intravital dos neurônios corticais é essencial para entender a estrutura e a função do^{cérebro 1}. A microscopia de dois fótons (TPM) é uma ferramenta fundamental para estudos in vivo^{como esses 2,3}. No entanto, sua qualidade de imagem e profundidade são severamente limitadas pela forte dispersão de luz proveniente do crânio opaco que cobre o^{córtex 4,5}.

As janelas de crânio^{aberto 6} e de crânio^{afino 7,8} melhoraram muito o acesso óptico ao córtex e são amplamente utilizadas, mas ambas as abordagens têm limitações inerentes. Janelas abertas do crânio podem induzir lesão cerebral aguda e respostas^{inflamatórias 9,10}, enquanto o afinamento do crânio é tecnicamente exigente e difícil de alcançar espessura uniforme^11,12.

Técnicas in vivo de limpeza óptica do crânio oferecem uma alternativa minimamente invasiva que permite a imagem de dois fótons em resolução axônica em camundongos adultos. No entanto, a profundidade de imagem alcançável permanece limitada (tipicamente 150–400 μm abaixo do pia⁾12,13,14,15. Na prática, a limpeza do crânio geralmente é restrita a um curto período sob anestesia com fixação rígida da cabeça, e a otimização sistemática dos coquetéis de limpeza para a composição óssea do crânio tem permanecido pouco^explorada 12,13,14,15.

Para superar essas limitações, anteriormente desenvolvemos uma janela de crânio ópticamente transparente montada na cabeça (HOTS) que permite a limpeza prolongada e offline do crânio em camundongos que se comportam livremente (Figura 1A)¹⁶. Essa abordagem emprega um procedimento de eliminação em duas etapas usando reagentes (S1 e S2), que foram otimizados por meio de triagem química sistemática em nosso trabalho^{anterior 16}. A otimização sistemática dos reagentes de limpeza e a caracterização da eficácia da limpeza, reversibilidade, biossegurança e desempenho de imagem in vivo da janela HOTS foram relatadas em nosso trabalho^{anterior 16}, que também demonstrou uma resposta astroglial favorável após o tratamento com HOTS. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para estabelecer a janela HOTS que possibilita a imagem transcraniana profunda de dois fótons em camundongos adultos. Em preparações representativas, as profundidades de imagem atingem ~800 μm abaixo do pia, quase igualando as possíveis com janelas de crânio abertas. A janela HOTS permite imagens estruturais profundas em camundongos Thy1-GFP-M e imagens funcionais de cálcio em camundongos Thy1-GCaMP6s acordados.

Protocolo

Todos os procedimentos de cuidado animal e experimentais foram aprovados pelo Comitê Provincial de Cuidado e Uso de Animais de Guangdong e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Tecnologia Avançada de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências. Os reagentes e equipamentos usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

NOTA: Este protocolo é otimizado para camundongos de 6 semanas (peso corporal ~20 g), que têm espessura do crânio de aproximadamente 100 μm.

1. Preparação de soluções para limpeza de crânios

1. Prepare a solução de limpeza do crânio S1 (10% em peso/v EDTA, 15% em peso/v D-manose, 10% em peso/v sulfolano, 0,5% em peso/v Pré-adolescente 20; RI: 1,38; pH final: 7.0-7.4)
   1. Pesa 0,35 g de hidróxido de sódio (NaOH). Adicione a 20 mL de água desionizada em um béquer e mexa até dissolver completamente. Isso eleva o pH da solução, facilitando a dissolução subsequente do EDTA.
      NOTA: NaOH é corrosivo. Use equipamentos de proteção individual adequados (luvas, jaleco, proteção ocular) e manuseie em um exaustor químico.
   2. Adicione 4 g de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) à solução de NaOH. Coloque o béquer em um banho-maria a 40 °C e mexa continuamente até que o EDTA esteja totalmente dissolvido.
   3. Esfrie a mistura até a temperatura ambiente. Adicione 6 g de D-mannose, 4 g de sulfolano e 0,2 g de Tween 20 à solução. Mexa em temperatura ambiente até que todos os componentes estejam completamente dissolvidos.
   4. Adicione água deionizada para levar o volume final a 40 mL. Misture bem para obter o S1.
      NOTA: O S1 pode ser armazenado em temperatura ambiente por vários meses.
2. Prepare a solução de limpeza do crânio S2 (70% peso por v de D-manose, 5% peso por v de sulfolane, 0,5% peso por v Tween 20; IR final: 1,44; pH final: 7,0-7,4)
   1. Pese 28 g de D-mannose, 2 g de sulfolane e 0,2 g de Tween 20 e transfira-os para um béquer limpo.
   2. Adicione água deionizada a aproximadamente 30 mL e mexa em temperatura ambiente até que todos os componentes estejam completamente dissolvidos.
   3. Adicione água desionizada para levar o volume final a 40 mL e misture bem para obter S2.
      NOTA: Aquecimento suave (25–30 °C) e agitação contínua aceleram a dissolução da D-manose. O S2 pode ser armazenado em temperatura ambiente por vários meses.

2. Preparação para a cirurgia

1. Autoclave de todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize completamente o ambiente de trabalho com álcool de 75%.
2. Anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal de 1% (p/v) de pentobarbital sódico (150–200 μL por 20 g de peso corporal).
   NOTA: Outros anestésicos reversíveis podem ser usados como alternativas ao pentobarbital de sódio.
3. Monitore a profundidade da anestesia usando o teste de reflexo de beliscão do dedo do pé e certifique-se de que o camundongo esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
4. Coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica e prenda a cabeça com barras auriculares.
5. Mantenha a temperatura corporal em 37 °C usando uma bolsa térmica.
6. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
   NOTA: Monitore de perto a respiração e os reflexos para evitar overdose de anestésicos e depressão respiratória.

3. Cirurgia e montagem da placa de cabeça

1. Exposição e limpeza do crânio (Figura 1Ba)
   1. Remova o couro cabeludo sobre toda a superfície dorsal do crânio usando pinças finas e tesouras cirúrgicas. Corte a pele lateralmente para expor as bordas dos músculos temporais e para trás em direção aos músculos do pescoço.
   2. Remova suavemente o periósteo da superfície do crânio usando pinças finas.
   3. Limpe a superfície do crânio com um aplicador úmido com ponta de algodão e seque o crânio com um fluxo suave de ar.
   4. Se for necessária localização precisa das áreas funcionais do córtex cerebral, marque pontos de referência espaçados 1 mm na superfície do crânio usando um aparelho estereotáxico.
2. Aplicação de cimento dentário e placa de cabeça (Figura 1Bb)
   1. Prepare o cimento dentário conforme as instruções do fabricante. Cimentos dentários com forte aderência e boa durabilidade, adequados para fixação a longo prazo, são recomendados para garantir fixação estável.
   2. Aplique uma fina camada de cimento dentário na superfície exposta do crânio e nos tecidos ao redor para proteção, deixando a região designada para a janela de limpeza sem revestimento.
      NOTA: Após misturar os componentes em pó e líquido do cimento dentário em uma proporção de volume de 1:1, espere aproximadamente 10 s para que o cimento adera à ponta do palito antes da aplicação. Isso reduz sua fluidez e melhora a dirigibilidade. Durante a aplicação, aplique o cimento da periferia em direção à janela de clareira designada e mantenha a área da janela completamente livre de cimento. A região limpa é definida pelo selante dental (cimento dental e material de revestimento macio) na superfície do crânio. Portanto, seu tamanho pode ser ajustado, mas é limitado pelas suturas cranianas ou pelo tamanho da cápsula. Para aplicações comuns em um hemisfério, a região limpa geralmente tem ~3–5 mm de diâmetro.
   3. Fixe uma pequena placa de titânio (para fixação da cabeça em um suporte personalizado durante a imagem subsequente) ao crânio usando cimento dental.
      NOTA: Diferentes designs de placas de cabeça podem ser usados para fixação de cabeça. Neste estudo, tanto headboards comercialmente disponíveis quanto placas personalizadas de titânio de dois furos foram usadas com sucesso. Independentemente do projeto, a placa de cabeça deve fornecer estabilidade mecânica suficiente para imagens subsequentes e não deve obstruir a janela de limpeza/imagem pretendida.

4. Criação de uma janela HOTS

1. Sele o crânio com material macio de revestimento dental auto-curativo (Figura 1Bc)
   1. Após o cimento dental curar completamente por aproximadamente 5 minutos, cubra a camada de cimento, exceto a região da janela de limpeza, com uma fina camada de material de revestimento dental macio auto-curante para formar uma vedação contínua sobre o crânio.
      NOTA: O material macio do revestimento melhora a vedação e reduz o vazamento durante exposições prolongadas a reagentes de limpeza.
   2. Modele o material macio auto-curativo do revestimento dental suavemente ao redor da margem planejada da janela de limpeza, criando uma superfície plana de vedação para a tampo.
2. Montando a tampa (Figura 1Bd)
   1. Corte a cabeça de uma pipeta plástica descartável (polietileno, PE) para criar uma pequena tampa cilíndrica com a parte superior fechada e a base abertas. O PE apresenta boa estabilidade química e não apresenta degradação ou reação visível com as soluções de limpeza S1 ou S2 durante o procedimento de limpeza.
      NOTA: A tampa cortada da cabeça de uma lâmpada de pipeta de transferência de 1 mL tem tipicamente ~12 mm de diâmetro e ~10–14 mm de altura.
   2. Coloque a tampa sobre a área designada para a janela de clareira e pressione suavemente contra o material macio do forro.
      NOTA: A tampa é maior que a região limpa, e parte do crânio sob a touca que não é usada para a área limpa pode ser aplicada com selante dental para proteger o crânio da limpeza.
   3. Fixe a tampa no lugar usando material adicional macio ao redor da base, garantindo que a junção entre a tampa e o crânio esteja totalmente vedada.
   4. Use uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 g para perfurar um ou mais pequenos furos na parede da tampa para servir como portas para injeção e retirada de soluções de limpeza.
   5. Deixe o material macio do forro curar completamente. Verifique se a tampa está firmemente presa e que não restam espaços visíveis na interface.
   6. Retire o rato da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma gaiola quente até a recuperação total da anestesia.
      NOTA: Este é um ponto de parada adequado. Realize o procedimento de limpeza do crânio após o cimento dental e o material do revestimento macio terem curado completamente. Em nossa prática, a janela HOTS pode ser instalada à tarde, seguida pela limpeza do crânio na manhã seguinte, quando o camundongo estiver totalmente recuperado da cirurgia. Alternativamente, a limpeza do crânio pode ser iniciada aproximadamente 15 minutos após a instalação da janela HOTS. Durante a instalação da janela HOTS, o crânio permanece estruturalmente intacto, embora o periósteo seja removido.

5. Clareira de crânios em ratos acordados e se comportando livremente

NOTA: Durante a fase de limpeza, o camundongo permanece acordado e se comportando livremente em sua gaiola de casa. Use apenas anestesia breve de isoflurano para injeção de solução e troca através da tampa montada na cabeça.

1. Carregamento inicial da S1
   1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução e induza anestesia breve com 3–4% de isoflurano no ar a uma vazão de 300–500 mL/min até que o camundongo fique imóvel. Não foi aplicada anestesia de manutenção.
   2. Prenda o mouse suavemente e estabilize a tampa fixada na cabeça manualmente.
   3. Use uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G para injetar lentamente aproximadamente 1 mL de S1 na tampa montada na cabeça.
   4. Devolva o rato para uma gaiola de casa e permita que S1 atue sobre o crânio por 2 horas.
      NOTA: Durante a incubação S1 e S2, aloje o camundongo individualmente em uma gaiola padrão.
2. Refrescando a S1
   1. Às 2 horas após o carregamento inicial do S1, anestesie brevemente o rato novamente com isoflurano.
   2. Aspire S1 da tampa usando uma seringa de 1 mL.
   3. Reabasteça a tampa com S1 novo usando uma seringa de 1 mL.
   4. Coloque o rato de volta na gaiola e permita que S1 atue por mais 2 horas.
   5. Repita os passos 5.2.1–5.2.4 em 4 horas após o carregamento inicial para realizar uma segunda substituição do S1.
   6. Após a segunda substituição, permita que S1 continue agindo até que um tempo total de exposição S1 seja atingido de 6 horas.
      NOTA: Este protocolo (1 mL S1 para 6 horas) é otimizado para camundongos com 6 semanas de idade (~20 g). Para animais mais velhos com crânios mais espessos, o tempo de incubação do S1 pode ser gradualmente estendido. Qualquer ajuste deve ser acompanhado de monitoramento próximo do bem-estar animal e da qualidade final das imagens para evitar amolecimento excessivo do crânio.
3. Aplicação do S2
   1. Após 6 horas de tratamento com S1, anestesie brevemente o camundongo com isoflurano.
   2. Aspire S1 da tampa com uma seringa de 1 mL e substitua por 0,7 mL de S2.
   3. Retorne o camundongo à gaiola e permita que S2 atue sobre o crânio por 1 hora para aumentar ainda mais a transparência e proporcionar correspondência do índice de refração.
      NOTA: Nessas condições, a fase combinada de limpeza S1 e S2 normalmente é concluída em até 7 h (6 h S1 + 1 h S2). A limpeza bem-sucedida é indicada por uma superfície do crânio visivelmente transparente, sem sangramento. O crânio pode ficar levemente amolecido após a limpeza; Quando tocado suavemente com pinças finas, deve mostrar leve flexibilidade, mas permanecer estruturalmente intacto. Evite pressão excessiva na superfície do crânio.

6. Preparação de imagem

1. Anestesia e fixação da cabeça para imagem
   1. Ao final da incubação do S2, anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (p/v) a 150–200 μL por 20 g de peso corporal.
   2. Confirme anestesia adequada usando o teste de reflexo de beliscão do dedo do pé.
   3. Conserte a cabeça do mouse rosqueando a placa de titânio em um suporte de cabeça feito sob medida.
   4. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar ressecamento durante a imagem.
   5. Mantenha a temperatura corporal em ~37 °C usando uma bolsa térmica.
2. Expondo a superfície do crânio limpa (Figura 1Be,Bf)
   1. Aspire a solução S2 da tampa usando uma seringa.
   2. Corte cuidadosamente a tampa plástica com tesoura fina e remova-a usando uma pinça, evitando forças excessivas sobre o crânio.
   3. Descole suavemente o material macio do forro que envolve a janela da clareira para expor totalmente a região do crânio limpa.
   4. Aplique uma pequena gota de solução de S2 diretamente sobre o crânio limpo para servir como meio de imersão que corresponde ao índice de refração durante a imagem.
      NOTA: Objetivos padrão de imersão em água foram usados neste estudo, incluindo um objetivo de 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) e um objetivo de 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Ao usar S2 como meio de imersão, ajuste a coleira corretora do objetivo, se disponível, para a configuração apropriada para o índice de refração de S2 para reduzir aberrações esféricas. Nos experimentos aqui, o crânio limpo manteve clareza óptica suficiente para aproximadamente 2 horas de imagem com dois fótons, sem degradação óbvia na qualidade da imagem durante a observação da espinha dendrítica. Após cerca de 2 dias, foi necessário re-clearing para novas imagens, e o tempo de re-clearing foi substancialmente menor que o inicial, permitindo imagens repetidas eficientes pelo mesmo animal.
3. Imagem de cabeça fixa acordada (opcional)
   NOTA: Para imagens acordadas, habitue o rato à fixação da cabeça antes do experimento. Anestesie brevemente o camundongo com isoflurano, depois fixe a placa implantada no suporte por 15–30 minutos por sessão, repetindo isso por 2–3 dias.
   1. Use uma breve anestesia com isoflurano para facilitar o manuseio. Fixe apenas a placa implantada no suporte, permitindo que o corpo se mova livremente na roda ou plataforma.
   2. Siga os passos 6.2.1–6.2.4 para expor a superfície do crânio limpa e aplique S2 antes da imagem de imagem.

7. Recuperação

1. Após a imagem, aspire suavemente e remova qualquer solução residual de S2 da superfície do crânio.
2. Enxágue a região do crânio limpa com soro salino tamponado com fosfato (PBS) várias vezes para promover a restauração gradual do estado opaco nativo do crânio.
3. Seque suavemente o líquido residual do crânio e tecidos ao redor com cotonetes estéreis, evitando danos mecânicos ao osso.
4. Se o animal for mantido vivo para experimentos subsequentes, aplique uma camada do selante biocompatível Kwik-Cast (WPI) sobre a janela do crânio para proteger o osso durante o período de sobrevivência.
5. Deixe a camada protetora curar completamente.
6. Separe o rato do suporte da cabeça e coloque-o em uma gaiola quente. Monitore o animal até que ele se recupere totalmente da anestesia e depois o coloque de volta na gaiola de casa.

Resultados

Seguindo o protocolo, a janela de crânio opticamente transparente montada na cabeça (HOTS) permite a imagem transcraniana profunda de dois fótons em camundongos adultos, preservando a integridade do crânio. Uma preparação bem-sucedida é indicada por dois desfechos principais: (1) a vasculatura cortical torna-se claramente visível através do crânio ao ser limpa (Figura 1Bf), e (2) o crânio limpo apresenta uma leve depressão sob pressão suave,...

Discussão

O método HOTS utiliza uma janela de crânio ópticamente transparente montada na cabeça (HOTS) que combina uma tampa contendo reagentes de limpeza com um procedimento de limpeza do crânio em duas etapas, para aumentar a transparência do crânio em camundongos adultos, preservando a integridade do crânio. Sob o protocolo padrão (6 h em S1 e 1 h em S2 para camundongos de 6 semanas), a janela resultante suportava de forma confiável a imagem transcraniana profunda de dois fótons e permitia visu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL de pipeta descartável	Beijing Biotopped  Ciência   & Tecnologia  Co., Ltd.	N/A
Cimento dentário	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannose	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
Isoflurano	RWD	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Um selante biocompatível
NaOH	Macklin	S832169
Autocura         odontologia          Material macio do forro	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Pentobarbital sódico	Biopike	N/A
Aparelho estereotáxico	RWD	N/A
Seringa descartável estéril	Minank	N/A	1 mL; Agulha 26 G
Sulfolano	Macklin	S817950
Ratos Thy1-GFP-M		N/A	Fornecido  por Prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  ratos	Laboratório Jackson
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
Objetivo de imersão na água	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 objetivo
Objetivo de imersão na água	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0,8 objetivo