Imagem em tempo real sem marcação e análise quantitativa da morfodinâmica de macrófagos usando tomografia por difração óptica

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho baseado em tomografia por difração óptica sem marcadores para imagens em tempo real e análise quantitativa da morfodinâmica dos macrófagos. O método permite o acompanhamento contínuo da morfologia e migração de células individuais, fornecendo medições resolvidas no tempo da área projetada, perímetro e velocidade média de migração durante imagens de células vivas de longo prazo.

Resumo

Este estudo estabelece um fluxo de trabalho baseado em tomografia de difração óptica (ODT) sem marcador para imagem e análise de células vivas, a fim de observar mudanças morfológicas dependentes do tempo em macrófagos. O método permite o registro contínuo da morfologia e do movimento de células únicas por períodos prolongados sob condições ambientais estáveis e possibilita a extração de parâmetros quantitativos, incluindo área projetada, perímetro e velocidade média de migração. Esse fluxo de trabalho oferece uma abordagem prática para capturar comportamentos celulares dinâmicos no nível de célula única sem marcação exógena. Usando macrófagos RAW264.7 como modelo, a imagem em time-lapse foi realizada sob estimulação lipopolissacarídica com pré-tratamento com baicalina para capturar mudanças celulares dinâmicas sob diferentes condições. Células representativas foram selecionadas para rastreamento e análise quantitativa. Os resultados mostram que esse fluxo de trabalho suporta o rastreamento estável e de longo prazo de células únicas e reflete mudanças temporais na morfologia e motilidade celular. Essa abordagem oferece um método sem rótulo para observar comportamentos celulares dinâmicos em resposta a diferentes estímulos e pode servir como um complemento útil aos ensaios convencionais baseados em endpoints. Também pode ser aplicável a outros tipos celulares aderentes para estudos de morfodinâmica celular.

Introdução

Macrófagos desempenham um papel central nas respostas imunes inatas e na homeostase tecidual, e seus estados funcionais podem mudar dinamicamente em resposta a estímulos microambientais. Tradicionalmente, os macrófagos têm sido descritos como adotando fenótipos pró-inflamatórios ou anti-inflamatórios/associados à^{reparação 1,2}. No entanto, evidências crescentes sugerem que a ativação dos macrófagos é um processo contínuo e plástico, e não um estado binário discreto3,4. Sob diferentes estímulos, os macrófagos passam por mudanças graduais ao longo do tempo, acompanhadas por alterações na morfologia celular e no comportamento^{migratório 5}. Portanto, a caracterização resolvida no tempo das mudanças morfológicas e migratórias no nível de célula única fornece uma abordagem importante para estudar respostas celulares dinâmicas.

As abordagens atuais para estudar estados de macrófagos dependem principalmente de imunocoloração, citometria de fluxo e análises transcriptômicas ou^{proteômicas 6}. Esses métodos são tipicamente baseados em amostras fixas ou pontos de tempo discretos, o que limita sua capacidade de acompanhar mudanças contínuas na mesma célula sob condições^{de vida 7}. A imagem de células vivas baseada em fluorescência permite observação dinâmica, mas pode ser afetada por fototoxicidade e fotobranqueamento durante experimentos de longo^{prazo 8,9}. A tomografia por difração óptica (ODT) é uma técnica de imagem sem marcador que reconstrói a distribuição tridimensional do índice de refração das células para fornecer informações estruturais^{quantitativas 10}. Como não requer marcação exógena, a ODT é adequada para imagens de células vivas a longo prazo e reduz a perturbação do comportamento celular. Nos últimos anos, a ODT tem sido aplicada a estudos dinâmicos em vários modelos^{celulares 11}, com estudos anteriores focando principalmente na capacidade de imagem e caracterização estrutural. Em contraste, o presente estudo estabelece um fluxo de trabalho padronizado e sem rótulo para análise de longa duração e resolução temporal de morfodinâmica de macrófagos sob uma condição definida de estimulação in vitro.

O fluxo de trabalho é demonstrado usando um modelo de macrófagos in vitro RAW264.7 com estimulação de lipopolissacarídeos (LPS) e pré-tratamento com Baicalina (BAI). O BAI foi usado como um modulador experimental representativo para estabelecer uma condição definida para demonstrar o fluxo de trabalho. A imagem contínua permite a extração de parâmetros quantitativos de célula única, incluindo área projetada, perímetro e velocidade média de migração, possibilitando caracterização resolvida no tempo de mudanças morfológicas e comportamentais. Essa abordagem tem como objetivo fornecer uma análise descritiva das mudanças fenotípicas dinâmicas, em vez de definir estados funcionais ou polarização, e pode servir como um método complementar aos ensaios baseados em endpoints, fornecendo informações temporais. O fluxo de trabalho é validado neste sistema modelo e pode ser potencialmente aplicável a outros tipos de células aderentes.

Protocolo

1. Cultura de macrófagos

ATENÇÃO: Realize todos os procedimentos em um armário de biossegurança usando luvas de laboratório e jaleco.

1. Prepare meio de cultura completo (meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicemia, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina–estreptomicina).
2. Descongele um frasco de células de macrófagos RAW264,7 em um banho-maria a 37 °C por menos de 1 minuto.
3. Transfira a suspensão celular para DMEM de alta glicemia suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
4. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos.
5. Descarte o supernadante.
6. Ressuspenda as células em um meio novo e completo.
7. As células de sementes em panelas de 60 mm em 2–5 × 10^{células de 5} por prato.
8. Incubar células a 37 °C com 5% de CO₂.
9. Não mude o meio em 12–24 horas após o descongelamento.
10. Substitua o médio a cada 2–3 dias.
11. Monitore a morfologia celular usando um microscópio invertido.
12. Células de passagem em 80–90% de confluência por pipeteamento suave.
    NOTA: Evite usar tripsina. Use as células nas passagens 6–18. Selecione células com morfologia uniforme e sem vacuolização para experimentos. A linha celular foi autenticada por perfil STR e submetida a testes de controle de qualidade. Relatórios detalhados e um resumo em inglês são fornecidos nos Arquivos Suplementares.

2. Tratamento celular

1. Colete células na fase de crescimento logarítmico por pipeteamento suave.
2. Resuspenda células em meio completo.
3. Meça a densidade celular usando um contador de células.
4. Ajuste a densidade celular para 4 × 10⁴ células/mL.
5. Seme 2 mL de suspensão celular em cada recipiente de 35 mm.
6. Distribua antenas para dois grupos: (i) grupo LPS, (ii) grupo BAI + LPS.
7. Incubar células a 37 °C com 5% de CO₂ por 12–16 horas.
8. Prepare uma solução de estoque BAI de 50 mM em DMSO. Armazene a solução de estoque BAI a −20 °C.
9. Adicione o BAI ao grupo BAI + LPS a uma concentração final de 100 μM. Dilua a solução de stock do BAI diretamente em meio de cultivo para alcançar a concentração final de trabalho.
10. Adicione um volume igual de DMSO ao grupo LPS.
11. Prepare solução de estoque LPS (1 mg/mL) em meio completo.
12. Adicione LPS a ambos os grupos até uma concentração final de 1 μg/mL. Dilua a solução de estoque LPS diretamente no meio de cultura para alcançar a concentração final de trabalho.
13. Proceda imediatamente à imagem e não mude o meio durante a imagem.

3. Aquisição por tomografia por difração óptica

1. Ligue o sistema de imagem ODT e inicie o módulo de controle ambiental.
2. Ajuste a temperatura do palco para 37 °C.
3. Defina a concentração de CO₂ para 5%.
4. Deixe o sistema se equilibrar por pelo menos 20 minutos.
5. Abra o software de aquisição.
6. Coloque o prato de cultura na etapa de imagem.
7. Use um objetivo 60x (NA = 1,42) para localizar células.
8. Selecione células isoladas com limites claros para a imagem.
9. Defina o intervalo de imagem para 8 minutos.
10. Defina o número total de quadros para 181.
11. Ative a função de autofoco para manter o foco durante a imagem em time-lapse.
12. Comece a aquisição em time-lapse.
13. Monitore a estabilidade do sistema durante a aquisição.
    NOTA: A estabilização do autofoco foi aplicada durante todo o experimento para minimizar o desvio focal.

4. Reconstrução de imagens e análise quantitativa

1. Após a aquisição da imagem, o software realiza automaticamente a reconstrução da imagem.
2. Usando o algoritmo padrão embutido.
3. Espere até que a barra de progresso esteja completa.
4. Abra o software de análise (Intellyseg, v2.1.0).
5. Importe o conjunto de dados brutos selecionando Importar Dados Brutos.
6. Navegando até a pasta de destino.
7. Escolha o arquivo de destino e importe o conjunto de dados.
8. Clique em "Célula" para realizar segmentação automática usando configurações consistentes entre os conjuntos^{de dados 13}.
9. Selecione as células com base nos seguintes critérios: (i) sem sobreposição com células vizinhas, (ii) sem contato com os limites da imagem, (iii) continuamente rastreável ao longo da série temporal.
10. Selecione um número fixo de células (n = 8) por campo de visão para uma análise consistente entre conjuntos de dados.
11. Abra o módulo "Rastreamento de Longo Prazo".
12. Insira o quadro inicial e o quadro final.
13. Clique em "Track" para iniciar o rastreamento, que é baseado na consistência da posição da célula entre quadros^{consecutivos 14}.
14. Corrija manualmente erros de rastreamento se necessário para garantir a continuidade da trajetória: (i) Clique com o botão direito nas máscaras incorretas e selecione "Excluir Item", (ii) Abra "Segmentação Manual", (iii) Selecione "Célula" e clique em "Adicionar", (iv) Use "Clique" ou "Caixa" para adicionar máscaras corretas.
15. Clique em "Exportar" e depois selecione "Exportar Dados".
16. Selecione "Exportar Vídeo" e escolha os elementos de saída.
17. Insira os quadros de início e fim.
18. Selecione o caminho de salvamento e o formato do arquivo.
19. Clique em "OK" para exportar o vídeo.
20. Clique em "Exportar" e selecione "Sistema de Gráficos".
21. Selecione "Track Chart".
22. Escolha "Célula" como categoria de segmentação.
23. Entra na faixa de quadros de rastreamento.
24. Selecione parâmetros de saída (por exemplo, Área, Perímetro).
25. Clique em "Exportar Imagem ou Excel" e salve o arquivo.
26. Calcule a velocidade média de migração (μm/h) para cada célula com base no deslocamento do centroide ao longo de toda a série temporal.

5. Apresentação dos dados

1. As medições quantitativas são apresentadas de forma descritiva. Nenhuma inferência estatística foi realizada. Cada grupo de tratamento incluiu cinco amostras independentes.
   Uma visão geral do fluxo de trabalho experimental é mostrada na Figura 1. Reagentes-chave, instrumentos e softwares estão listados na Tabela de Materiais. As condições de imagem são resumidas na Tabela 1.

Resultados

Para avaliar o desempenho do fluxo de trabalho baseado em ODT, foram realizadas imagens em time-lapse para dois grupos de tratamento (LPS e BAI + LPS), com cinco amostras independentes por grupo. Todas as amostras foram coletadas sob condições idênticas de imagem. Devido à alta carga de trabalho associada ao rastreamento de célula única de longo prazo e à análise quantitativa, uma amostra representativa de cada grupo foi selecionada para análise e visualização de célula única. Os resultados são apresentados de forma desc...

Discussão

Este estudo estabelece um fluxo de trabalho baseado em ODT sem marcadores para imagem contínua e análise quantitativa da morfodinâmica dos macrófagos no nível de célula única. A abordagem permite a medição resolvida no tempo da área projetada, do perímetro e da velocidade média de migração durante imagens de células vivas de longo prazo. A densidade de semeadura de células é um fator-chave que afeta o desempenho da segmentação e do acompanhamento. Alta densidade resulta em células sobrep...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	Usado para imagem de células vivas sem rotulagem
Software de aquisição	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	Usado para aquisição de imagens
Software de análise	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	Usado para reconstrução, segmentação e rastreamento de imagens
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	Linha celular de macrófagos murinos usada para experimentos de polarização e imagem in vitro.
Baicalina (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	Usado para pré-tratamento celular
Lipopolissacarídeo (LPS)	Solarbio	L8880	Usado para estimular macrófagos
Meio DMEM	Gibco	C11995500BT	Meio de cultura celular
Soro bovino fetal	Procell	164210	Suplemento para cultura celular
Penicilina–Estreptomicina (100x)	Procell	PB180120	Antibióticos para cultura celular
Prato de cultura de 60 mm	Corning	CLS430166	Usado para cultura celular
Prato de fundo de vidro de 35 mm	Cellvis	D35-10-1.5-N	Usado para imagem ODT
Microscópio invertido	OLYMPUS	CKX53	Usado para observação e monitoramento rotineiros de células durante a cultura.
Contador de células	RWD Life Science	C100	Usado para determinação da densidade celular