Transferência mitocondrial exógena em adipócitos marrons diferenciadores e preadipócitos deficientes em AGPAT2

Resumo

Mitocôndrias exógenas de origem humana e murinha podem ser internalizadas diferenciando preadipócitos e acompanhadas ao longo da diferenciação adipogênica usando ferramentas de imagem e genéticas. Embora essas mitocôndrias interajam fisicamente com a rede mitocondrial endógena, elas não aumentam a expressão dos marcadores associados aos adipócitos marrons maduros.

Resumo

Mitocôndrias são hubs de sinalização-chave; No entanto, se a expansão de massa mitocondrial é mecanicamente necessária para diferenciação permanece uma questão em aberto. O AGPAT2 catalisa a conversão do ácido lisofosfatídico em ácido fosfatídico, e sua deficiência leva à deficiência do tecido adiposo e à adipogênese comprometida associada à redução da massa mitocondrial. O impacto da expansão da massa mitocondrial na adipogênese foi avaliado transferindo mitocôndrias exógenas para adipócitos marrons diferenciadores. Também foi investigada se a transferência mitocondrial poderia resgatar a adipogênese comprometida das células deficientes em AGPAT2. Mitocôndrias humanas e murinas foram transferidas com sucesso e incorporadas à rede mitocondrial endógena de preadipócitos de camundongos diferenciados, persistindo durante toda a adipogênese marrom. A diferenciação adipogênica foi necessária para a retenção das mitocôndrias transferidas. A transferência mitocondrial não modificou a expressão de marcadores moleculares dos adipócitos marrons maduros nem do conteúdo de gotículas lipídicas, embora tenha afetado a distribuição relativa do tamanho das gotículas de forma dependente da espécie. Nos pré-adipócitos ^Agpat2-/- , a transferência mitocondrial não conseguiu resgatar a adipogênese, indicando que a expansão da massa mitocondrial sozinha é insuficiente para reverter os mecanismos que levam à lipodistrofia neste modelo. Esses resultados indicam que, embora as mitocôndrias humanas e murinas exógenas possam ser incorporadas à rede mitocondrial de adipócitos diferenciados, elas não influenciam diretamente o programa adipogênico.

Introdução

Além de seus papéis bioenergéticos primários, as mitocôndrias servem como centros de sinalização em múltiplos processos celulares, incluindo a diferenciação^celular 1,2,3,4. O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma massa mitocondrial notavelmente alta para apoiar sua atividade termogênica, destacando seu papel no balanço energético do corpo inteiro e na patogênese da^{obesidade 5}. Embora a massa mitocondrial seja regulada pelo equilíbrio entre biogênese e mitofagia, permanece incerto se a expansão da massa mitocondrial durante a diferenciação de adipócitos marrons é funcionalmente necessária para a adipogênese ou apenas uma consequência do processo.

A transferência fisiológica mitocondrial entre células foi documentada tanto in vitro quanto in vivo, contribuindo para a adaptação dos tecidos sob condições patológicas, incluindo disfunção do tecido adiposo associada à obesidade e resistência à^{insulina 6,7}. Além disso, a transferência mitocondrial artificial in vitro demonstrou aumentar a capacidade respiratória das células^{receptoras 8}. Juntos, esses achados apoiam o conceito de que a transferência mitocondrial pode modificar a função metabólica celular e pode contribuir para a adaptação dos tecidos sob condições de estresse^{bioenergético 9,10,11}. Comparado a estratégias farmacológicas ou genéticas que estimulam a biogênese mitocondrial endógena ativando programas transcricionais nucleares e mitocondriais, a transferência mitocondrial entrega diretamente organelas às células receptoras, permitindo a rápida modificação da massa mitocondrial independentemente das manipulações^{transcricionais 12,13}. Essa abordagem é fundamental para corrigir defeitos em doenças mitocondriais, mas também permite estudar as ações mitocondriais sem os potenciais efeitos fora do alvo das abordagens farmacológicas ou^{genéticas 14}.

No presente estudo, investigamos o efeito do aumento artificial da massa mitocondrial por transferência mitocondrial exógena na diferenciação de adipócitos marrons. Essa abordagem permitiu a avaliação direta do impacto da massa mitocondrial no programa adipogênico. Para isso, protocolos de transferência mitocondrial originalmente desenvolvidos para células-tronco mesenquimatosas foram adaptados¹⁵ usando tanto células hepáticas humanas quanto preadipócitos murinos como doadores mitocondriais. Um método para rastrear mitocôndrias humanas em células de camundongos diferenciadas foi desenvolvido usando ferramentas genéticas combinadas com técnicas de imagem, demonstrando que mitocôndrias de ambas as origens são incorporadas à rede mitocondrial endógena e persistem durante toda a diferenciação adipogênica.

Para modelar adipogênese defeituosa associada a baixa massa mitocondrial, foram usados adipócitos marrons diferenciados derivados de camundongos deficientes em 1-acilglicerol-3-fosfato-O-aciltransferase 2 (AGPAT2) (AGPAT2^-/-). AGPAT2 é altamente expresso no tecido adiposo, onde catalisa a formação de ácido fosfatídico na via de biossíntese dos glicerolípidos. A deficiência de AGPAT2 causa lipodistrofia severa tanto em humanos quanto em camundongos e prejudica a adipogênese em modelos de adipócitos brancos e marrons em associação com a redução da massa mitocondrial 16,17,18. A incorporação de mitocôndrias exógenas em preadipócitos diferenciados alterou ligeiramente a distribuição do tamanho das gotículas lipídicas, mas não aumentou a expressão dos marcadores adipócitos marrons maduros nem resgatou o comprometimento adipogênico dos preadipócitos Agpat2^-/-.

Protocolo

Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Pontifícia Universidad Católica do Chile, protocolo 210609003. Camundongos do tipo selvagem e Agpat2^-/- P0.5 de ambos os sexos, derivados de um fundo genético misto C57BL/6J e 129J, foram usados neste estudo. Equipamento de Proteção Individual (EPI): Use jaleco, óculos de proteção e luvas de nitrilo. Veja o Arquivo Suplementar 1 para detalhes adicionais do protocolo e a Tabela 1 para os buffers necessários para este protocolo.

Todos os resíduos químicos tóxicos gerados durante a preparação por microscopia eletrônica, fixação de paraformaldeído e extração de ácidos nucleicos devem ser estritamente segregados em fluxos designados e claramente rotulados, em conformidade com as regulamentações institucionais de Saúde e Segurança Ambiental (EHS). Em nenhuma circunstância esses reagentes devem ser despejados na pia do laboratório ou no sistema público de esgoto. Todos os resíduos químicos perigosos gerados devem ser segregados de acordo com as classificações institucionais do EHS.

1. Cultura celular

1. Isolamento, diferenciação e manutenção dos adipócitos primários (iBAT)
   NOTA: Veja o Arquivo Suplementar 1 para uma breve descrição dos procedimentos e a Tabela 1 para a composição das soluções necessárias. Uma explicação completa e detalhada do nosso protocolo de diferenciação adipogênica marrom in vitro pode ser encontrada em Figueroa et ^al.19.
   1. Isolar os preadipócitos do tecido adiposo marrom interescapular (iBAT) de camundongos neonatais (P0,5) após os procedimentos cirúrgicos e enzimáticos de digestão descritos por Figueroa et ^al.19.
   2. Diferencie e mantenha a cultura de adipócitos marrons de acordo com o coquetel de diferenciação e o cronograma de troca de mídia.
      NOTA: Para uma diferenciação adipogênica bem-sucedida, é fundamental que as culturas atinjam 90–100% de confluência antes de iniciar a indução adipogênica.
2. Cultura HepG2
   1. Cultive células de HepG2 em DMEM suplementadas com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 0,25 μg/mL de anfotericina B. Mantenha as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
      NOTA: Essas células crescem em aglomerados e podem parecer subconfluentes apesar da alta densidade devido ao crescimento em múltiplas camadas.

2. Isolamento e transferência mitocondrial

1. Isolamento mitocondrial
   NOTA: Realize todas as etapas em um gabinete de biossegurança a 4 °C ou no gelo. Use a preparação em até 2 horas.
   1. Sementes 2 × 10⁶ células doadoras (HepG2 ou preadipócitos) em placas de cultura de 100 mm. Cultive células até atingirem 80% (HepG2) ou 100% (preadipócitos) de confluência.
   2. Manchar células doadoras com MitoTracker Deep Red FM de 100 nM em meio livre de FBS por 30 minutos a 37 °C em uma incubadora de 5% de_CO-2 .
   3. Lave as células duas vezes com meio de crescimento para remover o excesso de corante.
   4. Desprenda as células usando tripsina, colete a suspensão e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
   5. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial (MIB) suplementado com BSA, inibidores de protease e inibidores de fosfatase. Desfaça a membrana plasmática passando a suspensão por uma seringa de tuberculina 5 vezes. Homogeneize a suspensão passando-a por uma seringa de insulina pelo menos 10 vezes até que a solução fique marrom-clara e não tenha aglomerados visíveis.
      NOTA: Para análise western blot, aliquota 50 μL do lisado total e armazene a -20 °C.
2. Centrifuge o homogeneado a 900 × g por 11 minutos a 4 °C.
   NOTA: Se o sobrenadante após o spin de 900 × g não estiver turvo, a lise celular provavelmente está incompleta.
   1. Colete o sobrenadante e centrifuge a 10.000 × g por 10 minutos a 4 °C para pelletar as mitocôndrias. Lave a pastilha mitocondrial 3 vezes com MIB suplementado com BSA.
   2. Realize uma resuspensão final em 100 μL de MIB livre de BSA. Quantifique a concentração de proteínas usando um ensaio de proteína BCA.
3. Ensaio de transferência mitocondrial (MTA) em pré-adipócitos
   1. Preadipócitos receptores da semente em 5 × 10^{células de 5} poços em placas de 12 poços (com coverslips de 18 mm para microscopia) 24 horas antes do ensaio.
   2. Adicione mitocôndrias doadoras isoladas diretamente ao meio receptor na proporção de 10 μg de proteína mitocondrial por 10⁵ células. Balance as placas suavemente para distribuir as mitocôndrias. Incubar as células por 24–120 horas (correspondentes aos dias 1, 3 e 5 de diferenciação) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ antes da análise.

3. Consumo mitocondrial de oxigênio e eficiência da MTA

1. Respirometria mitocondrial
   1. Ajuste o banho-maria circulante externo para 25 °C e assegure equilíbrio térmico estável na camisa da câmara antes de iniciar qualquer medição.
   2. Realize uma calibração de fase líquida em dois pontos usando o software de aquisição do instrumento.
      1. Calibração de saturação de ar (High Point): Adicione 500 μL de água desmineralizada saturada em ar à câmara. Ajuste o agitador magnético para 60 rpm e registre o sinal até que ele se estabilize em um platô (>1.500 mV).
      2. Calibração sem oxigênio (Ponto Baixo): Adicione uma pequena quantidade (~3 mm de diâmetro) de sulfito de sódio à câmara para deslocar qualquer ar restante. Grave até que o sinal caia para um platô de base estável (~1% do sinal basal, ~20 mV).
   3. Iniciar gravação em tempo real (tempo total de execução: ~10 min).
   4. Grave por 3 minutos até que uma leitura linear estável seja alcançada.
   5. Resuspenda mitocôndrias isoladas em 200 μL de tampão de ensaio mitocondrial (MAS⁾²⁰ suplementado com 5 mM de glutamato e 2,5 mM de malato.
      NOTA: Para o presente trabalho, o pellet de mitocôndrias totais foi extraído de duas placas celulares de 100 mm.
   6. Transfira a suspensão para a câmara de oxigrama e feche firmemente o êmbolo de vedação da câmara, garantindo que não restem bolhas de ar.
   7. Registre o consumo de oxigênio por 3 minutos.
   8. Adicione 150 μM de ADP para desencadear a respiração acoplada mitocondrial e meça a respiração acoplada à síntese de ATP por 3 minutos.
   9. Defina manualmente os segmentos estáveis e lineares correspondentes a cada fase respiratória. Extraia os valores automáticos de inclinação calculados pelo software, expressos como taxas de consumo de oxigênio em nmol∙^mL-1∙^min-1.
      NOTA: Para a limpeza entre câmaras de placas, enxágue a câmara 2 vezes com 1 mL de água desmineralizada e certifique-se de que o interior esteja completamente seco. Adicione 100 μL de PBS à câmara antes de prosseguir para a próxima placa.
2. Citometria de fluxo
   NOTA: Mantenha todas as amostras no gelo durante todo o procedimento para preservar a integridade celular e bioenergética.
   1. Isolar as mitocôndrias e realizar o ensaio de transferência mitocondrial (MTA), conforme descrito nas Seções 2.1 e 2.2, respectivamente, em placas de cultura de 35 mm, usando células doadoras previamente marcadas com MitoTracker Deep Red FM.
   2. Aspire o meio de cultura e lave a monocamada celular uma vez com 1 mL de PBS estéril.
   3. Adicione 500 μL de 0,25% de Tripsina-EDTA e incube os pratos a 37 °C até que o descolamento completo da célula seja observado ao microscópio.
   4. Neutralize a tripsina adicionando 1 mL de meio de crescimento completo (DMEM com 10% de FBS). Transfira todo o volume para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
   5. Descarte o sobrenadante por aspiração e retenha a célula. Resuspenda o pellet em 500 μL de PBS gelado por pipeteamento suave.
   6. Analise as amostras usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de 640 nm (veja o Arquivo Suplementar 1 para detalhes sobre aquisição e análise de citometria de fluxo).
      1. Defina a população celular usando gráficos de Dispersão Direta (FSC) vs. Dispersão Lateral (SSC) e aplique uma estratégia de gate para excluir detritos e doublets celulares.
      2. Quantifique a intensidade de fluorescência no canal vermelho distante (filtro de emissão de 670/30 nm) para detectar mitocôndrias internalizadas marcadas com MitoTracker.
      3. Realize a análise usando Floreada.io (veja Arquivo Suplementar 1 para detalhes do protocolo de gate).
         NOTA: Inclua um controle negativo (células receptoras sem MTA) para definir a linha de base para a autofluorescência de fundo.
3. Microscopia confocal e eletrônica
   1. Ensaio de imagem com células vivas
      1. Semente preadipócitos primários derivados de camundongos neonatais P0.5 em placas de 12 poços contendo coverslips de 18 mm, seguindo os requisitos específicos de densidade celular e meio detalhados na Seção 1.
      2. Isolar as mitocôndrias e executar o ensaio de transferência mitocondrial (MTA) usando células doadoras previamente marcadas com MitoTracker Deep Red FM, conforme especificado na Seção 2.
      3. Mantenha as culturas receptoras em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas para permitir a absorção mitocondrial.
      4. Prepare uma solução de trabalho MitoTracker Green de 70 nM diluindo o estoque em meio de cultura livre de FBS.
      5. Aspire o meio de crescimento das placas de 12 poços e substitua pela solução MitoTracker Green de 70 nM. Incube as placas por 25 minutos a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO2 para contra-tingir toda a rede mitocondrial.
      6. Remova a solução de mancha e lave as mantas 2x com 1 mL de meio de cultivo morno e completo.
      7. Substitua o volume final por meio completo sem fenol vermelho para minimizar a autofluorescência de fundo durante a aquisição.
      8. Transfira as coberturas ou a placa para o estágio do microscópio confocal. Ajuste a câmara de incubação do microscópio para manter um ambiente constante de 37 °C e 5% de_CO2.
      9. Capture imagens imediatamente usando configurações apropriadas de excitação/emissão tanto para o vermelho distante (MitoTracker Deep Red FM) quanto para o verde (MitoTracker Green). Veja o Arquivo Suplementar 1 para mais detalhes.
         NOTA: Realize todas as etapas de coloração e manuseio em condições de pouca luz para evitar o fotodescolorimento dos fluoróforos. Use um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) (60x ou 100x) para resolução ótima da morfologia mitocondrial.
   2. Ensaio de imunofluorescência confocal com células fixas
      NOTA: Após a fixação celular, soluções tóxicas de paraformaldeído e glutaraldeído são classificadas como orgânicos não halogenados. Subprodutos de extração de ácidos nucleicos exigem segregação rigorosa: misturas de fenol/clorofórmio devem ser descartadas como orgânicos halogenados, enquanto tampões à base de guanidinium são classificados como orgânicos corrosivos.
      1. Preadipócitos primários de sementes derivados de camundongos neonatais P0,5 em placas de 12 poços contendo coverslips de 12 mm, conforme descrito na Seção 1.
      2. Isolar as mitocôndrias e realizar o ensaio de transferência mitocondrial (MTA) seguindo os procedimentos especificados na Seção 2.
      3. Incube as culturas por 24 horas para permitir a absorção mitocondrial.
      4. Induza a diferenciação adipogênica marrom seguindo o protocolo descrito no Arquivo Suplementar 1 e consulte a Tabela 1 para a composição dos buffers necessários.
      5. Fixe as células no dia 7 de diferenciação (168 h). Aspire o meio de cultura e adicione 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por poço. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
      6. Lave as coberturas 2 vezes adicionando 1 mL de PBS gelado por poço. Permeabiliza e bloqueia as células incubando os coverslips em PBS contendo 0,05% de saponina e 0,2% de BSA por 1 hora em temperatura ambiente. Coloque a placa sobre um agitador orbital sob agitação suave.
      7. Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS. Tinga os núcleos e as gotículas lipídicas simultaneamente. Aplique 1 μg/mL de Hoechst 33342 e 1 μg/mL de BODIPY preparado no tampão de bloqueio/permeabilização. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente, garantindo que a placa esteja protegida da luz.
      8. Lave as mantas 2x com 1 mL de PBS gelado. Monte os slips de cobertura em slides de vidro limpos. Dispense 10 μL de suporte de montagem no ferrolho e coloque o revestimento com o lado da célula para baixo sobre o meio de montagem. Deixe as amostras secarem durante a noite em um ambiente escuro, em temperatura ambiente, antes da imagem.
      9. Adquira imagens usando um microscópio confocal. Use dois canais de fluorescência calibrados para os espectros de emissão de Hoechst e BODIPY. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para detalhes adicionais de imagem.
      10. Realize análise de gotículas lipídicas usando o ImageJ v1.54s. Abra o canal de gotículas lipídicas, identifique gotas individuais manualmente usando as ferramentas de seleção à mão livre e ROI Manager, e calcule a área da gota usando o Analisar | Mese comando.
      11. Processe e analise os dados resultantes usando os scripts R fornecidos no Arquivo Suplementar 2 dentro do ambiente RStudio v4.5.2.
          NOTA: Adquira exatamente cinco imagens por capa com ampliação de 10x para garantir uma amostragem representativa. Use a versão R 4.5.2 ou superior para compatibilidade com os scripts fornecidos.
   3. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
      NOTA: Para subprodutos da microscopia eletrônica, tampões altamente tóxicos de tetróxido de ósmio e cacodinato de sódio contendo arsênico devem ser coletados como resíduos tóxicos de metais pesados, enquanto o acetato de uranila é gerenciado separadamente como resíduos radioativos de metais pesados sob protocolos institucionais de segurança radiológica.
      1. Centrifuge as mitocôndrias isoladas, da Seção 2, a 10.000 × g por 10 minutos a 4 °C para obter um pellet compacto.
      2. Fixe o pellet adicionando 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M de cacodilato de sódio (pH 7,0). Incube por 2 horas a 4 °C.
         NOTA: Sempre manuseie soluções de estoque de glutaraldeído e realize as etapas iniciais de fixação dentro de uma exaustor químico. Use luvas e óculos de nitrilo para proteção ocular. Evite qualquer contato com fontes de calor, pois o glutaraldeído aquecido libera vapores altamente irritantes.
      3. Lave a preparação mitocondrial por 3 × 10 minutos com tampão de cacodilato de sódio de 0,05 M, e centrifuge brevemente para reter o pellet entre as trocas de tampão.
      4. Fixe a amostra adicionando tetróxido de ósmio aquoso a 1% (_{OsO 4}). Incube por 15 minutos em temperatura ambiente.
         NOTA: O tetróxido de ósmio deve ser aberto e manuseado apenas dentro de uma exaustão química certificada e totalmente funcional. Use jaleco, óculos de proteção ou uma viseira facial completa, e luvas grossas ou duplas de nitrilo (troque imediatamente se houver qualquer respingo, pois o_{OsO 4} pode penetrar o nitrilo fino com o tempo).
      5. Lave a amostra por 3 × 5 minutos com água duplamente destilada. Tinga o pellet com acetato de uranila aquosa a 1% por 15 minutos.
         NOTA: Trabalhe em papel de bancada descartável com respaldo plástico. Dedique uma área específica do laboratório para coloração radioativa. Use luvas duplas, jaleco e óculos de segurança. Lave as mãos cuidadosamente após concluir o procedimento.
      6. Desidrate a preparação usando uma série de etanol graduado. Incube o pellet em 30%, 50%, 70%, 95% e 100% de etanol por 5 minutos em cada concentração.
      7. Embutida as frações mitocondriais. Incube em uma solução 1:1 de Epon/etanol por 30 minutos, seguido de resina pura de Epon por 1 hora.
      8. Transfira as amostras para moldes de embutição e polimerize em um forno a 60 °C por 48 horas.
      9. Prenda os blocos de resina ao ultramicrotomo e corte seções ultrafinas (80 nm).
      10. Colete seções em grades. Tinga as grades com acetato de uranil aquoso a 1% por 4 minutos. Enxágue com água duplamente destilada.
      11. Tinga com citrato de chumbo por 5 minutos seguindo o método²¹ de Reynolds. Enxágue bem. Visualize as grades usando o TEM. Veja o Arquivo Suplementar 1 para detalhes sobre o método de Reynolds e a aquisição de imagens TEM.

4. Quantificação molecular

1. Curva padrão do DNA mitocondrial (mtDNA)
   1. Sementes as células de HepG2 em cinco placas de cultura de 100 mm. Incube as culturas até que atinjam 80% da confluência.
   2. Isole as mitocôndrias das células colhidas seguindo o procedimento técnico detalhado na Seção 2.
   3. Extraia o DNA total do pellet mitocondrial resultante usando o método ácido-guanidinium-fenol-clorofórmio conforme descrito na Seção 4.2.6. Meça a concentração de DNA e avalie a pureza ((razões A₂₆₀/A₂₈₀ e (A₂₆₀/A₂₃₀ )) usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume.
   4. Prepare uma série de diluição serial usando água sem nuclease como diluente. Dilua o estoque de DNA para obter quantidades finais de 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 e ^10-5 ng por volume de reação. Faça vórtices em cada diluição por 5 segundos para garantir a homogeneidade completa antes de prosseguir para a próxima etapa da série.
      NOTA: Ajuste a faixa de concentração da curva padrão com base na concentração específica da amostra e no volume final da reação da PCR.
2. Detecção de mtDNA humano em células receptoras
   1. Semente preadipócitos primários derivados de camundongos neonatais P0,5 em recipientes de cultura de 60 mm, seguindo as condições de densidade e meio especificadas na Seção 1.
   2. Isolar as mitocôndrias de células de HepG2 doadas e executar o ensaio de transferência mitocondrial (MTA) conforme detalhado na Seção 2.
   3. Incubar as culturas por 24 horas a 37 °C e 5% de CO₂.
   4. Induza diferenciação adipogênica marrom por 24–120 horas (nos dias 1, 3 e 5) seguindo o protocolo de troca de meios descrito na Seção 1.
   5. Aspire o meio de cultura e lave as células duas vezes com 2 mL de PBS gelado.
   6. Extraia o DNA total usando o método ácido-guanidinium-fenol-clorofórmio²².
      NOTA: Sempre aliquota e realize separação de fases dentro da exaustão para evitar inalar vapores tóxicos de fenol. Use luvas duplas de nitrilo ou luvas resistentes a produtos químicos de alta resistência.
   7. Realize a separação de fases e descarte toda a fase aquosa localizada acima da interfase.
      PASSO CRÍTICO: Remover completamente a fase aquosa para evitar contaminação e garantir alta pureza do DNA para qPCR a jusante.
   8. Adicione 0,3 mL de etanol 100% por 1 mL do reagente de extração inicial. Tampe o tubo e misture vigorosamente por inversão.
   9. Deixe descansar por 3 minutos em temperatura ambiente e centrifuge a 2.000 × g por 5 minutos a 4 °C para fazer pellets no DNA.
   10. Transfira o supernadante fenol-etanol para um tubo separado para possível isolamento de proteínas. Ressuspenda o pellet de DNA em 1 mL de citrato de sódio 0,1 M (em 10% etanol, pH 8,5) por 1 mL de reagente de extração utilizado.
   11. Deixe descansar por 30 minutos em temperatura ambiente, invertendo suavemente algumas vezes, e centrifuge a 2.000 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
   12. Repita as etapas da lavagem de citrato de sódio mais duas vezes.
   13. Lave o pellet resultante com 2 mL de etanol a 75% por cada 1 mL de reagente de extração inicial.
   14. Deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente e centrifuge a 2.000 × g por 5 minutos a 4 °C.
   15. Descarte o sobrenadante e deixe secar o pellet ao ar por 10 minutos. Solubilize o DNA adicionando 0,3–0,6 mL de NaOH de 8 mM e pipetando repetidamente para cima e para baixo até que a bola desapareça.
   16. Centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C para remover qualquer detrito insolúvel. Transfira o sobrenadante para um tubo estéril e ajuste o pH para 7–8 usando HEPES.
   17. Meça a concentração e pureza do DNA ((A(260)/A(280) e (A(260)/A(230)) usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume.
   18. Dilua o molde até uma quantidade final de 15 ng de DNA total em água sem nuclease. Realize PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para mtDNA humano usando placas ópticas de 96 poços, conforme especificado na Seção 4.3.
   19. Analise os resultados da amplificação aplicando um modelo de regressão logarítmica.
       NOTA: Realize a análise de regressão logarítmica usando a concentração de DNA e os valores correspondentes do ciclo limiar (Ct) como variáveis.
3. RT-qPCR para expressão gênica
   1. Preparação e diferenciação celular
      1. Preadipócitos primários de sementes derivados de camundongos neonatais P0,5 em placas de cultura de 60 mm, conforme detalhado na Seção 1.1.
      2. Isolar as mitocôndrias e realizar o ensaio de transferência mitocondrial (MTA) seguindo os procedimentos da Seção 2. Incube as culturas por 24 horas.
      3. Induza adipogênese marrom por 24–120 horas (amostragem nos dias 1, 3 e 5 de diferenciação) conforme o protocolo da Seção 1.
   2. Isolamento total de RNA
      1. Remova o meio de cultura e adicione 1 mL de reagente extrator de ácido-guanidinium-fenol-clorofórmio por 1 × 10⁶ células diretamente ao prato. Homogeneize as amostras pipeteando repetidamente até que o lisado fique uniforme.
         NOTA: Sempre aliquota e realize separação de fases dentro da exaustão para evitar inalar vapores tóxicos de fenol. Use luvas duplas de nitrilo ou luvas resistentes a produtos químicos de alta resistência.
      2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio por cada 1 mL de reagente extrator utilizado. Tampe os tubos com firmeza e agite vigorosamente com a mão por 15 segundos. Deixe descansar por 3 minutos em temperatura ambiente e centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
      3. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo livre de nuclease. Evite contato com a interfase. Mantenha as amostras no gelo.
      4. Adicione 0,5 mL de isopropanol por cada 1 mL de reagente extrator utilizado. Misture suavemente por inversão e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
      5. Centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C para pelletar o RNA. Descarte o sobrenadante por inversão.
      6. Lave o pellet de RNA com 1 mL de etanol 75%. Faça um vórtice breve e centrifuge a 7.500 × g por 5 minutos a 4 °C.
      7. Descarte o sobrenadante e seque ao ar o pellet de RNA por 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em 30 μL de água livre de nuclease. Incube as amostras a 60 °C por 15 minutos para garantir a solubilização completa.
      8. Determine a concentração e pureza do RNA (razões A₂₆₀/_{A 280} ) usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume.
      9. Verifique a integridade do RNA via eletroforese em gel de agarosa.
   3. Tratamento com DNase
      1. Adicione 0,1 volume de 10× de tampão de DNase e 1 μL de enzima DNase a cada amostra de RNA. Misture suavemente pipetando. Incube as reações a 37 °C por 30 minutos.
      2. Ressuspenda o Reagente de Inativação da DNase por meio de um flick ou vortexing até que a polpa fique homogênea. Adicione o Reagente de Inativação (0,1 volume da amostra de RNA ou 2 μL, o que for maior) e misture cuidadosamente. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Faça um movimento dos tubos 3 vezes durante esse período para manter o reagente em suspensão.
      3. Centrifuge a 10.000 × g por 1,5 min. Transfira o sobrenadante contendo RNA para um novo tubo.
         PASSO CRÍTICO: Certifique-se de que nenhum reagente de inativação de DNase seja transportado, pois ele inibe a síntese subsequente de cDNA.
   4. Transcrição reversa (RT)
      1. Quantifique o RNA tratado e dilua em água livre de nuclease para usar até 2 μg de RNA total por reação de 20 μL.
      2. Prepare a mistura master RT no gelo seguindo as instruções do fabricante. Dispense a mistura em tubos de reação e adicione as amostras de RNA.
      3. Carregue em um ciclador térmico e execute o programa de transcrição reversa conforme especificado pelo fabricante do kit.
   5. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
      1. Use o cDNA gerado na Seção 4.3.4 como modelo de PCR. Dilua o cDNA em água sem nuclease até uma concentração de trabalho de 20 ng por reação de 10 μL. Mantenha todos os reagentes no gelo.
      2. Prepare uma mistura master contendo SYBR Green, primers e água sem nuclease. Inclua volume excedente para perda de pipetagem. Dispense 10 μL da mistura de reação em cada poço de uma placa óptica de qPCR.
      3. Sele a placa com filme adesivo óptico e centrifuge brevemente para coletar o líquido no fundo. Carregue a placa em um instrumento de PCR em tempo real e realize a amplificação usando o modo de ciclo rápido.
      4. Determine os valores do ciclo de limiar (Ct) e realize a quantificação relativa usando o método ΔΔCt. Inclua uma análise da curva de fusão ao final da sequência para verificar a especificidade da amplificação.
         NOTA: Normalize a abundância de mRNA-alvo para níveis 36B4 como gene endógeno de manutenção doméstica. Execute as placas de qPCR em até 2 horas após a instalação; caso contrário, armazene as placas seladas a 4 °C.
4. Western blot
   1. Quantifique a concentração de proteínas de extratos de células inteiras e mitocondriais (veja as Seções 2.1.8 e 2.1.12) usando um ensaio BCA.
   2. Prepare 30 μg de proteína por amostra e adicione o volume apropriado do buffer de carregamento da amostra SDS-PAGE (por exemplo, buffer de Laemmli).
   3. Desnature as amostras aquecendo a 95 °C por 5 minutos (ou siga requisitos específicos de temperatura para proteínas de membrana).
   4. Coloque as amostras nos poços de um gel de poliacrilamida. Separe as proteínas por eletroforese do gel de dodecil sulfato de sódio–poliacrilamida (SDS-PAGE) em uma tensão constante (por exemplo, 80–120 V) até que a frente do corante alcance a base do gel.
   5. Ative uma membrana PVDF mergulhando-a em 100% de metanol por 1 minuto, seguido de equilíbrio no tampão de transferência.
   6. Monte o sanduíche de transferência, garantindo a ausência de bolhas de ar entre o gel e a membrana.
   7. Transfira as proteínas para a membrana PVDF eletroblottando a 400 mA por 2 horas. Mantenha o sistema a 4 °C durante todo o processo.
   8. Bloqueie os sítios de ligação inespecíficos incubando a membrana em leite desnatado a 5% preparado em soro sorológico tampado com Tris-buffer, contendo 0,1% Tween 20 (TBS-T) por 1 hora em temperatura ambiente.
   9. Incube a membrana com anticorpos primários (diluídos 1:1.000 em solução bloqueante) durante a noite a 4 °C sob agitação suave.
   10. Lave a membrana por 3 × 15 minutos com TBS-T.
   11. Incubar com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) por 2 horas em temperatura ambiente.
   12. Lave a membrana 3 vezes com TBS-T, seguida de uma lavagem final de 5 minutos com 1× colher de sopa.
   13. Visualize as bandas proteicas usando um substrato de quimioluminescência (ECL) aprimorada. Capture o sinal usando um sistema de imagem digital.
       NOTA: Ajuste a porcentagem de gel de poliacrilamida (por exemplo, 8%, 10% ou 12%) com base no peso molecular das proteínas-alvo. Se o aparelho de eletrotransferência não possuir um sistema de resfriamento ativo, substitua os recipientes de gelo a cada hora e mantenha a câmara submersa em um banho de gelo. Armazene as membranas em 1× TBS a 4 °C se a visualização for atrasada.

Resultados

Extração mitocondrial e integridade estrutural e respiratória

Para avaliar o impacto do aumento da massa mitocondrial na adipogênese marrom, foi realizado um ensaio de transferência mitocondrial (MTA) em preadipócitos indiferenciados (Figura 1A). As mitocondrias foram isoladas de preadipócitos murinhos primários (mMito) e da linha celular hepática humana HepG2 (hMito). A análise de Western blot demonstrou que amba...

Discussão

Implicações biológicas da transferência mitocondrial na adipogênese

Nossos resultados mostram que, embora mitocôndrias exógenas tanto de fontes humanas quanto murinas possam ser incorporadas à rede mitocondrial endógena de preadipócitos diferenciadores, um aumento artificial da massa mitocondrial é insuficiente para impulsionar o programa adipogênico marrom. Esses achados sugerem que a expansão mitocondrial característica da adipogênese marro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	Usado para experimentos primários de pré-adipócito e DNA/qPCR; fornecedor/catálogo não fornecido
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulina)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Usado para verificação de integridade do RNA; fornecedor/catálogo não fornecido
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Adicionado dos Métodos Suplementares
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Adicionado dos Métodos Suplementares; catálogo não fornecido
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Adicionado dos Métodos Suplementares
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Entrada existente padronizada para corresponder ao arquivo suplementar
BioRender	BioRender	-	Usado para criar o fluxograma da Figura 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvente para o meio de indução; fornecedor/catálogo não fornecido
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Software de análise de citometria de fluxo
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Software de análise estatística/regressão logarítmica
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Software de análise de imagem de gotículas de lipídio
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Usado para homogeneização celular; fornecedor/catálogo não fornecido
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	Componente da solução de ensaio mitocondrial