Este estudo desenvolveu e validou preliminarmente um modelo de rato de cicatrização tardia de feridas sob condições de hipóxia hipobárica em alta altitude.
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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este estudo desenvolveu e validou preliminarmente um modelo de rato de cicatrização tardia de feridas sob condições de hipóxia hipobárica em alta altitude.
Condições hipobáricas de alta altitude podem causar hipóxia prolongada da ferida e cicatrização prejudicada, embora os modelos padronizados ainda sejam escassos. Neste estudo, desenvolvemos um modelo de cicatrização retardada da ferida e o validamos preliminarmente simulando hipóxia em alta altitude usando um sistema hipobárico controlado. Os ratos foram alojados em altitudes simuladas de 3000 m (pressão do ar: 70,1 kPa, pressão parcial de oxigênio: 14,7 kPa) a 8000 m (pressão do ar: 35,6 kPa, pressão parcial de oxigênio: 7,5 kPa) para determinar limiares de segurança, com avaliação do estresse oxidativo e da hipóxia cutânea. Os resultados mostraram aumento do risco de mortalidade em altitudes simuladas de 6000 m, com tolerância observada abaixo de 5000 m. Altitudes elevadas estavam associadas ao agravamento do estresse oxidativo e ao aumento da hipóxia cutânea; Apresentou atrasos dependentes da altitude na cicatrização da ferida, perfusão reduzida, suprimiu a remodelação do colágeno e agravou as respostas inflamatórias. Apesar da regulação para cima dos fatores regenerativos vasculares, a densidade microvascular diminuiu. No geral, este estudo desenvolveu e validou preliminarmente um modelo de rato adequado para investigar mecanismos e intervenções em feridas crônicas induzidas por hipóxia em alta altitude.
O reparo de feridas cutâneas apresenta um desafio clínico amplo e significativo. Desde traumas agudos até vários tipos de feridas que não cicatrizam, essas condições impõem um fardo persistente aos sistemas de saúde e à qualidade de vida dospacientes 1,2,3,4,5,6. A cicatrização de feridas não é um evento singular, mas um processo altamente coordenado e sobreposto em múltiplas etapas: células inflamatórias, células estromais, queratinócitos e o sistema microvascular coletivamente reconstroem barreiras e remodelam tecidos sob a regulação conjunta da matriz extracelular e das diversas redesde sinalização 7,8,9,10 . Dada a natureza intensiva em energia do reparo e sua extrema sensibilidade ao ambiente interno, alterações no metabolismo sistêmico e nos estados fisiológicos — como estresse oxidativo elevado, desregulação imunológico e perfusão microcirculatória comprometida — podem interromper a cascata normal de reparo em vários pontos, levando a inflamação prolongada, regeneração inadequada e remodelação anormal 9,11,12,13,14,15.
O fornecimento de oxigênio é um fator-chave que limita os processos de reparo de feridas, participando do metabolismo energético e da migração/proliferação celular, além de modular a angiogênese e as respostas inflamatórias por meio das vias de sinalização dahipóxia 16,17,18. A hipóxia transitória na fase inicial da ferida estabiliza o fator induzível de hipóxia e inicia programas de reparo adaptativo. No entanto, quando a hipóxia se torna excessiva ou persistente, embora os sinais de angiogênese possam ser compensatoriamente regulados para cima, eles podem não se traduzir em uma reconstrução microvascular eficaz. Enquanto isso, a troca de fenótipo dos macrófagos e a regressão inflamatória tornam-se mais propensas ao desequilíbrio, formando um ciclo vicioso de "deficiência de hipóxia-inflamação-revascularização"19,20,21,22. Isso é particularmente relevante em ambientes de alta altitude: pressão atmosférica reduzida a pressão parcial inspirada de oxigênio, induzindo hipóxia persistente que aumenta os riscos de cicatrização comprometida da ferida e complicações relacionadas àinfecção 23,24,25,26.
A exposição a grandes altitudes desencadeia uma resposta de estresse hipóxico marcada em humanos27. Ambientes de alta altitude podem levar a hipóxia persistente dos tecidos, perfusão inadequada e respostas inflamatórias nos locais daferida 28. Essas mudanças fisiopatológicas podem prejudicar o processo de cicatrização ao promover o excesso de espécies reativas de oxigênio, ativar proteases e induzir a senescência celular, ao mesmo tempo em que interrompem simultaneamente a função das células-troncomesenquimatosas 29,30. Estudos que avaliam diretamente os efeitos da exposição em alta altitude na cicatrização de feridas da pele humana continuam limitados. Portanto, o uso de modelos animais hipóxicos hipobáricos pode ajudar a validar o impacto de fatores relacionados à altitude na reparação de feridas.
Modelos animais anteriores em altitudes fixas relataram tardio na cicatrização de feridas; No entanto, os efeitos dependentes da altitude, o limiar de segurança para exposição prolongada a condições hipobáricas e a evidência direta de hipóxia cutânea local permanecemincertos 26. Além disso, há falta de avaliação sistemática das prejuízos de cicatrização, o que limitou a pesquisa sobre os mecanismos subjacentes e a identificação de possíveis alvos de intervenção31. Neste estudo, desenvolvemos e validamos preliminarmente um modelo de ferida cutânea baseado em um sistema de controle hipobárico para simular hipóxia hipobárica em alta altitude sob condições controladas. Empregando uma estratégia graduada de exposição simulada em altitude, primeiro definimos as margens de segurança para exposição hipobárica sustentada e avaliamos os efeitos biológicos da hipóxia hipobárica por meio de indicadores sistêmicos. Crucialmente, validamos ainda mais in vivo que o ambiente hipobárico realmente causava limitação localizada do suprimento de oxigênio na pele. Posteriormente, demonstramos que a hipóxia hipobárica sustentada atrasa o fechamento da ferida de forma dependente da altitude, acompanhada de alterações histológicas e anomalias chave nas vias. No geral, este estudo desenvolveu e validou preliminarmente uma plataforma modelo animal para feridas crônicas associadas à hipóxia em alta altitude, permitindo a elucidação dos mecanismos e a avaliação sistemática das estratégias terapêuticassubsequentes 32.
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Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram revisados e aprovados pelos comitês de ética da Universidade de Ciência e Tecnologia Eletrônica da China (nº 106142025091534170) e da Universidade Médica do Exército (nº AMUWEC20265509). O fluxo de trabalho gráfico para o desenho experimental e a análise envolvidos neste estudo é mostrado na Figura 1. Além disso, os reagentes e equipamentos empregados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
Animais experimentais e declaração ética
Este estudo utilizou ratos machos Sprague-Dawley (SD), adquiridos da Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd., China. Todos os animais passaram por um período de aclimatação de 7 dias sob condições padrão antes da experimentação.
Critérios de Inclusão e Exclusão
Os critérios de inclusão animal foram os seguintes: ratos machos SD, de 6 a 8 semanas de idade, peso corporal de 200–250 g, aparência saudável e comportamento normal, e livre de lesões cutâneas ou infecções.
Os critérios de exclusão animal foram os seguintes: feridas apresentando infecção óbvia após modelagem da ferida; feridas com cicatrização ou lacerações não convencionais; morte durante o experimento ou morte acidental devido à anestesia.
Os critérios de exclusão de pontos de dados foram os seguintes: imagens de feridas com crostas extensas, obstrução capilar ou iluminação desigual; imagens de imagem de contraste de speckle a laser (LSCI) mostrando artefatos de movimento; seções de tecido apresentando rugas evidentes, fragmentação ou áreas alvo ausentes; amostras de soro mostrando hemólise evidente; Imagens de imunofluorescência (IF) ou imunohistoquímica (IHC) com superexposição ou localização incorreta de anticorpos
Tratamento das exclusões:
Para todos os animais ou pontos de dados excluídos, dados válidos foram obtidos novamente por meio de experimentos suplementares para garantir que o tamanho final da amostra válida para cada grupo fosse N ≥ 3 para todas as análises de endpoints.
Sistema de controle hipobárico e ambiente simulado de hipóxia em alta altitude
O ambiente hipóxico simulado em alta altitude foi estabelecido usando um sistema de controle hipobárico. Esse sistema permite a regulação precisa da pressão do ar na cabine para reproduzir a pressão atmosférica correspondente a diferentes altitudes, reduzindo assim a pressão parcial do oxigênio ambiente e induzindo exposição hipóxica controlada (Figura 2A).
A pressão da cabine foi ajustada para simular altitudes de 3000 m, 4000 m, 5000 m, 6000 m, 7000 m e 8000 m, com parâmetros detalhados fornecidos na Tabela 1. Durante todo o experimento, ratos SD foram alojados em grupos de acordo com sua alocação experimental. Durante a operação da cabine, pressão interna, temperatura e umidade eram monitoradas continuamente para garantir que, exceto a pressão, todas as condições ambientais permanecessem comparáveis às das habitações padrão de laboratório. O ambiente habitacional mantinha uma temperatura de 22–24 °C, umidade relativa de 50%–60%, um ciclo de 12 horas de luz/escuro e oferecia acesso livre ao alimento padrão e à água potável.
Avaliação de segurança da exposição a hipobárico e análise de sobrevivência
Para avaliar as margens de segurança para exposição hipobárica sustentada, os ratos foram numerados individualmente e designados aleatoriamente para grupos experimentais usando uma sequência de números aleatórios gerada por computador (a função RAND no Excel). A alocação foi realizada por um investigador que não participou do cuidado animal subsequente, coleta de dados ou avaliação de resultados. Com base em estudos com animais de referência envolvendo exposição a gradientes de alta altitude, o tamanho da amostra para cada grupo foi definido em 1233. Os ratos foram divididos em um grupo controle normóxico (500 m acima do nível do mar) e grupos de altitude simulados a 3000 m, 4000 m, 5000 m, 6000 m, 7000 m e 8000 m. Ratos de cada grupo foram mantidos continuamente em seus respectivos ambientes por 30 dias. A cada 2 dias, o sistema de controle hipobárico é brevemente restaurado às condições do nível do mar por 30 minutos para permitir a limpeza das gaiolas e o fornecimento de alimentos e água. Durante a descompressão e a recompressão, a taxa de variação da pressão é mantida em aproximadamente 300 m/min para minimizar o risco de barotrauma. Durante esse período, a condição geral de todos os ratos e quaisquer eventos de mortalidade eram observados e registrados diariamente. Curvas de sobrevivência foram plotadas usando o método de Kaplan-Meier, e testes log-rank foram realizados para comparar diferenças de sobrevivência entre os grupos.
Detecção de marcadores soros relacionados ao estresse oxidativo
No dia 21 de exposição hipobárica, amostras venosas de sangue foram coletadas de ratos sob anestesia. Após ficar em temperatura ambiente, o soro era separado por centrifugação (1.000 × g por 15 minutos a 4 °C) e armazenado a -80 °C para uso subsequente. Os níveis séricos de lactato desidrogenase (LDH), malondialdeído (MDA) e superóxido dismutase (SOD) foram medidos usando kits de ensaio correspondentes.
Avaliação de condições hipóxicas em tecido cutâneo
O kit de detecção de hipóxia foi usado para avaliar a hipóxia no tecido cutâneo. Resumidamente, nos dias 4 e 7 de exposição hipobárica, os ratos foram injetados intraperitonealmente com pimozida (60 mg/kg); Os ratos foram eutanasiados 1 hora após a injeção, e tecido cutâneo das costas foi coletado para análise. O procedimento detalhado de eutanásia é o seguinte: De acordo com as diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana sobre eutanásia, o animal foi colocado em uma câmara de indução e induzido anestesia usando oxigênio contendo 4–5% de isoflurano. Uma vez que o animal perde a consciência, a concentração de isoflurano é reduzida para 2–3% e mantida por pelo menos 10 minutos. Antes de realizar a luxação cervical como método confirmatório, deve ser confirmado que o batimento cardíaco e a respiração cessaram. As amostras de tecido eram criopreservadas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C para uso subsequente. As seções eram preparadas usando um micrótomo crióstato. A coloração de IF foi realizada para marcar regiões hipóxicas dentro do tecido.
Todas as imagens de fluorescência foram adquiridas usando um scanner automatizado de diapositivas. As configurações dos parâmetros de fluorescência foram as seguintes: DAPI (comprimento de onda de excitação 365 nm ± 10 nm, comprimento de onda de emissão 440 nm ± 40 nm), Cy3 (comprimento de onda de excitação 542–566 nm, comprimento de onda de emissão 579–611 nm) e Cy5 (comprimento de onda de excitação 628 nm, comprimento de onda de emissão 692 nm). Os sinais de hipóxia foram analisados quantitativamente usando o software ImageJ.
Modelo de ferida cutânea de espessura total em ratos
Para avaliar alterações na cicatrização de feridas cutâneas sob condições hipobáricas sustentadas, os ratos foram primeiro agrupados e aclimatados aos seus respectivos ambientes antes da modelagem da ferida. Os ratos foram numerados individualmente e designados aleatoriamente para o grupo controle normóxico ou para os grupos de exposição hipobáricos, simulando altitudes de 3000 m, 4000 m e 5000 m usando uma sequência numérica aleatória gerada por computador (a função RAND no Excel). A randomização foi realizada por um investigador que não esteve envolvido na criação subsequente da ferida, no cuidado pós-operatório ou na avaliação de resultados. Os parâmetros detalhados para cada grupo são os seguintes: o grupo controle normóxico estava localizado a 500 m acima do nível do mar (pressão atmosférica: 101 kPa, pressão parcial de oxigênio: 21 kPa); o grupo dos 3000 m (70,1 kPa, 14,7 kPa); o grupo dos 4000 m (61,6 kPa, 13,1 kPa); e o grupo dos 5000 m (54 kPa, 11,3 kPa).
Após o período de adaptação de 7 dias, ratos SD foram anestesiados e mantidos sob anestesia por inalação de isoflurano a 2%. Simultaneamente, uma injeção local de infiltração com 5% de lidocaína contendo epinefrina (razão de diluição: 1:100.000) é administrada no local cirúrgico marcado para fornecer analgesia perioperatória e hemostasia. Usando um punção de biópsia (com uma lâmina circular de 10 mm de diâmetro na base), crie uma incisão na pele. Pressione o punção da biópsia contra a pele dorsal do rato, depois gire-a suavemente para que a lâmina circular corte gradualmente a pele até alcançar a fáscia subcutânea superficial. Ao remover o punção da biópsia, será formada uma incisão circular circular regular na pele com aproximadamente 10 mm de diâmetro.
Após a criação da ferida, os ratos de cada grupo eram devolvidos e mantidos em seus ambientes originais até o ponto final experimental, garantindo que todo o processo de cicatrização ocorresse sob as condições pré-determinadas de oxigênio.
Macroavaliação do processo de cicatrização de feridas
Fotografias do ferimento foram tiradas nos dias 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 pós-formação sob iluminação uniforme e distância de imagem consistente. A área da ferida foi medida usando a Imagem J. Resumidamente, as imagens da ferida obtidas em cada ponto de tempo foram importadas para a Imagem J, calibradas de acordo com a barra de escala, e as margens da ferida foram delineadas manualmente para determinar a área daferida 34. A cicatrização da ferida foi calculada da seguinte forma: cicatrização da ferida (%) = (Área inicial da ferida − Área atual da ferida)/Área inicial da ferida × 100%.
Avaliação da microcirculação da ferida
No sétimo dia de cicatrização da ferida, a perfusão microcirculatória de sangue na área da ferida foi avaliada usando um sistema LSCI. Antes do exame, os ratos foram anestesiados por inalação com isoflurano a 2% e fixados a uma mesa de operações com temperatura controlada para manter a temperatura corporal. A área dorsal da ferida estava totalmente exposta, e a sonda laser de speckle foi posicionada verticalmente aproximadamente 20 cm acima da ferida. A potência da sonda foi ajustada para 110 mW, a frequência de amostragem para 30 Hz e o tempo de exposição para 3 segundos. Em condições escuras, adquira uma imagem pseudocolorida com perfusão sanguínea da área da ferida. Use o software LSCI para delinear manualmente a área da ferida na imagem pseudocolorida da perfusão do fluxo sanguíneo; o software então calculará automaticamente o valor da perfusão do fluxo sanguíneo para aquela área ao longo de um período de 3 s (em unidades arbitrárias [A.U.]). Por fim, exporte os valores de perfusão para um software apropriado para plotamento.
Análise de coloração histológica e remodelação de colágeno
Os animais eram eutanasiados em momentos determinados, e feridas intactas e tecidos de pele ao redor eram colhidos, fixados, desidratados, incorporados com parafina e seccionados. Hematoxilina e eosina (HE): usadas para avaliar a largura da ferida, extensão da reepitelização e espessura regenerada da epidérmica; Coloração tricromática de Masson: usada para avaliar a deposição de fibras de colágeno e calcular a fração de volume de colágeno; Coloração Sirius Red: usada para distinguir colágeno tipo I (COL I) e colágeno tipo III (COL III) sob microscopia de luz polarizada e calcular a razão COL I/COL III.
Coloração imunohistoquímica
As seções de parafina passaram por deceração, reidratação e coleta de antígeno antes da coloração por IHC ou IF. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C, seguidos pela adição dos anticorpos secundários correspondentes. Informações específicas sobre anticorpos e a diluição correspondente são fornecidas na Tabela de Materiais. Seções IHC foram desenvolvidas com DAB, enquanto seções IF usaram anticorpos secundários fluorescentes com contracoloração DAPI paranúcleos 35,36. Todas as imagens foram adquiridas sob condições idênticas e quantificadas usando o software ImageJ.
Análise estatística
Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism. Para comparações entre múltiplos grupos em um único ponto de tempo, foi aplicada uma análise unidirecional da variância (ANOVA), e quando uma diferença geral significativa foi detectada, o teste de comparação múltipla de Tukey foi usado para análises intergrupos subsequentes. Para dados de cicatrização avaliados em múltiplos pontos de tempo, foi realizada ANOVA bidirecional com grupo de tratamento e tempo incluído como fatores independentes para avaliar os principais efeitos e sua interação. Análises pós-hoc também foram realizadas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Para avaliar ainda mais o poder estatístico, foi realizada uma análise pós-hoc de potência no software G*Power com base no ponto final primário (cicatrização da ferida no dia 14).
A análise de sobrevivência utilizou o método de Kaplan-Meier para traçar curvas de sobrevivência, com testes logarítmicos usados para comparar diferenças de sobrevivência entre grupos. Para comparações par a par entre múltiplos grupos, a correção de Bonferroni foi aplicada para controlar o risco de erros do Tipo I em múltiplas comparações. Todos os testes estatísticos foram bilaterais, com P < 0,05 considerado estatisticamente significativo.
Todas as avaliações de desfechos, incluindo medições da área da ferida, análises quantitativas histológicas e imunohistoquímicas, e análises LSCI, foram realizadas por um único pesquisador que não percebeu as tarefas do grupo de estudo.
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Validação das margens de segurança para hipóxia persistente induzida por baixa pressão
A análise de sobrevivência de Kaplan–Meier demonstrou um deslocamento gradual para baixo nas curvas de sobrevivência à medida que a altitude simulada aumentava, com eventos de mortalidade observados pela primeira vez no grupo dos 6000 m (Figura 2B). Comparações par a par com correção de Bonferroni não revelaram diferenças estatisticamente significativas...
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Condições de alta altitude prejudicam o processo de cicatrização da ferida ao induzir hipóxia tecidual, redução da perfusão sanguirosa e respostas inflamatórias, o que por sua vez promove a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio, ativação de protease, senescência celular e disfunção das células-tronco mesenquimais 27,28,29,30 . Dadas as limitações ...
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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Essa pesquisa foi financiada pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais, UESTC (ZYGX2025YGLH006); Projeto de Pesquisa em Ciências da Saúde da Província de Sichuan (2025-205); Fundação de Ciências Naturais de Shigatse, Tibete, China (RKZ2024ZR-003).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Scanner automático de slides | Olympus | VS200 | Escaneamento de Seção de Tecido |
| Albumina sérica bovina (BSA) | Servicebio | GC305010 | Reagente bloqueante para IHC/FI |
| Anticorpo CD206 | Proteintech | 18704-1-AP | Detecção de macrófagos M2 (Diluição 1:200) |
| Anticorpo CD31 | Abcam | ab182981 | Detecção da densidade de microvasos (Diluição 1:800) |
| Anticorpo CD86 | HuaBio | ER1906-01 | Detecção de macrófagos M1 (Diluição 1:200) |
| Anticorpo CK19 | HuaBio | ET1601-6 | Avaliação da re-epitelização (Diluição 1:200) |
| Kit de Substrato DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | Substrato cromogênico para coloração IHC |
| IgG anti-coelho conjugado com FITC | Servicebio | GB22303 | Anticorpo secundário fluorescente para FI (Diluição 1:100) |
| G*Power | Universidade de Duisburg-Essen, Alemanha | www.gpower.hhu.de | Cálculo do Poder Estatístico |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | Análise estatística e geração de grafos |
| Solução de coloração por hematoxilina | J& K Scientific | LM10N13 | H& Coloração por E |
| HIF-1 & alfa; anticorpo | Bioss | BS-0737R | Detecção de sinalização relacionada à hipóxia (Diluição 1:100) |
| IgG anti-coelho conjugado com HRP | Servicebio | GB23303 | Anticorpo secundário para IHC (Diluição 1:100) |
| Sistema de controle hipobárico | Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd. | LP-1500 | Usado para simular hipóxia hipobárica graduada em alta altitude |
| Kit Hypoxiprobe-1 | Hypoxyprobe Inc. | HP1-100 | Usado para detecção de hipóxia in vivo |
| Kit de amplificação de sinal IF555 Tyramide | Servicebio | G1233 | Usado para amplificação aprimorada de sinais de fluorescência |
| Anticorpo IL-10 | HuaBio | HA722032 | Detecção de citocina anti-inflamatória (Diluição 1:100) |
| IL-1 e beta; anticorpo | HuaBio | HA723965 | Detecção de citocina pró-inflamatória (Diluição 1:100) |
| Software ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde (NIH), EUA | https://imagej.net/ij/download.html | Quantificação de imagem |
| Isoflurano | RWD Life Science Co., Ltd. | R510-22-16 | |
| Anticorpo Ki-67 | HuaBio | HA721115 | Detecção de proliferação de queratinócitos (Diluição 1:400) |
| Sistema de imagem de fluxo sanguíneo a laser com manchas de luz & nbsp; | RWD Life Science Co., Ltd. | RFLSI ZW | Avaliação de Perfusão sanguínea |
| Kit de Ensaio LDH | Instituto de Bioengenharia Jiancheng de Nanjing | A005-1-2 | Medição sérica de LDH |
| Masson' Kit de coloração tricromática S | Servicebio | G1006-100ML | Análise de deposição de colágeno |
| Kit de ensaio MDA | Instituto de Bioengenharia Jiancheng de Nanjing | A003-1-1 | Avaliação da peroxidação lipídica |
| Kit de mancha vermelha Sirius | Servicebio | G1078-100ML | Diferenciação de colágeno I/III |
| Kit de ensaio SOD | Instituto de Bioengenharia Jiancheng de Nanjing | A001-1-1 | Medição da atividade do SOD sérico |
| TNF-&alfa; anticorpo | HuaBio | ER65189 | Detecção de citocina pró-inflamatória (Diluição 1:200) |
| Anticorpo VEGF-A | HuaBio | ET1604-28 | Detecção de sinalização relacionada à angiogênese (Diluição 1:200) |