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Artigo de investigação
A lactona sesquiterpeno XTT atenua efetivamente as respostas inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeos (LPS) em macrófagos. O XTT atua no IKKα/β para inibir a sinalização de NF-κB sem afetar a ativação do MAPK, exercendo assim potentes efeitos anti-inflamatórios in vitro.
A desregulação da cascata do fator nuclear-κB (NF-κB) está fortemente ligada à progressão de distúrbios inflamatórios. As quinases IκB (IKKs) são bem estabelecidas como moduladoras centrais da atividade do NF-κB, tornando-as candidatas terapêuticas atraentes para o tratamento de patologias inflamatórias. A lactona sesquiterpeno 1β-hidroxil-5α-cloro-8-epi-xantatina (XTT) tem sido documentada como exercendo efeitos anticâncer robustos. No entanto, sua atividade anti-inflamatória e os mecanismos moleculares subjacentes permanecem incertos. Neste trabalho, a XTT suprimiu de forma marcada a síntese de óxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2) em macrófagos RAW264.7 ativados por lipopolissacarídeos (LPS). A XTT também reduziu substancialmente os níveis de mRNA induzível de óxido nítrico sintase (iNOS), ciclooxigenase-2 (COX2), fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6). Além disso, o XTT reduziu os níveis de proteína de iNOS e COX2 provocados pelo tratamento com LPS. No nível mecanicista, a XTT não alterou significativamente a atividade da cascata da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK). Por outro lado, a XTT bloqueou fortemente a fosforilação e a quebra do κBα inibitório (IκBα) desencadeadas por LPS ao interagir com o IKKα/β, prejudicando assim a translocação nuclear do NF-κB. Em conjunto, esses dados mostram que a XTT provoca efeitos anti-inflamatórios robustos in vitro ao direcionar o IKKα/β e bloquear a sinalização do NF-κB. Esses resultados sugerem que o XTT pode servir como um composto líder promissor para o desenvolvimento de agentes anti-inflamatórios. Estudos bioquímicos e in vivo adicionais são necessários para validar a inibição direta do IKKα/β e o potencial terapêutico.
A inflamação é um processo biológico rigidamente regulado que permite aos organismos responder a infecções, lesões teciduais e outros desafiosambientais 1. Embora as respostas inflamatórias agudas sejam geralmente protetoras, a ativação persistente das vias inflamatórias pode prejudicar a homeostase dos tecidos e contribuir para o início e progressão de distúrbios crônicos, incluindo doença inflamatória intestinal (DII) e artrite reumatoide (AR)2. Diversas redes de sinalização intracelular participam da regulação inflamatória, entre as quais a via fator nuclear-κB (NF-κB) é uma das maisestudadas 3.
Membros da família NF-κB, incluindo p50, p52, p65 (RelA), RelB e c-Rel, funcionam como fatores de transcrição diméricos que regulam a expressão dos genes envolvidos na imunidade einflamação 4,5. Em condições basais, os dímeros NF-κB permanecem inativos no citoplasma por associação com inibidores das proteínas κB (IκB). Após a estimulação por mediadores inflamatórios como lipopolissacarídeo (LPS) ou fator de necrose tumoral α (TNF-α), o complexo IκB quinase (IKK) é ativado e fosforila IκBα, resultando em sua ubiquitinação e degradação. Esse processo permite que os complexos NF-κB se acumulem no núcleo e iniciem a transcrição de mediadores inflamatórios ecitocinas 6. Como a ativação excessiva ou sustentada do NF-κB está intimamente associada a uma variedade de doenças inflamatórias e autoimunes, a intervenção farmacológica no nível da sinalização IKK tem despertado considerávelinteresse 7,8,9.
Produtos naturais há muito tempo são fontes vitais para o desenvolvimento de medicamentos, incluindo terapêuticasanti-inflamatórias 10. 1β-hidroxil-5α-cloro-8-epi-xantaina (XTT) é uma lactona sesquiterpenica isolada de Xanthium sibiricum11,12. Pesquisas anteriores mostraram que o XTT suprime a proliferação celular e desencadeia a apoptose em células do carcinoma hepatocelular humano por meio da ativação do ERK/p38 MAPK mediada por ROS e da inibição de JAK2/STAT3 causada pela depleção deglutationa 13. No entanto, o potencial anti-inflamatório da XTT e seus mecanismos moleculares associados ainda são pouco compreendidos.
Os achados atuais indicam que o XTT apresenta efeitos anti-inflamatórios substanciais in vitro. Investigações mecanicistas indicam que a XTT interage com o IKKα/β e suprime a sinalização de NF-κB, inibindo assim respostas inflamatórias em macrófagos ativados. Esses achados sugerem que o XTT pode representar um composto líder promissor para o desenvolvimento de agentes anti-inflamatórios.
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Este estudo envolveu apenas linhas celulares comerciais estabelecidas e não incluiu participantes humanos, amostras clínicas ou experimentos com animais. Portanto, não era necessário aprovar a ética institucional nem o consentimento informado. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes de segurança do laboratório institucional. Reagentes perigosos eram manuseados em exaustores designados, com o uso adequado de equipamentos de proteção individual (EPI). Resíduos químicos e biológicos foram descartados de acordo com as regulamentações institucionais. Os produtos químicos, kits e reagentes usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura celular
Macrófagos murinos RAW264.7, células de carcinoma cervical humano HeLa e células embrionárias humanas HEK293T do rim foram adquiridos do Banco Celular da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as células foram mantidas no Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. O ambiente de cultivo foi definido em 37 °C com 5% de CO₂ e umidade saturada.
2. Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada por meio de um ensaio Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8). RAW264,7 células (2,5 × 104 células/poço) foram placadas em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite a 37 °C. As células foram então tratadas com diferentes concentrações de XTT por 24 horas, com ou sem LPS (0,5 μg/mL). A concentração de LPS e a duração do tratamento foram otimizadas em experimentos preliminares para induzir respostas inflamatórias moderadas sem causar citotoxicidade significativa. Posteriormente, 10 μL do reagente CCK-8 foram adicionados a cada poço, e a placa foi mantida a 37 °C por 2 horas. A absorvância foi medida em 540 nm usando um leitor de microplaca.
3. Determinação dos níveis de NO e PGE₂ em meio de cultura celular
As células RAW264,7 foram placadas em placas de 24 poços com densidade de 2,5 × 10células de 5 poços e cultivadas durante a noite a 37 °C. As células foram pré-tratadas com XTT por 2 horas antes da estimulação LPS ou TNF-α (15 ng/mL) por mais 24 horas. O período pré-tratamento de 2 h foi escolhido para permitir interação adequada entre XTT e alvos celulares antes do desafio inflamatório. Os níveis de óxido nítrico (NO) e prostaglandina E₂ (PGE₂) no meio de cultura foram quantificados seguindo os protocolos do fabricante.
4. Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (qRT-PCR)
As células RAW264,7 (2 × 106 células) foram placadas em placas de 6 poços durante a noite e pré-tratadas com várias doses de XTT por 2 horas antes do desafio LPS (0,5 μg/mL) por 24 horas. O RNA total foi isolado usando reagente TRIzol conforme as instruções do fabricante. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro, e amostras com razões A260/A280 >1,8 foram usadas para análises a jusante.
O RNA total (2 μg) foi transcrito reversamente em cDNA em um volume final de reação de 20 μL usando um kit de síntese de cDNA. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando a química SYBR Green em um sistema de detecção de PCR em tempo real. As sequências de primers eram as seguintes:
iNOS Forward: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
Reverso do iNOS: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 para frente: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 reverso: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β Frente: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β reverso: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 dianteira: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 reverso: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α para frente: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
Reverso TNF-α: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH forward: 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH reverso: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
O procedimento de amplificação por PCR foi realizado como: desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 39 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 30 s. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método 2−ΔΔCt com GAPDH como controle interno.
5. Western blotting
Após o tratamento, as células RAW264,7 foram homogeneizadas em tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase. Esses inibidores foram preparados frescos imediatamente antes do uso para evitar a degradação e desfosforilação de proteínas. Os níveis totais de proteína foram quantificados usando um kit de ensaio de BCA. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de 10% de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. Após a transferência, as membranas foram incubadas com leite desnatado a 5% preparado em TBST contendo Tween-20 (TBST) para bloqueio, e então sondadas com anticorpos primários (diluição 1:1.000) durante a noite a 4 °C. As membranas foram então sondadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (diluição 1:5.000) por 1h em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram detectadas usando um sistema de detecção por quimioluminescência, e as intensidades das bandas foram analisadas por quantificação densitométrica.
6. Ensaio de imunofluorescência
As células HeLa foram semeadas em placas de 6 poços e pré-tratadas com XTT (8 μM) por 4 horas antes da estimulação do TNF-α (15 ng/mL) por 30 minutos. Esse período pré-incubação de 4 horas foi escolhido para maximizar o engajamento do alvo antes da ativação do NF-κB. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos e permeabilizadas com 0,25% de Triton X-100 por 15 minutos em temperatura ambiente. Após o bloqueio com albumina sérica bovina a 2% (BSA) e soro de cabra a 10% diluídos em soro salino tamponado com fosfato (PBS), as células foram incubadas com um anticorpo primário anti-p65 (diluição 1:250) durante a noite a 4 °C, seguidas de sondagem com um anticorpo secundário conjugado com TRITC (diluição 1:1.000) por 1 hora em temperatura ambiente. Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI (0,5 μg/mL) por 5 minutos no escuro. Imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio de fluorescência. As células HeLa foram selecionadas porque sua grande proporção citoplasma-núcleo facilita a visualização da translocação nuclear p65.
7. Fracionamento citoplasmático e nuclear
As células HeLa foram pré-incubadas com XTT por 4 horas e depois estimuladas com TNF-α (15 ng/mL) por 30 minutos. As células foram coletadas, enxaguadas com PBS frio e processadas para extração citoplasmática e de proteínas nucleares usando um kit comercial de extração de proteínas nucleares e citoplasmáticas, conforme as instruções do fabricante. Todos os procedimentos foram realizados em gelo para preservar a integridade das proteínas.
8. Ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA)
O CETSA foi realizado conforme descritoanteriormente em 14. Aproximadamente 1 × 107 células HeLa foram coletadas e ressuspensas em 500 μL de inibidores de protease contendo PBS frio, depois lisadas por três ciclos de congelamento-descongelamento em nitrogênio líquido. Lisados celulares foram centrifugados a 20.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Os supernadantes resultantes foram alicotados igualmente em dois grupos e tratados com XTT (100 μM) ou DMSO por 1 hora em temperatura ambiente. XTT (100 μM) foi aplicado para aumentar a sensibilidade à detecção em experimentos CETSA. As amostras foram então alicotadas em sete tubos e aquecidas nas temperaturas indicadas por 3 minutos, seguidas de incubação em temperatura ambiente por mais 3 minutos. Frações proteicas solúveis foram coletadas para análise de imunoblotagem.
9. Acoplamento molecular
A análise de acoplamento molecular foi realizada conforme descritoanteriormente 14. Estruturas cristalinas de IKKβ (IDs PDB: 3BRT e 4KIK) foram recuperadas do Banco de Dados de Proteínas (PDB). As estruturas proteicas foram pré-processadas com PyMOL (versão 2.3.4) para remover moléculas de água, ligandos originais e impurezas, seguida pela adição de átomos de hidrogênio. Cargas de Gasteiger foram calculadas, e bolsos ativos foram identificados usando o AutoDock Tools (versão 1.5.6). As estruturas proteicas foram então armazenadas no formato PDBQT.
A estrutura XTT foi gerada em Chem3D (versão 15.1) e otimizada por meio de minimização de energia. Docking semi-flexível foi realizado usando o AutoDock Vina (versão 1.1.2). Caixas de grade foram construídas para cobrir totalmente os bolsos ativos, enquanto todos os outros parâmetros permaneceram nas configurações padrão. Foram selecionadas para análise poses de acoplamento com as menores energias de ligação e conformações mais estáveis. Energias de ligação abaixo de −5 kcal/mol foram consideradas indicativas de forte afinidade de ligação segundo critérios publicados. O PyMOL foi ainda empregado para visualizar modos de ligação e avaliar ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações de van der Waals e possíveis sítios de ligação.
10. Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 5.0. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM) de três experimentos independentes. A significância estatística foi avaliada usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste post hoc de Dunnett. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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XTT inibiu a produção de NO e PGE₂ em macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS ou TNF-α
Para determinar se os efeitos anti-inflamatórios do XTT eram independentes da citotoxicidade, a viabilidade celular do RAW264,7 foi avaliada após o tratamento com XTT na presença ou ausência de LPS. Nenhuma redução apreciável na viabilidade celular foi detectada em concentrações variando de 0,5 a 8 μM, indicando que o composto foi bem tolerado nas condições experimentais (
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As lactonas sesquiterpenas são uma classe de produtos naturais com diversas atividades farmacológicas, incluindo efeitos antissépticos, anti-inflamatórios, antipiréticos edesintoxicantes 15. Estudos anteriores mostraram que o XTT, uma lactona sesquiterpeno do tipo xantanólica isolada de Xanthium sibiricum, apresenta potentes efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos em células carcinomas hepatocelulareshumanos 13. Este trabalho ...
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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nº 82004031), pelo Projeto de Pesquisa da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (Nº 2024MS566) e pelo Programa Nacional Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Nº 2023YFC3504402).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |