Citometria de Fluxo Multicêntrico para Doença Residual Mensurável de Leucemia Mieloide Aguda com LAIP/DfN e Populações Enriquecidas com Células-Tronco Leucêmicas CD34+CD38

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho multicêntrico de citometria de fluxo para quantificação mensurável de doenças residuais mensuráveis por leucemia mieloide aguda, utilizando análise de imunofenótipo/diferente do normal associada à leucemia (LAIP/DfN) e populações enriquecidas com células-tronco leucêmicas definidas fenotipicamente em CD34⁺CD38⁻ .

Resumo

O acompanhamento mensurável da doença residual (DMR) é recomendado para avaliação de resposta ao tratamento em ensaios clínicos de leucemia mieloide aguda (LMA), conforme as diretrizes ELN 2025. O objetivo deste estudo foi implementar um acompanhamento padronizado dos pacientes usando uma abordagem harmonizada de fluxo de MRD em 30 laboratórios franceses de hematologia participantes de ensaios clínicos de LMA. Para obter resultados comparáveis, a rede estabeleceu recomendações desde procedimentos de laboratório úmido até relatórios clínicos. Projetamos um painel de 3 tubos com marcadores comuns obrigatórios de 8 cores por tubo, de acordo com as recomendações do ELN, para identificar padrões de imunofenótipo/diferentes do normal (LAIP/DfN) associados à leucemia em células a granel e populações enriquecidas com células-tronco leucêmicas (LSC) na fração CD34⁺CD38⁻ . Foi utilizada uma espinha dorsal de CD34/CD38/CD45/CD117, completada por marcadores de linhagem para o primeiro tubo, marcadores associados ao LSC para o segundo tubo e marcadores monocíticos e de diferenciação para o terceiro tubo. Este painel pode ser usado em formatos de 8, 10 e 12 cores e implementado em múltiplas plataformas convencionais de citômetros de fluxo. Propomos configurações de citômetro de fluxo adaptadas a cada plataforma.

A harmonização da sensibilidade entre as quatro plataformas foi realizada usando contas arco-íris de 8 picos. A imunocoloração foi realizada após a lise em massa. Para detectar viés entre plataformas, o índice de coloração foi testado usando amostras frescas de medula óssea saudável em paralelo nas quatro plataformas. Amostras regulares de controle de qualidade da medula óssea foram compartilhadas entre laboratórios para avaliação externa de qualidade úmida (EQA) para verificar todas as etapas do protocolo. Por fim, a padronização da estratégia de análise de dados obtida nos centros foi avaliada usando EQA seco por meio do compartilhamento de arquivos de dados MRD FCS. A viabilidade dessa abordagem multicêntrica requer harmonização da sensibilidade do instrumento e preparação da amostra, bem como treinamento e educação sistemática de operadores analíticos.

Introdução

Doença residual mensurável (DRM) refere-se ao pequeno número de células leucêmicas que persistem durante ou após o tratamento e são indetectáveis pela morfologia, especialmente em casos de remissão completa com menos de 5% de blastos na medula óssea. O monitoramento da DMR é recomendado para avaliação da resposta ao tratamento em ensaios clínicos de leucemia mieloide aguda (LMA), conforme as diretrizes ELN 2025¹. Além dos métodos de biologia molecular, incluindo a PCR da transcriptase reversa (RT-qPCR) e o sequenciamento de próxima geração (NGS), a citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) é uma abordagem comumente^{utilizada 2}.

Para obter resultados consistentes de DRM, especialmente em ensaios clínicos, duas estratégias são possíveis: centralizar a medição de DRM em um único laboratório ou implementar um protocolo que garanta a reprodutibilidade entre os diferentes laboratórios envolvidos na determinação de DRM. O número de amostras, o tamanho do ensaio e a capacidade dos laboratórios de processar volumes de amostras maiores ou menores podem determinar a escolha entre essas estratégias. Se uma estratégia multicêntrica for escolhida, as diferenças entre as plataformas de citômetros e a necessidade de análises comparáveis entre os locais devem ser abordadas.

Para esse fim, descrevemos uma abordagem padronizada de fluxo de MRD multicêntrica e multiplataforma que combina análise de imunofenótipo/diferente do normal (LAIP/DfN) associada à leucemia e detecção enriquecida com células-tronco leucêmicas (LSC) definida fenotipicamente por CD34⁺CD38⁻, implementada em 30 laboratórios de hematologia franceses com base nas recomendações ELN e nos relatórios^{anteriores 3,4}.

A citometria de fluxo permite definir, no diagnóstico, a "assinatura" da leucemia que incorpora a expressão específica dos marcadores nos blastotomas do paciente: LAIP. Após o tratamento, o fluxo de DRM permite o monitoramento dos LAIPs identificados no diagnóstico. Como blastos leucêmicos podem evoluir e modificar seu imunofenótipo sob pressão terapêutica, uma segunda estratégia deve ser implementada sistematicamente: a abordagem DfN, que se baseia na identificação de células com características que as diferenciam da hematopoiese normal. Essa técnica também pode detectar o aparecimento de novos marcadores em blastos durante o curso da doença e seu tratamento.

No grupo francês de fluxo AML, o desenho do painel foi baseado no estudo publicado anteriormente pela HOVON sobre definição de padrões de células leucêmicas. Não existe um marcador universal de LSC ou LAIP, então projetamos um painel de 3 tubos que permite a identificação simultânea de populações enriquecidas com LAIP, DfN e CD34⁺CD38⁻ enriquecidas com LSC. Uma espinha dorsal baseada em CD34/CD38/CD45/CD117 foi usada em todos os tubos, completada por marcadores de linhagem no primeiro tubo, marcadores associados ao LSC no segundo tubo e marcadores de linhagem ou diferenciação monocítica no terceiro tubo para completar a definição do LAIP em LMA com blastos monocíticos. As três trompas são adquiridas no diagnóstico e em amostras de acompanhamento.

Dada a fisiopatologia da leucemogênese, a atenção mudou do estudo do volume do blast para identificar a fração mais imatura como populações enriquecidas com células-tronco leucêmicas. Dick e colegas demonstraram a heterogeneidade da leucemia ao descrever LSCs CD34⁺CD38⁻ com potencial para gerar leucemia em camundongos imunodeficientes ^5,6. Na quantificação de LSC no diagnóstico e acompanhamento, esforços estão sendo feitos para padronizar painéis de anticorpos e estratégias de análise dentro do grupo de trabalho ELN^{DAVID 1,7}. Atualmente, dois painéis, HOVON e ALFA, utilizam marcadores dicotômicos de LSC para distinguir populações ricas em LSC de células-tronco hematopoiéticas normais no espaço CD34⁺CD38^{− 8,9}.

O método aqui descrito combina preparação padronizada da amostra, design comum de painel de anticorpos, configurações de sensibilidade adaptadas à plataforma, análise enriquecida com LSC com LAIP/DfN e CD34⁺CD38⁻ , avaliação externa de qualidade e relatórios clínicos harmonizados para monitoramento multicêntrico do fluxo de MRD de LMA.

Protocolo

O protocolo segue as recomendações e diretrizes dos comitês de ética dos Centros Hospitalares Universitários Franceses. Todos os pacientes assinaram consentimento informado conforme a legislação francesa. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana da CHU Lyon e pelo Comitê de Ética do Conselho de Revisão Institucional da CHU de Lille, de acordo com a Declaração de Helsinque (observatório HDF-AML, CNIL 2214454v0). Para a aloenxátia, os doadores foram incluídos no banco de dados europeu ProMISE baseado na internet e forneceram consentimento informado para a coleta de seus dados pessoais. A extração e análise dos dados foram realizadas de acordo com o Comitê de Ética local (CNIL2093819). Todos os arquivos de fluxo FCS usados para revisão de rede eram totalmente anonimizados usando um script em Python.

1. Ajuste do citômetro

1. Determine os valores-alvo adaptados a cada citômetro usando esferas arco-íris de 8 picos.
2. Defina cada máquina de acordo com os valores-alvo mostrados na Tabela 1. Certifique-se de que cada canal atinja o valor alvo ± 5%. Verifique essa configuração sistematicamente para manter a sensibilidade longitudinal de cada plataforma.
3. Estabeleça a matriz de compensação usando tubos de coloração única para cada anticorpo, utilizando esferas de compensação e/ou células de acordo com cada plataforma.
4. Salve a matriz de configuração e compensação como um ensaio ou protocolo identificado como MRD LAIP/DfN, LSC e MonoGran (T1, T2, T3). Use este ensaio ou protocolo para aquisição para quantificação de fluxo de MD AML.

2. Procedimento de laboratório úmido

1. Medula óssea aspirada
   1. Colete 1-2 mL de medula óssea de EDTA no diagnóstico e nos momentos de monitoramento, incluindo MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 e recaída.
   2. Envie os tubos para o laboratório de fluxo de referência em 24-48 horas.
2. Preparação do exame morfológico para exame morfológico
   1. Coloque uma gota de aspiração de medula óssea em uma lâmina de vidro. Espalhe suavemente a amostra usando um coverslip ou outra lâmina.
   2. Após 30 minutos de secagem, tinga a mancha com May-Grünwald-Giemsa (Arquivo Suplementar 1).
3. Lise em massa
   1. Adicione 15 mL de solução lisadora NH₄Cl a 1-2 mL de amostra de medula óssea. Misture delicadamente e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
   2. Centrifuge a 450 × g em temperatura ambiente por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
   3. Resuspenda o pellet celular em 10 mL de PBS/0,1% BSA. Centrifuge a 450 × g em temperatura ambiente por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
   4. Resuspenda o pellet celular a uma concentração de 30 × 10⁶ leucocitos/mL em PBS.
4. Imunocoloração da suspensão celular
   1. Distribua os anticorpos monoclonais nos tubos T1, T2 e T3 de acordo com a plataforma (Tabela 2). Forneça o clone, volume, referência de catálogo e fornecedor para cada anticorpo em uma tabela de anticorpos.
      NOTA: Para cada tubo que utiliza corantes violetas brilhantes, use um tampão de coloração brilhante antes de adicionar os anticorpos.
   2. Adicione 2-3 ×10⁶ células lisadas por tubo em 100 μL de suspensão celular. Incube as células com anticorpos por 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente.
   3. Lave as células com 3 mL de PBS. Centrifuge por 5 minutos a 450 × g e descarte o sobrenadante.
   4. Resuspenda as células coradas em 300 μL de PBS.
      NOTA: Coquetéis de anticorpos pré-misturados ou tubos de anticorpos secos validados podem ser utilizados.

3. Aquisição do citometro de fluxo

1. Abra o ensaio ou protocolo de aquisição MRD com a matriz de configuração e compensação adaptada para a medição de MRD LAIP/DfN e LSC.
2. Adquirir um mínimo de 500.000 a 1.000.000 de glóbulos brancos em cada tubo no diagnóstico e em amostras de acompanhamento de MRD para melhorar o agrupamento das células MRD e a confiança em MRD de baixo nível.
   NOTA: Para a medição de LSC, adquira um mínimo de 1.000.000 de WBC no Tubo 2 para obter sensibilidade adequada para a quantificação de LSC (LOQ 0,002% e LOD 0,001%^)10,11.
3. Salve os arquivos de dados do FCS das amostras de diagnóstico e MRD. Registre a data de aquisição e a identificação do paciente para facilitar o acompanhamento da análise de MRD e LSC.

4. Estratégia de análise

1. Use um modelo comum e uma sequência comum de dot-plot incorporando uma estratégia de gate harmonizada pré-definida, adaptada ao software de análise usado em cada centro.
2. Aplique a estratégia de gate para identificar células leucêmicas usando três abordagens: LAIP, DfN e análise LSC na fração CD34⁺CD38^-.
3. Identificar e excluir possíveis eventos inespecíficos e populações fisiológicas normais, incluindo basófilos, células dendríticas plasmacitoides, hematogonos, células plasmáticas, eritroblastos, aglomerados de plaquetas, detritos e eritrócitos não lisados.

5. Definição de LAIP/DfN e populações fisiológicas

1. Para capturar o LAIP em explosões em massa, desenhe uma porta de célula única baseada em FSC-W versus FSC-H.
2. Desenhe uma porta de célula viva baseada em FSC versus SSC.
3. Desenhe uma barreira de explosão no^DI/SSC do CD45.
4. Desenhe a porta marcadora primitiva usando CD34/CD117.
5. Use gráficos de pontos biparamétricos fixos para desenhar as portas relevantes do LAIP, incluindo LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 e LAIP8.
6. Populações fisiológicas
   1. Hematógonos de gate usando a seguinte sequência: células vivas, MNC no gráfico de pontos FSC/SSC, gráfico de pontos CD19/SSC e gráfico de pontos CD34/CD38. Backgate usando CD45/SSC.
   2. Basófilos de porta usando a seguinte sequência: células vivas, MNC no gráfico de pontos FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), excluindo hematógonos CD19⁺ . Backgate usando CD45/SSC.
   3. Células dendríticas plasmacitoides de gate usando a seguinte sequência: células vivas, MNC no gráfico de pontos FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), excluindo hematógonos CD19⁺ . Backgate usando CD45/SSC.
   4. Identifique eritróblastos, aglomerados de plaquetas, detritos e eritrócitos não lisados usando o gráfico de pontos CD36/CD45. Backgate usando CD45/SSC e FSC/SSC.
7. Abordagem LAIP
   1. Defina MRD em AML primitivo CD34⁺ OU CD117⁺ usando operadores booleanos da seguinte forma: LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8 E NÃO limpos CD36^bright+/CD45 E células únicas E células vivas E marcadores primitivos CD34^+/CD117^+/ E (barramento do CD 45/SSC OU MNC CD34⁺) (Figura 1).
   2. Defina MRD em CD34-CD117^- AML usando operadores booleanos da seguinte forma: LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8 E NÃO limpar CD36^bright+/CD45 E células únicas E células vivas E CD34CD117 E CD45/SSC blast gate (Figura 2).
8. Abordagem DfN
   1. Use o mesmo modelo da abordagem LAIP e aplique o espaço vazio definido nas amostras de medula óssea de referência (Tabela 3).
   2. Defina populações anormais quando o agrupamento de células anormais está separado das células normais por 0,5 década na escala^{logarítmica 12}.
   3. Para capturar DfN em blasts a granel, desenhe células vivas usando FSC/SSC.
   4. Desenhe células individuais removendo doublets baseados na área de pico/SSC do FSC.
   5. Desenhe a porta MNC usando FSC/SSC.
   6. Aplique uma comporta de limpeza para remover linfócitos usando CD45/CD36/SSC.
   7. Aplique uma comporta de limpeza para remover eritroblastos e detritos usando CD45/CD36.
   8. Use duas portas de entrada, CD34⁺/CD45/SSC e CD117⁺/CD45/SSC, para definir as caixas vazias conforme as publicações^{anteriores 12,13}.
   9. Desenhe cada caixa vazia de DfN com base em populações de controle interno, incluindo linfócitos para marcadores cruzados de linhagem e precursores mieloides normais para marcadores de perda, diminuição ou superexpressão.
   10. Compare as caixas vazias com amostras de medula óssea de referência, incluindo medula óssea regenerativa, inflamatória e saudável.

6. Definição da população do CSL CD34⁺CD38^-

1. Identificar células enriquecidas com LSC no diagnóstico ^{no espaço} CD34⁺CD38- com base em marcadores LSC com expressão dicotômica e ausência de expressão em células-tronco hematopoiéticas normais da medula óssea saudável.
2. Defina a porta de entrada LSC como MNC34⁺ usando a seguinte sequência de gates: células vivas, células individuais, MNC e CD34⁺ no gráfico de pontos CD45/CD34.
3. Defina a fração CD34⁺CD38^- (P6) usando um limiar rigoroso baseado no nível de fluorescência menos um (FMO) do CD38.
4. Defina células enriquecidas com LSC no Tubo 1 na fração P6 usando operadores booleanos da seguinte forma: P6CD7⁺ OU P6CD33⁺ OU P6CD19⁺ OU P6CD56⁺ E NÃO limpas CD36^brilhantes e células únicas E células vivas E MNC E MNC CD34⁺.
5. Defina células enriquecidas com LSC no Tubo 2 na fração P6 usando operadores booleanos da seguinte forma: P6CD45RA⁺ OU P6MIX⁺ OU P6CD123⁺ E NÃO limpas CD36^bright+ e células únicas e células vivas E MNC E MNC CD34⁺.
6. Use CD36 para limpar eventos inespecíficos no portão final do MRD LSC (Figura 3).

7. Definição do limiar CD38^- na população CD34⁺

1. Ajuste o canal CD38 alto o suficiente para distinguir populações CD38^- de populações CD38^+/ com boa resolução.
2. Defina P6 como CD34⁺CD38^-, P7 como CD34⁺CD38^baixo, e P8 como CD34⁺CD38^agudo.
3. Baseie a configuração do canal CD38 nas populações brilhantes do CD38, identificando as células plasmáticas como as mais brilhantes e os hematógonos de acordo com a faixa de medição de cada plataforma.
4. Defina a população CD34⁺CD38^- (P6) usando a abordagem CD38 FMO validada por um controle isoclônico CD38.
5. Defina a população^baixa CD34⁺CD38 (P7) usando o nível negativo de hematógonos.
6. Defina a população^alta CD34⁺CD38 (P8) usando o nível de positividade do hematógono e o nível negativo de células plasmáticas (Figura 4).
7. Use o mesmo nível de limiar CD38^- em todo o grupo harmonizado, utilizando métodos robustos como CD38^- FMO ou controle isoclônico CD38.
8. Utilize pelo menos um imunofenótipo aberrante na fração CD34⁺CD38^- para definir células enriquecidas com LSC. Inclua marcadores de LSC como CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 ou marcadores de linhagem como CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Aplique os seguintes limiares: sensibilidade ao ensaio LOQ ^10-4 e LOD ^10-5; Positividade de LSC no diagnóstico ≥ 1% dos blastos CD45/SSC; e positividade dos LSC no acompanhamento de DRM ≥ 0,01% dos glóbulos brancos.

8. Relatório harmonizado de fluxo clínico

1. Forneça as seguintes informações em cada resultado: qualidade da medula óssea, estratégia usada para identificação de MRD, descrição do LAIP, LOD e LOQ, limiares e interpretação dos resultados.
2. Hemodilusão e representatividade da medula óssea
   1. Avalie a hemodilução de cada relatório clínico de fluxo de DRM para avaliar a robustez do resultado.
   2. Use um dos métodos de hemodilução descritos anteriormente quando aplicável (Tabela 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. Como abordagem complementar, calcule a representatividade da medula óssea usando a razão observada CD34/WBC45 em comparação com a razão esperada observada em amostras de medula óssea de referência (Figura 5).
   4. Use a seguinte fórmula:
      P: % de pureza = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: proporção de células MNC CD34⁺ no sangue periférico normal: 0,0005
      m: proporção de células MNC CD34⁺ na medula óssea normal: 0,035
      L: número de leucócitos WBC45⁺ na amostra de paciente com DRM
      n: número de células de CD34⁺ de MNC na amostra de paciente com MRD
   5. Relate a representatividade da medula óssea como uma avaliação de qualidade da amostra. Não use esse valor para normalizar os resultados da MRD.
   6. Interprete a representatividade da medula óssea da seguinte forma: 100% a 10%, baixa influência na proporção de células CD34⁺ da medula óssea; 10% a 1%, aviso para interpretação dos resultados da DRM; e < 1%, resultado não interpretável.
3. Quantificação das CSL no diagnóstico
   1. Relate o perfil usado para identificar células enriquecidas com LSC, por exemplo, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Relate os resultados das CSL no diagnóstico como a porcentagem observada dos blastos CD45/SSC.
   3. Use LSC ≥ 1% do total de blastos como limiar para um prognóstico ruim.
4. MRD de acompanhamento por LAIP/DfN
   1. Relate o perfil do LAIP usado para identificar MRD, por exemplo, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Relate a sensibilidade da análise como o valor menos sensível entre o limiar técnico e o valor de robustez observado para o perfil do LAIP em comparação com amostras de medula óssea de referência.
   3. Use um agrupamento mínimo de 50 células entre eventos WBC adquiridos como limite de quantificação. Por exemplo, com 500.000 células de glóbulos brancos, o LOQ é de 0,01% (1 × ^10-4).
   4. Relate os resultados do LAIP/DfN como positivos, negativos, detectáveis mas abaixo do limiar clínico ou não detectáveis.
   5. Reporte a positividade do LAIP/DfN como ≥ 0,1%, expressa como a porcentagem total de leucócitos CD45⁺ .
   6. Reporte negatividade do LAIP/DfN como < 0,1%.
   7. Para resultados detectáveis, porém abaixo do limiar, reporte o valor representativo e o limiar de sensibilidade.
   8. Para resultados não detectáveis, informe que o resultado é inferior ao limiar de sensibilidade à análise e adicione um comentário se necessário, como hemodilução, baixa especificidade de LAIP ou limiar técnico insuficiente.
5. MRD de acompanhamento pelo LSC
   1. Relate o perfil usado para identificar células enriquecidas com LSC, por exemplo, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Use um cluster mínimo de 20 células entre eventos de WBC adquiridos como limite de quantificação. Por exemplo, com 1.000.000 de células de glóbulos brancos, o LOQ é 0,002% (2 × ^10-5).
   3. Relate os resultados dos LSC como positivos, negativos, detectáveis mas abaixo do limiar clínico, ou não detectáveis.
   4. Reporte a positividade dos LSC como ≥ 0,01%, expressa como a porcentagem total de leucócitos CD45⁺ .
   5. Reporte negatividade dos LSCs como < 0,01%.
   6. Para resultados detectáveis, porém abaixo do limiar, reporte o valor representativo e o limiar de sensibilidade.
   7. Para resultados não detectáveis, informe que o resultado é inferior ao limiar de sensibilidade à análise e adicione um comentário se necessário, como hemodilução, baixa especificidade de LSC ou limiar técnico insuficiente.
6. Integre a interpretação do fluxo do MRD com os pontos de tempo anteriores do monitoramento. Indique a modulação do perfil fenotípico durante o tratamento e a dinâmica do fluxo de MRD, incluindo repositividade, aumento, estabilidade ou diminuição.
7. Encaminhe os resultados ao clínico e pesquisador solicitantes usando o relatório de fluxo clínico, de acordo com o período do laboratório de fluxo de referência.
8. Resuma o relatório harmonizado de fluxo clínico utilizando os seguintes itens: qualidade da medula óssea, estratégia de identificação de MRD, descrição do LAIP, LOD e LOQ, limiares e interpretação como MRD positivo, MRD negativo com valor de LOD ou MRD detectável, mas não quantificável.

Resultados

Espelhamento de plataforma

Para a comparação inicial de duas plataformas entre CANTO e NAVIOS, as configurações de voltagem foram ajustadas adquirindo contas arco-íris de 8 picos não compensadas para alcançar valores MFI alvo predefinidos. Os valores-alvo da plataforma CANTO de referência foram transpostos para a segunda plataforma NAVIOS usando a seguinte conversão: novo alvo MFI = alvo MFI de referência/256²². Para detectar viés entre plataformas, 10 amostras regenerativas de medula óssea de EDTA foram testadas em paralelo. O índice de coloração entre populações positivas e negativas foi comparado entre amostras e plataformas e mostrou separação comparável (Arquivo Suplementar-Figura S3).

Durante o estudo, as plataformas foram progressivamente atualizadas de configurações de 8 e 10 cores para configurações LYRIC e DxFLEX de 12 e 13 cores (Arquivo Suplementar 1). O espelhamento foi estendido por quatro plataformas usando contas arco-íris de 8 picos e medula óssea saudável manchada adquirida com o mesmo painel. A sobreposição de picos foi verificada ajustando apenas as escalas logarítmicas de representação. Após aplicar as configurações definidas, os padrões de coloração das células se sobrepunham, sendo a principal diferença a translação das nuvens celulares ao longo das escalas logarítmicas (Figura 6 e Ficha Suplementar S4 e Figura S5).

Avaliação de qualidade e reprodutibilidade em laboratórios de fluxo

Após a implementação do procedimento operacional padrão inicial e suas atualizações durante as atualizações da plataforma, a avaliação de qualidade externa (EQA) úmida foi realizada regularmente usando amostras frescas de medula óssea de referência compartilhadas entre os centros participantes. O Wet EQA foi usado para verificar o procedimento de laboratório úmido, configurações da plataforma e a estratégia comum de análise de gates. As populações relatadas incluíam células MNC CD34⁺ no denominador WBC CD45⁺ e células P6 CD34⁺CD38⁻ no denominador WBC CD45⁺ . Os resultados foram analisados por escores z e/ou representação gráfica (Figura 7).

Cinco rodadas de EQA úmida foram realizadas desde 2017, com 22, 15, 17, 26 e 25 laboratórios participantes, respectivamente. Para células %CD34⁺CD38⁻ em células de glóbulos brancos CD45⁺ e %MNC CD34⁺ em leucócitos CD45⁺, os resultados foram os seguintes: EQA1, valores médios 0,015% e 1,01% (SD 0,09% e 0,24%); EQA2, 0,09% e 1,02% (DE 0,046% e 0,36%); EQA3, 0,097% e 1,46% (SD 0,024% e 0,32%); EQA4, 0,024% e 2,16% (SD 0,015% e 0,59%); e EQA5, 0,027% e 1,9% (DE 0,008% e 0,45%).

Para abordar a padronização da estratégia de análise de MRD em vários centros, a EQA úmida foi complementada por EQA seca usando arquivos FCS compartilhados para diagnóstico, acompanhamento de MRD e referência para medula óssea. Mais de 90% dos dados analisados localmente foram incluídos dentro do intervalo centralizado baseado na média da série ± 2 DS: 95,6% e 91,3% para o DryEQA2017, com 22 dos 23 laboratórios participantes, e 100% para o DryEQA2024, com 24 dos 25 laboratórios participantes (Figura 8). Duas rodadas de EQA seca foram realizadas para %MRD LAIP em glóbulos brancos CD45⁺ e %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ em leucócitos CD45⁺. A DryEQA2017 apresentou um valor médio de LAIP de 11,9% (DS 1,35%) e um valor médio de LSC de 0,16% (SD 0,05%). A DryEQA2024 apresentou um valor médio de MRD LAIP de 0,35% (DS 0,26%) e um valor médio de MRD LSC CD34⁺CD38⁻ de 0,18% (SD 0,06%).

Exemplo de medição de fluxo multimodal AML MRD usando estratégias LAIP/DfN e LSC

Para quantificar a DRM, três abordagens foram usadas sistematicamente. A primeira abordagem estabeleceu a cartografia LAIP de blastos leucêmicos no diagnóstico usando o gating booleano, e essa cartografia foi aplicada a amostras de medula óssea de acompanhamento (Figura 9A). A segunda abordagem utilizou a análise DfN para identificar células anormais com padrões de expressão atípicos não observados em áreas de "caixa vazia" definidas a partir da diferenciação mieloide normal (Figura 9B). A terceira abordagem quantificou células enriquecidas com LSC na fração CD34⁺CD38⁻ usando marcadores dicotômicos de LSC e portamento booleano (Figura 10).

Amostras de medula óssea de referência

Foram estudadas um total de 135 amostras de medula óssea de referência, incluindo 25 amostras de medula óssea doadora saudável, 34 amostras inflamatórias de medula óssea e 76 amostras regenerativas. Medula óssea saudável de doador foi obtida de doadores saudáveis, com idade mediana de 31 anos e faixa de 21 a 49 anos. Medula óssea inflamatória foi obtida de pacientes encaminhados para citopenia, incluindo anemia, neutropenia ou trombopenia, com aspirações de medula óssea sem malignidade hematológica; A idade mediana era de 52 anos, com uma faixa de 25 a 82 anos. A regeneração da medula óssea foi obtida durante o acompanhamento da LMA em diferentes momentos de quimioterapia, incluindo após indução ou consolidação, com negatividade da avaliação molecular de MRD para transcritos NPM1 ou CBF; A idade mediana era de 54 anos, com faixa de 18 a 65 anos.

A qualidade dessas amostras foi validada por exame microscópico. A porcentagem teórica esperada de células CD34⁺ em amostras de medula óssea não diluídas também foi calculada usando a fórmula de Brooimans, com resultados >90% para todas as amostras. Essas amostras foram usadas para estabelecer limiares para análises LAIP/DfN e LSC, além de calcular a fórmula de hemodilução e pureza. A variação da MFI de marcadores de expressão de acordo com o status da medula óssea foi estudada para amostras saudáveis de doador, inflamatórias e regeneradoras (Arquivo Suplementar - Figura S6). Foram determinados valores de referência para os parâmetros mais relevantes, incluindo %MNC CD34⁺ de WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ em MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim em MNC CD34⁺, e %P8 CD34^{+CD38 alto} em MNC CD34⁺ (Figura de Arquivo Suplementar S6).

Avaliação da sensibilidade e linearidade

A sensibilidade foi avaliada para portas específicas de LAIP/DfN e LSC medindo o número de eventos anormais em um conjunto de amostras de medula óssea de referência, incluindo regeneração, inflamatória e medula óssea doadora saudável. A diluição serial de um número conhecido de blastos em medula óssea saudável foi usada para verificar o limite de quantificação e a linearidade da medição de MRD (Figuras 11 e Figura 12).

Figura 1: Estratégia de gate para análise de LAIP MRD em LMA usando marcadores primitivos (CD34⁺/CD117⁺) no Tubo 1. Primeira linha: barragem sequencial do tempo, células vivas baseadas em FSC versus SSC, células individuais baseadas em FSC-W versus FSC-H, CÉLULAS GLÓBULAS CD45⁺ no CD45 versus SSC, blasts no^{CD45 dim}/SSC, células mononucleares (MNC) no FSC-A/SSC-A, células MNC CD34⁺ no gráfico CD45 versus CD34, e a porta marcadora primitiva no gráfico CD34 versus CD117. Segunda e terceira linhas: gráficos de pontos biparamétricos fixos usados para definir os portões LAIP mais relevantes (LAIP1–LAIP8). O MRD LAIP foi definido usando a seguinte estratégia booleana: tempo E células vivas E células individuais E (blastos OU MNC CD34⁺) E marcadores primitivos (CD34^+/−CD117^+/−) E LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8. No caso ilustrado, a DRM representou 6,8% dos glóbulos brancos CD45⁺, em comparação com 0,04% ± 0,03 na medula óssea saudável. Direita: back-gating do portão final MRD usado para quantificação, permitindo a limpeza de eventos inespecíficos, eritroblastos e detritos. Abreviações: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = doença residual mensurável; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; FSC = dispersão direta; SSC = dispersão lateral; WBC = glóbulos brancos; MNC = células mononucleares; hBM = medula óssea saudável. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Estratégia de gating para análise de LAIP de MRD em LMA utilizando blastos maduros (CD34⁻CD117⁻) no Tubo 3. Primeira linha: filtração sequencial do tempo, células vivas baseadas em FSC versus SSC, células individuais baseadas em FSC-W versus FSC-H, CÉLULAS GLÓBULAS CD45⁺ em CD45 versus SSC, blasts em^{CD45 dim}/SSC, células mononucleares (MNC) em FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ no gráfico CD45 versus CD34, e a barreira madura no gráfico CD34 versus CD117.
Segunda e terceira linhas: gráficos de pontos biparamétricos fixos usados para definir os portões LAIP mais relevantes (LAIP1–LAIP8). O MLD LAP foi definido usando a seguinte estratégia booleana: tempo e células vivas e células individuais e blastos e blastos CD34⁻CD117⁻ BLASTOS E LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8. No caso ilustrado, a DRM representou 15% dos glóbulos brancos CD45⁺, em comparação com 0,09% ± 0,02 na medula óssea saudável.
Direita: back-gate da porta MRD final usada para quantificação, permitindo a limpeza de eventos não específicos. Abreviações: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = doença residual mensurável; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; FSC = dispersão direta; SSC = dispersão lateral; WBC = glóbulos brancos; MNC = células mononucleares; hBM = medula óssea saudável. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Estratégia de acesso para células-tronco hematopoiéticas normais (nHSCs) e células enriquecidas com células-tronco leucêmicas (LSC) na fração CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). (A) Células-tronco hematopoiéticas normais (nHSCs) e (B) células enriquecidas com células-tronco leucêmicas (LSC) na fração CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). Primeira linha: bloqueio sequencial do tempo, células vivas baseadas em FSC versus SSC, células individuais baseadas em FSC-W versus FSC-H, CÉLULAS GLÓBULAS CD45⁺ em CD45 versus SSC, blasts em CD45dim/SSC, células mononucleares (MNC) em FSC-A/SSC-A e células MNC CD34⁺ no gráfico CD45 versus CD34.
Segunda para quarta linha: gráficos de pontos biparamétricos fixos usados para definir P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^baixo) e P8 (CD34⁺CD38^alto), juntamente com os marcadores dicotômicos LSC mais relevantes, incluindo MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 e CD45RA. O MRD LSC foi definido usando a seguinte estratégia booleana: tempo E células vivas e células individuais e blasts E MNC CD34+ E P6 E (P6 LSC MIX⁺ OU P6 LSC CD123⁺ OU P6 LSC CD45RA⁺).
À direita: back-gate da porta final do MRD LSC usada para quantificação, permitindo a limpeza de eventos inespecíficos.
(A) nHSCs em uma amostra saudável de medula óssea: nHSCs (eventos roxos) foram CD34⁺CD38⁻, ^MIX− (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ e CD90⁺. A fração de nHSC CD34⁺CD38⁻ representou 0,02% dos glóbulos brancos CD45⁺, e as células LSC CD34⁺CD38⁻ foram negativas. Os limiares de ensaio relatados foram LOQ 0,0001% e LOD 0,001%.
(B) Células enriquecidas com LSC em amostra de LMA: Células enriquecidas com LSC (eventos laranja) foram CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ e CD90⁺. A fração do CSL CD34⁺CD38⁻ representou 3,7% do ^CD45+ do CCL. Abreviações: nHSCs = células-tronco hematopoiéticas normais; LSC = célula-tronco leucêmica; MNC = células mononucleares; WBC = glóbulos brancos; SSC = dispersão lateral; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antígeno leucocitário humano-DR; LOQ = limite de quantificação; LOD = limite de detecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Definição do limiar CD38⁻ na população CD34⁺ usando o canal de fluorescência CD38 menos um (FMO). Primeira linha: gating de populações de referência, incluindo blastos em células CD45/SSC, células MNC CD19⁺ e células MNC CD34⁺ .
Segunda fileira: nível de sinal no canal FMO do CD38. A primeira linha mostra células de blast, a segunda mostra células MNC CD19⁺ e a terceira linha mostra células MNC CD34⁺ . A linha laranja indica o limiar que define a porta P6 CD34⁺CD38⁻ .
Terceira fileira: nível de sinal CD38 PE-Cy7. A primeira linha mostra células blasticas, a segunda mostra células MNC CD19⁺ com o nível de hematógono CD38 usado para definir P8 CD34^{+CD38 alto}, e a terceira linha mostra células MNC CD34⁺, com P6 CD34⁺CD38⁻ em laranja, P7 CD34⁺CD38^{células baixas} em verde e P8 CD34⁺CD38^alto Células em azul. Abreviações: FMO = fluorescência menos um; MNC = células mononucleares; SSC = dispersão lateral; PE-Cy7 = ficoeritrina-cianina 7; P6 = CD34+CD38− fração; P7 = CD34+CD38 fração baixa; P8 = CD34+CD38 fração alta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Avaliação da representatividade da amostra de medula óssea com base em células MNC CD34⁺ . (A) Estratégia de gating para células MNC CD34⁺ e parâmetros usados no cálculo da fórmula: n, número de células MNC CD34⁺ ; L, número ^{de células} CD45+ de WBC; s, proporção de células MNC CD34⁺ no sangue periférico normal; e m., proporção de células MNC CD34⁺ observadas na medula óssea normal de referência. (B) Representação esquemática do impacto da diluição da medula óssea (BM) pelo sangue periférico (PB) na origem das células CD34⁺ em amostras de BM. (C) Critérios usados para interpretar a pureza do BM. Abreviações: BM = medula óssea; PB = sangue periférico; MNC = células mononucleares; WBC = glóbulos brancos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Comparação dos padrões de expressão entre quatro plataformas de citômetros de fluxo.
Uma amostra de medula óssea normal (BM) foi testada simultaneamente em quatro plataformas de citômetros, usando as configurações definidas para cada plataforma e ajuste da escala. A primeira linha mostra células MNC no gráfico de pontos CD45/CD33; a segunda linha mostra células MNC no marcador primitivo CD34/CD117 dot plot; a terceira linha mostra células blast no gráfico de pontos CD34/CD38; e a quarta linha mostra células P6 CD34⁺CD38⁻ no gráfico de pontos CD45RA/CD90. Abreviações: BM = medula óssea; MNC = células mononucleares; P6 = fração CD34⁺CD38⁻ . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Reprodutibilidade de EQA em laboratório úmido entre laboratórios de escoamento participantes. (A) Gráfico de violino mostrando a distribuição das células %P6 CD34⁺CD38^{− em células de} CD45+ de WBC entre as cinco rodadas de EQA em laboratório úmido e laboratórios de fluxo participantes. (B) Gráfico de violino mostrando a distribuição das células %MNC CD34^{+ nas células} CD45+ do WBC nas cinco rodadas de EQA em laboratório úmido e nos laboratórios de fluxo participantes. Abreviações: EQA = avaliação externa de qualidade; P6 = CD34+CD38− fração; WBC = glóbulos brancos; MNC = células mononucleares. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Avaliação de EQA seca da medição de LAIP/DfN e MRD do LSC. (A) Exercício de EQA2017 seco para medição de MRD do LAIP/DfN e LSC usando seis arquivos FCS compartilhados de um painel de 8 cores, incluindo diagnóstico de LMA, DMM de LMA e arquivos de referência de medula óssea normal para análise do LAIP do Tubo 1 e do LSC do Tubo 2. O exercício foi compartilhado com 23 laboratórios participantes. (B) Exercício EQA2024 seco para medição de LAIP/DfN e LSC MRD usando seis arquivos FCS compartilhados de um grupo de 12 cores, incluindo diagnóstico de LMA, DMM AML e arquivos de referência de medula óssea normal para análise do Tubo 1 LAIP e LSC do Tubo 2. O exercício foi compartilhado com 24 laboratórios participantes. (C) Comparação interplataforma de células %MNC CD34⁺ e células %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ em células WBC CD45⁺ medida durante EQA2025 úmida, compartilhada com 25 laboratórios participantes. Os valores esperados foram 1,6% para células MNC CD34⁺ e 0,02% para células nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ . Abreviações: EQA = avaliação externa de qualidade; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; DfN = diferente do normal; LSC = célula-tronco leucêmica; MRD = doença residual mensurável; FCS = padrão de citometria de fluxo; LMA = leucemia mieloide aguda; MNC = células mononucleares; nHSC = células-tronco hematopoiéticas normais; WBC = glóbulos brancos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Medição representativa de MRD usando abordagens LAIP/DfN. (A) Exemplo de medição MRD usando o método LAIP/DfN. O lado esquerdo mostra a cartografia LAIP das células leucêmicas na amostra de diagnóstico, e o lado direito mostra a aplicação da mesma cartografia LAIP na amostra de acompanhamento, com a população de MRD mostrada em preto. (B) Exemplo de medição de MRD usando o método DfN. Cada par de gráficos de pontos compara medula óssea saudável (hBM; normal, gráfico esquerdo) com uma amostra de medula óssea de acompanhamento da MRD (DfN, gráfico à direita). A área da "caixa vazia" é definida na medula óssea normal, e a presença de células leucêmicas nessa caixa vazia é avaliada na amostra de acompanhamento, com a população anormal mostrada em preto. Abreviações: MRD = doença residual mensurável; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; DfN = diferente do normal; hBM = medula óssea saudável. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Medição representativa de células enriquecidas com LSC CD34⁺CD38⁻ no diagnóstico e acompanhamento. (A) Exemplo de medição celular enriquecida com LSC em uma amostra de diagnóstico de LMA. O lado esquerdo apresenta o perfil enriquecido com LSC, com a população laranja expressando MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR e CD36 dentro da fração CD34⁺CD38⁻ .
(B) Amostra de acompanhamento do mesmo paciente mostrando persistência de células enriquecidas com MRD LSC com o mesmo perfil imunofenotípico (população laranja). Abreviações: LSC = célula-tronco leucêmica; LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = doença residual mensurável; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antígeno leucócito humano-DR. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 11: Sensibilidade analítica da detecção de CSL. (A) Avaliação do limite de blank (LOB) para detecção de CSL. O lado esquerdo mostra a quantificação dos eventos CD34⁺CD38⁻ em uma fusão de cinco arquivos FCS de cinco amostras de medula óssea saudáveis (5.148.000 eventos de WBC adquiridos). O lado direito mostra o número de eventos pertencentes ao portão booleano do LSC back-gate no gráfico de pontos CD45/SSC (14 eventos), correspondendo a um LOB de <0,0005% (5 × ^10-6). (B) Avaliação da linearidade para quantificação de LSC. O lado esquerdo mostra diluição em série por spik-in de células enriquecidas com LSC em uma amostra saudável de medula óssea. O lado direito mostra a correlação entre os valores de MRD medidos e valores teóricos, correspondendo a um limite de quantificação (LOQ) de 2 × ^10-5 (0,002%). Abreviações: LSC = célula-tronco leucêmica; LOB = limite de branco; FCS = padrão de citometria de fluxo; WBC = glóbulos brancos; MRD = doença residual mensurável; LOQ = limite de quantificação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 12: Linha e faixa de quantificação da medição de LAIP de MRD. (A) Avaliação da linearidade para quantificação de LAIP de MRD por diluição serial de blastos com diferentes LAIPs em medula óssea saudável, mostrando a correlação entre valores de MRD medidos e valores teóricos, com LOQ variável de acordo com os diferentes LAIPs e LOQ <0,1%. (B) Faixa de quantificação de acordo com diferentes LAIPs. A linha vermelha indica o limiar clínico de 0,1%. O LOQ atingiu o limiar clínico para todos os LAIPs testados. Abreviações: MRD = doença residual mensurável; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; LOQ = limite de quantificação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Fluoro Chrome	Pico	LYRIC12c	Pico	DxFlex13c	Pico	NAVIOS10c	Pico	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
Educação Física	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tabela 1: Valores-alvo para cada plataforma usando contas arco-íris de 8 picos. Valores-alvo específicos são mostrados para cada plataforma de citômetro (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Os picos retidos foram escolhidos para ficarem próximos do MFI observado para células de explosão. Isso é particularmente importante para citômetros baseados em PMT, onde a intensidade do sinal não aumenta linearmente com o aumento da tensão PMT. Em contraste, em citômetros baseados em APD, a intensidade do sinal aumenta linearmente com o ganho, permitindo que o mesmo pico seja usado para todos os detectores, enquanto picos diferentes são necessários para cada canal nos citometros baseados em PMT. Abreviações: MFI = intensidade mediana de fluorescência; PMT = tubo fotomultiplicador; APD = fotodiodo de avalanche. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

Educação Física

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tubo 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Flexível Mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

Educação Física

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tubo 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Flexível Mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

Educação Física

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Flexível Mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

Educação Física

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13C

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13C

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Flexível Mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tabela 2: Configurações de painéis de anticorpos para análise LML, MRD, LAIP/DfN e LSC. A tabela resume as configurações de painéis de 8, 10, 12 e 13 cores de acordo com a plataforma do citômetro. O tubo 1 é usado para análise LAIP/DfN, o tubo 2 para análise celular enriquecida com LSC CD34⁺CD38⁻ , e o tubo 3 para marcadores de diferenciação monocítica/granulocítica. Volumes de anticorpos e atribuições de fluorocromo são mostrados para cada plataforma. MIX3 corresponde ao CD97, TIM3 e CLL1. Abreviações: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = doença residual mensurável; LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; DfN = diferente do normal; LSC = célula-tronco leucêmica; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Perda completa dos marcadores normalmente expressos em precursores mieloides

CD13++CD33-/CD34+ ou CD117+

CD13-CD33++/CD34+ ou CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Expressão cruzada de marcadores linfoides em precursores mieloides

CD7+CD13+/CD34+ ou CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ ou CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ ou CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ ou CD117+

CD19+CD117+/ ou CD13+ ou CD33+

Superexpressão nos precursores mieloides

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Diminuição da expressão em precursores mieloides

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabela 3: Definições de "caixa vazia" baseadas em LAIP. A tabela lista padrões pré-definidos de "caixa vazia" diferentes do normal (DfN) usados para identificar populações anormais de precursores mieloides. As categorias incluem perda completa de marcadores normalmente expressos, expressão de marcadores linfoides entre linhagem, superexpressão de marcadores e diminuição da expressão de marcadores em precursores mieloides. Abreviações: LAIP = imunofenótipo associado à leucemia; DfN = diferente do normal. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Pureza da medula óssea = (1 − (GRMO/GR SG) x (GB SG/GB MO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Loken et al.18	CD16alto < 30%
Theunissen et al.20; Dworzak et al.21
Fluxo ou Ctr DIL citológico: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
Pureza do BM %: MNC 34+/WBC45+	Pureza do BM 100-10%

Tabela 4: Métodos de controle de diluição da medula óssea para o relato de fluxo de MD de LMA. A tabela resume métodos publicados de diluição e representatividade da medula óssea que podem ser usados para relatórios clínicos de fluxo de DMM de LMA. Pelo menos um método de diluição-controle deve ser aplicado para apoiar a interpretação dos resultados da DRM. A abordagem de pureza da medula óssea CD34/WBC45⁺ está incluída como uma avaliação complementar de qualidade. Abreviações: LMA = leucemia mieloide aguda; MRD = doença residual mensurável; BM = medula óssea; WBC = glóbulos brancos; CD34/WBC45⁺ = células CD34⁺ entre glóbulos brancos CD45⁺ . Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Contexto adicional, harmonização de plataformas, referência da medula óssea e materiais de suporte prognóstico. Este arquivo suplementar contém figuras e tabelas de suporte relacionadas à identificação de LSC, heterogeneidade fenotípica de LMA, espelhamento interplataforma, otimização específica para plataforma, perfis de referência de marcadores de medula óssea, evolução longitudinal em painéis e o limiar prognóstico usado para quantificação de LSC no diagnóstico. Esses materiais fornecem contexto adicional para o fluxo de trabalho multicêntrico da citometria de fluxo MRD, incluindo a justificativa para a avaliação de células enriquecidas com LSC CD34⁺CD38⁻ , a base técnica para harmonização de plataformas e dados de suporte usados para interpretar o fundo da medula de referência, migração de painéis e seleção de limiares clínicos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Etapas críticas do protocolo

A qualidade da amostra é crucial para a quantificação precisa de MRD e LSC. Amostras frescas de medula óssea devem ser transportadas em temperatura ambiente e processadas idealmente entre 24 e 48 horas e, se necessário, dentro de 72 horas após a^{coleta 23}. A hemodilução deve ser avaliada em cada momento e incluída no relatório clínico de fluxo. O clínico deve especificar o período do tratamento, por exemplo, após indução, consolidação, imunoterapia direcionada, tratamento menos intensivo como azacidinina/venetoclax ou aloenxérvio. O cenário de diferenciação está intimamente relacionado ao tratamento e ao ponto de tempo e é importante integrar na interpretação da MRD. Durante o acompanhamento longitudinal, a mesma sensibilidade do instrumento e confiabilidade da análise deve ser mantida por meio de verificações regulares dos valores-alvo com bolas de controle arco-íris, EQA regular e revisão colegial dos arquivos do FCS ao longo do estudo.

Um alto nível de padronização e confiabilidade intercentral da quantificação de fluxo de MRD é mantido por meio de treinamentos educacionais regulares baseados na web no grupo de fluxo. Pelo menos uma sessão de treinamento na web por mês foi realizada, e mais de 100 casos de quantificação de MRD LAIP/DfN, MRD LSC ou LSC diagnóstico foram discutidos e revisados durante esses anos. Essa educação continuada é importante porque interpretar dados de fluxo requer um biólogo altamente qualificado, especialmente para MRD de baixo nível, populações de fundo fisiológico, regeneração de medula e interruptores fenotípicos em tratamento.

A quantificação de populações enriquecidas com LSC em CD34⁺CD38⁻ é outro passo crítico. Não existe um marcador universal para capturar células-tronco hematopoéticas normais ou LSCs. O grupo HOVON introduziu o monitoramento de LSC no diagnóstico e acompanhamento de LMA usando um painel de 8 cores, incluindo um conjunto de marcadores relevantes de LSC^{"dicotômicos" 3}. Marcadores dicotômicos são definidos como não mostrando expressão em células-tronco hematopoéticas normais, mas expressão positiva em populações ricas em LSC, com padrões escuros, intermediários, altos, heterogêneos ou bimodais. Há interesse em incluir uma mistura de marcadores dicotômicos específicos de LSC, como CLL1, TIM3 e CD97, em um único canal, pois se apenas um for positivo, células enriquecidas com LSC ainda podem ser detectadas. Outros marcadores devem ser usados separadamente em canais específicos, pois sua expressão pode se sobrepor à das células-tronco hematopoiéticas normais, dependendo do estado da medula óssea, incluindo a medula²⁴ regenerada ou estressada. A definição completa de células enriquecidas com LSC baseia-se em operadores booleanos, incluindo a expressão aberrante de marcadores na fração CD34⁺CD38⁻ . Como essa ainda é uma definição fenotípica, a população deve ser interpretada como células enriquecidas em CSL CD34⁺CD38⁻ , e não como CSL funcionalmente comprovadas em todas as amostras. Este painel LSC também é aplicável em pacientes com MDS com excesso de blastos e AML MRC usando o mesmo protocolo.

Modificações e solução de problemas do método

Durante a evolução de plataformas e painéis, a abordagem de padronização/harmonização deve ser mantida dentro da rede laboratorial, especialmente ao passar de painéis de 8 a 10 cores para painéis de 12 a 13 cores. Com a evolução das máquinas, é necessário manter uma espinha dorsal comum de anticorpos e a mesma sensibilidade na detecção de anomalias fenotípicas ao longo dos estudos clínicos. Durante a evolução da plataforma, os fluorocromos dos anticorpos na espinha dorsal permanecem estáveis e comuns em todas as máquinas (CD34/CD38/CD45/CD117). No entanto, para alguns canais, é necessária a mudança dos fluorocromos devido ao banco óptico específico da máquina, o que requer uma abordagem de harmonização. Ao trocar de um citômetro detector PMT para um citômetro detector APD, a alta sensibilidade dos detectores APD em comprimentos de onda altos deve ser considerada. Portanto, em alguns casos, a escolha dos fluorocromos para certos anticorpos deve ser ajustada para manter o mesmo índice de coloração e evitar disseminação excessiva entre canais, adotando assim uma abordagem de otimização. Os citômetros clínicos atuais suportam painéis de 12 a 13 cores, aumentando a especificidade na detecção de LAIP e melhorando a interpretação por meio da adição de marcadores que eliminam células contaminantes na porta MRD. No entanto, isso também aumenta a complexidade da análise²³.

A atualização de painéis de 8 cores para 12 cores melhorou a sensibilidade e especificidade da avaliação de DRM em alguns casos (Arquivo Suplementar 1). No Tubo 1, foram adicionados HLA-DR, CD36, CD10 e CD56, separados do CD7. No Tubo 2, foram adicionados HLA-DR, CD36, CD200 e CD19. No Tubo 3, CD4, CD64, CD38, CD36 e CD14 foram adicionados. HLA-DR, agora sistematicamente combinado com CD38 em cada tubo, fornece uma definição mais clara de LAIP e padrões de diferenciação alterados. CD36, agora sistematicamente incluído em cada tubo, é um marcador chave para identificar eritroblastos, glóbulos vermelhos, plaquetas e detritos, além de refinar a porta final MRD. CD19 no tubo LSC também ajuda a identificar hematógonos. Combinar marcadores de diferenciação de monócitos e granulócitos em um único tubo permite melhor delineação dos padrões de diferenciação monocítica e granulocítica e ajuda a distinguir aberrâncias para identificar o LAIP. Ao passar de painéis de 8 cores para 10 cores, a principal melhoria veio da detecção de LAIP, especialmente com a adição de HLA-DR e CD56 separados do CD7 no Tubo 1 e HLA-DR e CD19 no Tubo 2. Ao passar dos painéis de 10 para 12 cores, a melhoria veio da melhor limpeza das comportas de jateamento e LSC, com a adição do CD36 em cada tubo, completando o CD10 no Tubo 1 e o CD200 no Tubo 2. Isso foi particularmente útil para pacientes com DMR de baixo nível acima do limite de detecção, mas abaixo do limite de quantificação. Em conjunto, a maioria dos pacientes com positividade de DRM no limiar clínico ≥ 0,1% já havia sido identificada com o painel de 8 cores; no entanto, o uso de mais marcadores nos tubos melhorou a especificidade e a interpretação da avaliação de MRD, especialmente para MRD de baixo nível, conforme mencionado nas diretrizes ELN 2025.

Limitações do método

Escolher uma abordagem multicêntrica pode ser desafiador. A viabilidade desse conceito exige passos obrigatórios antes de implementar o fluxo de MRD em ensaios clínicos de LMA: harmonização da sensibilidade do instrumento e preparação da amostra, e treinamento e educação sistemática para operadores^{analíticos 25}. À medida que as plataformas evoluem, a estratégia multicêntrica e multiplataforma deve ser adaptada para manter a robustez e reprodutibilidade dos resultados. Isso inclui padronização, uso do mesmo painel e configurações para o mesmo tipo de plataforma; harmonização, usando o mesmo painel em múltiplas plataformas com configurações harmonizadas; e otimização, usando um painel e configurações específicas adaptadas a cada plataforma.

A hemodilução é um dos pontos mais desafiadores e críticos para a quantificação do fluxo de MRD. A fórmula de representatividade CD34/WBC descrita neste protocolo deve ser usada como medida complementar de controle de qualidade para a amostra de medula óssea e não deve ser usada para normalizar os resultados de MRD. Sua interpretação pode ser afetada pela regeneração da medula, efeitos do tratamento, doença residual e regimes menos intensivos. Da mesma forma, marcadores como CD56, CD123 e CD45RA não devem ser interpretados como marcadores DfN ou LSC independentes. Elas devem ser interpretadas dentro da estratégia completa de portamento, comportas de limpeza, histórico de referência da medula óssea e contexto clínico.

Importância do método em relação a métodos existentes ou alternativos

De acordo com as diretrizes ELN 2025, a DRM é um importante marcador prognóstico em pacientes com LMA, independentemente da técnica ou do momento da avaliação. O uso de diferentes técnicas e marcadores de fluxo MRD é altamente complementar. A DRM multimodal, incluindo análise LAIP/DfN e LSC, é útil desde que a análise seja realizada dentro de uma rede padronizada com relatórios harmonizados dos resultados. A avaliação da DRM permite uma definição melhor da resposta terapêutica e da recaída. O fluxo de MRD multicêntrico e multimodal, juntamente com a MRD molecular, desempenhará um papel estratégico em futuros ensaios clínicos dentro de um cenário terapêutico cada vez mais complexo, que inclui novas terapias direcionadas, tratamentos de primeira e segunda linha, transplante alogênico e terapias de baixa intensidade.

Importância e possíveis aplicações do método em áreas específicas de pesquisa

Os grupos HOVON e ALFA relataram que a quantificação de populações enriquecidas com CD34⁺CD38⁻ enriquecidas com LSC no diagnóstico de LMA tem impacto clínico (Arquivo Suplementar 1). Parece crucial definir limiares clinicamente significativos para as CSL com base no método de quantificação. Como relatado anteriormente usando o método descrito aqui, um limiar de LSC de ≥1% estava associado a um resultado desfavorável (Arquivo Suplementar 1)²⁶. No manejo da LMA, a integração diferencial da MRD, monitoramento do LSC e hematopoiese clonal pode ajudar a refinar a interpretação terapêutica. O principal desafio está em distinguir a MRD, que pode exigir tratamento adicional, de clones pré-leucêmicos estáveis, que podem não ser²⁷. Um sistema integrado de reporte para calcular a porcentagem de blastocrosis foi recentemente recomendado para o acompanhamento da LMA nas diretrizes EHA/ELN 2025²⁸. Ele integra os resultados da MRD com comparação morfológica para uma avaliação harmonizada dos blastos e deve facilitar relatos consistentes em ensaios clínicos para definir categorias de resposta em pacientes com LMA.

Tanto o estudo HOVON quanto o estudo ALFA/FILO BIG1 mostram que uma pontuação que combina abordagens LAIP/DfN e LSC permitiu que os pacientes fossem classificados em quatro grupos: ^LAIP−/^LSC−, ^LAIP+/LSC⁻, ^LAIP−/LSC⁺, e ^LAIP+/^LSC+, com diferentes taxas de sobrevivência geral^{a 3 anos 3,26,29}. No geral, esses resultados ilustram o impacto clínico prognóstico do status combinado MRD LAIP/DfN e LSC. No contexto do transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas, a presença de células enriquecidas com LSC CD34⁺CD38⁻ também foi relatada como preditor de falha pós-transplante, mesmo quando o número total de blastos é inferior a 5%³⁰. Esses dados clínicos apoiam a relevância das estratégias combinadas de fluxo de MRD, mas o protocolo atual foca na padronização do fluxo de trabalho técnico e dos relatórios entre os centros.

Sob o ponto de vista, a tecnologia de fluxo espectral pode expandir o painel de marcadores testados simultaneamente em uma abordagem de citometria de fluxo multidimensional, aumentando assim a especificidade dos LAIPs monitorados e reduzindo o ruído biológico de fundo da regeneração hematopoiética. A avaliação da reprodutibilidade do fluxo espectral entre plataformas, painéis e centros, conforme proposto aqui, será desafiadora para a implementação clínica. Novos algoritmos de análise não supervisionada, incluindo FlowSOM, t-SNE e UMAP, podem facilitar a discriminação entre a hematopoiese normal e o compartimento leucêmico, desde a fração enriquecida com LSC CD34⁺CD38⁻ até o volume do blast. Capturar frações de LSC de forma mais profunda pode ajudar a melhorar o monitoramento do enxerto em modelos de xenoenxertos derivados de pacientes^31,32. Grupos de trabalho ELN foram estabelecidos para validar e harmonizar essas novas^{abordagens 33,34}.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Número do Catálogo
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Número do Catálogo
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500