Identificação baseada em aprendizado de máquina de genes associados à resistência ao tamoxifeno e sua aplicação na modelagem prognóstica do câncer de mama

Resumo

Desenvolvemos uma assinatura de resistência ao tamoxifeno derivada de seis genes derivada de aprendizado de máquina que está stratificando pacientes com câncer de mama por risco de sobrevivência e pode apoiar a avaliação prognóstica personalizada e a tomada de decisões terapêuticas na prática clínica.

Resumo

O tamoxifeno é uma terapia endócrina chave para câncer de mama receptor de estrogênio (^ER+), mas a resistência adquirida limita a eficácia a longo prazo. Os mecanismos moleculares permanecem complexos, e os biomarcadores preditivos são insuficientes. Dados de expressão gênica relacionados à resistência ao tamoxifeno foram obtidos a partir do GEO (GSE67916), e genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados usando o algoritmo limma. Análises de enriquecimento funcional (GO e KEGG) revelaram envolvimento em processos imunológicos, respostas antivirais, endocitose, vias dos lisossomos e sinalização de estrogênio. Três algoritmos de aprendizado de máquina (LASSO, SVM-RFE e RF) identificaram seis genes hub (CAMK1D, CHAC1, KIAA0513, MED13, NDRG1, STXBP5). Um modelo prognóstico de risco baseado nesses genes foi construído usando dados TCGA-BRCA, estratificando efetivamente os pacientes em grupos de alto e baixo risco com sobrevivência geral significativamente diferente. O modelo demonstrou boa precisão preditiva (AUC = 0,70) e desempenho estável em análises ROC dependentes do tempo, validadas em uma coorte independente. Este estudo fornece uma assinatura genética robusta relacionada à resistência ao tamoxifeno e um modelo prognóstico multigênico, oferecendo novos insights sobre mecanismos de resistência e possíveis orientações para prognóstico e terapia individualizados no câncer de mama ^ER+ .

Introdução

O câncer de mama é o câncer mais comumente diagnosticado entre mulheres no mundo todo e continua sendo um dos principais fatores de morte associada ao^{câncer 1}. Com base no perfil molecular, aproximadamente 60-70% dos pacientes apresentam o subtipo receptor-receptor positivo de estrogênio (^ER+), que geralmente responde bem à terapia endócrina inicial. Entre vários agentes endócrinos, o tamoxifeno — um modulador seletivo do receptor de estrogênio (SERM) — tem sido há muito tempo o padrão de tratamento para o tratamento adjuvante e metastático do câncer de mama ER⁺ , melhorando significativamente os resultados de sobrevivência em ensaios randomizados^{de grande escala 2}.

Apesar de sua eficácia clínica comprovada, uma proporção substancial de pacientes eventualmente desenvolve resistência adquirida, levando à recorrência e progressão da^{doença 3}. Consequentemente, a resistência ao tamoxifeno representa um gargalo crítico no manejo a longo prazo do câncer de mama. Estudos anteriores indicam que os mecanismos que impulsionam a resistência são altamente heterogêneos, envolvendo sinalização aberrante do RE, ativação de vias alternativas de fatores de crescimento (por exemplo, PI3K/AKT, MAPK), desregulação da apoptose e reprogramação^{metabólica 4}.

Recentemente, o microambiente tumoral (TME), especialmente o microambiente imunológico, tem ganhado cada vez mais atenção por seu papel na resposta terapêutica e resistência. A infiltração de células imunes e a sinalização inflamatória estão intimamente ligadas à progressão do câncer de mama e à sensibilidade ao tratamento. Evidências emergentes sugerem que processos relacionados ao sistema imunológico podem modular as respostas de estresse celular e promover a evasão imunológica, contribuindo assim para a resistência^{endócrina 5}. No entanto, o cenário imunológico específico associado à resistência ao tamoxifeno ainda precisa ser totalmente esclarecido.

Com o advento do sequenciamento de alto rendimento e da bioinformática, a análise de dados transcriptômicos oferece uma abordagem poderosa para decodificar a base molecular da resistência a medicamentos. Comparados aos biomarcadores de um único gene, as assinaturas multigênicas capturam a heterogeneidade tumoral de forma mais eficaz, oferecendo estabilidade e precisão superiores no prognóstico. Algoritmos de aprendizado de máquina, como regressão LASSO, Máquinas de Vetores de Suporte (SVM) e Floresta Aleatória (RF), tornaram-se ferramentas essenciais para identificar biomarcadores robustos e construir modelos preditivos em medicina^{de precisão 6}. Embora várias assinaturas gênicas tenham sido propostas ^7,8,9, a validação robusta frequentemente é insuficiente.

Embora estudos anteriores tenham explorado genes de resistência ao tamoxifeno, poucos integraram sistematicamente múltiplas estratégias de aprendizado de máquina para construir um modelo prognóstico robusto validado em coortes independentes. Neste estudo, integramos dados transcriptômicos do GEO e TCGA para rastrear genes associados à resistência ao tamoxifeno. Ao aplicar um conjunto de algoritmos de aprendizado de máquina, identificamos genes centrais de resistência e construímos um modelo prognóstico de risco. Avaliamos ainda a associação do modelo com o microambiente imunológico e validamos seu valor preditivo em uma coorte independente, com o objetivo de fornecer novas evidências teóricas para estratégias de tratamento personalizadas.

Protocolo

Todos os dados utilizados neste estudo foram obtidos de bancos de dados públicos acessíveis (TCGA, GEO e METABRIC). Nenhum participante humano ou animal esteve envolvido; portanto, não era necessário aprovar o conselho de revisão institucional nem o consentimento informado.

Aquisição e pré-processamento de dados

Dados de expressão gênica relacionados à resistência ao tamoxifeno foram recuperados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO^{) 10}. O conjunto de dados GSE67916 (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array) inclui 18 amostras de células de câncer de mama: 8 amostras controle não tratadas e 10 amostras resistentes ao tamoxifeno geradas por exposição prolongada a medicamentos. Os dados de sequenciamento de RNA e as informações de acompanhamento clínico correspondentes para a coorte do Carcinoma Invasivo da Mama (TCGA-BRCA) foram baixados do The Cancer Genome Atlas (TCGA⁾¹¹.

Arquivos bruto de microarray CEL eram processados em R (versão 4.4.2) usando o pacote affy. A correção de fundo e a normalização foram realizadas com o algoritmo Robust Multi-array Average (RMA), incluindo transformação log2 e normalização quantil. Os IDs das sondas eram mapeados para símbolos de genes usando arquivos de anotação da plataforma; Para genes com múltiplas sondas, foi utilizado o valor médio de expressão. Para dados de RNA-seq do TCGA, os valores de transcritos por milhão (TPM) foram transformados log2 [log2(TPM + 1)]. Amostras com informações de sobrevivência incompletas ou com variáveis clínicas ausentes foram excluídas.

Identificação de genes diferencialmente expressos

A expressão diferencial entre amostras resistentes ao tamoxifeno e amostras controle foi avaliada usando o pacote limma^{R 12} com moderação empírica de Bayes. Genes com |log2 fold change| > 1 e um valor P ajustado < 0,05 (Benjamini–Hochberg FDR) foram definidos como genes diferencialmente expressos (DEGs).

Análise de enriquecimento funcional

Análises da Gene Ontology (GO)¹³e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)¹⁴ foram realizadas usando o pacote^{clusterProfiler 15} R. As categorias de GO incluíam processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF). Valores ajustados de P < 0,05 foram considerados significativos.

Seleção de recursos baseada em aprendizado de máquina

Três algoritmos de aprendizado de máquina foram aplicados para identificar genes hub: (1) regressão^{LASSO 16} (pacote glmnet) com validação cruzada 10 vezes para selecionar o parâmetro de penalidade ótimo (lambda.min); (2) Suporte à eliminação de características recursivas de vetores máquina e recursiva (SVM-RFE)¹⁷ (pacote e1071) com validação cruzada cinco vezes para identificar o subconjunto genético mínimo com menor erro de classificação; (3) Random forest (RF)¹⁸ (pacote randomForest) com 500 árvores (ntree = 500); os genes foram classificados pelo MeanDecreaseGini. Genes identificados pelos três métodos foram definidos como genes hub.

Construção do modelo de risco prognóstico

Um modelo prognóstico de risco multigênico foi construído usando dados de expressão gênica e sobrevivência do TCGA-BRCA. Genes associados à sobrevivência foram triados usando regressão de Cox univariada, seguida de regressão de Cox multivariada para desenvolver a assinatura final. A fórmula do escore de risco foi calculada como: Escória de risco = (0,01297 × CAMK1D) + (0,03021 × CHAC1) + (0,02018 × KIAA0513) + (0,00647 × MED13) + (0,00108 × NDRG1) + (0,04551 × STXBP5). Os pacientes foram estratificados em grupos de alto e baixo risco com base na pontuação mediana de risco.

Avaliação e validação do modelo prognóstico

As diferenças gerais de sobrevivência entre os grupos foram avaliadas com análise de Kaplan–Meier e o teste log-rank. O desempenho preditivo foi avaliado usando curvas ROC (pacote pROC) e análise ROC dependente do tempo (pacote timeROC). Um nomograma integrando escores de risco e variáveis clínicas foi construído usando o pacote rms. Curvas de calibração avaliaram a concordância entre as probabilidades de sobrevivência previstas e observadas. A validação externa foi realizada na coorte independente do Consórcio Internacional de Câncer de Mama (^{METABRIC) 19} , utilizando a mesma fórmula e corte.

Análise de infiltração imune

A infiltração de células imunes foi estimada usando CIBERSORT²⁰ com 1.000 permutações com base nos dados do TCGA. Amostras com P < 0,05 foram incluídas. As diferenças na composição das células imunes entre grupos de alto e baixo risco foram avaliadas com o teste de soma de ranks de Wilcoxon, e as correlações entre expressão do gene hub e abundância de células imunes foram avaliadas usando a correlação de rank de Spearman.

Análise estatística

Todas as análises foram realizadas em R. Variáveis contínuas foram comparadas usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon, e variáveis categóricas usando o teste qui-quadrado. P bilaterais < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Identificação de genes diferencialmente expressos associados à resistência ao tamoxifeno

Um total de 854 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados entre amostras resistentes e controladas ao tamoxifeno, incluindo 556 genes com regulação positiva e 298 genes com regulação negativa. A distribuição dos DEGs mostrou predominância de genes regulados para cima em amostras resistentes, sugerindo ativação transcricional extensa assoc...

Discussão

A resistência ao tamoxifeno continua sendo um obstáculo fundamental no tratamento do câncer de mama ^ER+ . Embora mecanismos como mutações no RE sejam bem conhecidos, as adaptações moleculares sistêmicas à terapia de longo prazo continuam sendo menos compreendidas. Neste estudo, integramos transcriptômica e aprendizado de máquina para identificar uma assinatura robusta de seis genes (CAMK1D, CHAC1, KIAA0513, MED13, NDRG1, STXBP5) que prevê tanto a resistência ao tamoxifeno quan...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pacote Affy	Bioconductor	-	Processamento de dados de microarray
Pacote clusterProfiler	Bioconductor	v4.4.2	Análise de enriquecimento de GO e KEGG
Algoritmo CIBERSORT	Newman et al.	-	Estimativa de infiltração de células imunes
Pacote e1071 (SVM-RFE)	CRAN	-	Eliminação recursiva de características por máquina de vetores de suporte
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	GSE67916	Conjunto de dados de resistência ao Tamoxifeno
Pacote glmnet	CRAN / Bioconductor	-	Regressão LASSO
Pacote limma	Bioconductor	-	Análise de expressão diferencial
Conjunto de dados METABRIC	cBioPortal / Curtis et al.	-	Coorte de validação
Pacote pROC	CRAN	-	Análise de curva ROC
Software R	R Core Team	v4.4.2	Ambiente de computação estatística
Pacote Random forest	CRAN	-	Algoritmo Random Forest
Pacote rms	CRAN	-	Construção de nomograma
Coorte TCGA-BRCA	The Cancer Genome Atlas (TCGA)	-	Dados de RNA-seq da coorte de treinamento
Pacote timeROC	CRAN	-	Análise ROC dependente do tempo