Imagem em Tempo Real de Dois Fótons do Metabolismo Endotelial do NAD+ em Camundongos

Resumo

Esse protocolo permite o monitoramento em tempo real do metabolismo endotelial da nicotinamida adenina dinucleotídeo cerebral em camundongos vivos, utilizando expressão de biossensores direcionados a endoteliais, preparação da janela craniana e imagem de dois fótons.

Resumo

Apresentamos um fluxo de trabalho reproduzível para visualização em tempo real das respostas do canal biossensorial de nicotinamida adenina dinucleotídeo (^NAD+) em células endoteliais microvasculares cerebrais em camundongos vivos, utilizando microscopia de dois fótons de janela craniana e um sensor fluorescente ^NAD+ direcionado para endotelial. O protocolo inclui (1) expressão seletiva ^{do sensor} NAD+ mediada pelo vírus adenoassociado (AAV) no endotélio cerebrovascular usando AAV-X1.1 sob o promotor Cdh5 (cadherina endotelial vascular), (2) preparação cirúrgica de uma janela craniana cortical estável de 3 mm × 3 mm, e (3) imagem de dois fótons de comprimento de onda duplo para capturar simultaneamente o sinal do canal sensor verde excitado por 920 nm e o tetrametilrodamina intravascular (TMR)–dextrano excitado por 1040 nm canal de referência. O canal TMR–dextrano fornece uma referência de lúmen vascular e apoia a seleção de vasos, avaliação de movimento e avaliação da integridade vascular. Como exemplo de aplicação, descrevemos alterações associadas a mononucleotídeos de nicotinamida na fluorescência dos canais sensoriais, após consumo de água, oral por gávage ou administração intravenosa. Este protocolo enfatiza passos críticos, considerações recomendadas de dosagem viral e título, soluções de problemas e estratégias de análise quantitativa, permitindo que laboratórios implementem monitoramento in vivo da dinâmica dos canais biossensorial de ^NAD+ cerebrovascular para estudos de neurometabolismo em saúde e doença. 

Introdução

O dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD⁺) é um cofator central para o equilíbrio redox, atividade mitocondrial, reparo do DNA e sinalização sensível ao estresse. Na vasculatura cerebral, a homeostase endotelial ^NAD+ é cada vez mais reconhecida como um regulador ativo da integridade da barreira, do tônus vascular e do acoplamento neurovascular, em vez de uma leitura metabólica^{passiva 1}. A perturbação do metabolismo endotelial do ^NAD+ tem sido associada ao vazamento da barreira hematoencefálica (BBB) associada ao envelhecimento e à homeostase neurovascular comprometida, destacando a necessidade de métodos que possam resolver a dinâmica metabólica endotelial diretamente no tecido cerebral^{vivo 2}.

A maioria das abordagens atualmente utilizadas para quantificar o ^NAD+ baseia-se em medições bioquímicas de desfechos, coloração de tecidos fixos ou leituras de sensores ex vivo. Embora informativas, essas abordagens não preservam a arquitetura microvascular intacta, não conseguem distinguir facilmente mudanças rápidas dentro do animal ao longo do tempo e oferecem especificidade limitada de tipo celular quando aplicadas a tecido cerebral heterogêneo. Em contraste, a imagem crônica de dois fótons da janela craniana permite a visualização repetida de microvasos corticais em camundongos vivos com alta resolução espacial e temporal, tornando-a bem adequada para monitorar sinais endoteliais metabolicamente responsivos sob intervenções fisiológicas ou farmacológicas^{definidas 3,4,5}.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho completo para monitoramento em tempo real da dinâmica endotelial do ^NAD+ cerebral in vivo. O método combina a entrega sistêmica de um sensor ^NAD+ baseado em proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), direcionado para endotelial, embalado no vírus adenoassociado (AAV)-X1.1 e acionado pelo promotor Cdh5, uma janela craniana estável de 3 mm × 3 mm para acesso óptico ^6,7,8, e imagens de dois fótons de comprimento de onda dupla com um canal de referência intravascular tetrametilrodamina (TMR)–^{dextrano 1}. O mecanismo do sensor foi esclarecido da seguinte forma: Cambronne et al. O biossensor citoplasmático NAD⁺ LigA-cpVenus é um sensor baseado em cpVenus de resposta inversa. A ligação ao ^NAD+ reduz a fluorescência semelhante ao cpVenus/eGFP na leitura padrão de excitação de 488 nm, enquanto um canal de excitação de 405 nm serve como referência para a normalização ratiométrica. Portanto, a fluorescência verde bruta não deve ser interpretada como uma medida positiva direta da concentração de NAD⁺. Nesta implementação de dois fótons, a excitação de 920 nm é usada para adquirir o sinal do canal sensor verde, enquanto a excitação de 1040 nm é usada para o canal vascular de referência TMR–dextran; Assim, a aquisição atual de 920/1040 nm não é equivalente a uma medição racional calibrada de 488/405 nm. O biossensor Cambronne et al. foi selecionado porque foi amplamente validado para monitoramento da dinâmica intracelular do ^NAD+ e é compatível com a configuração atual de imagem de duplo comprimento de onda. Embora indicadores mais recentes, como o FiNad, ofereçam abordagens alternativas para monitorar a dinâmica do ^NAD+, sua implementação exigiria modificação do canal de fluorescência vermelha atualmente usado para a marcação de referência vascular TMR–dextrano. O sensor Cambronne relata mudanças relativas na disponibilidade de ^NAD+ dentro de uma faixa dinâmica finita e foi validado em aplicações celulares e subcelulares; no entanto, a interpretação do sinal pode ser influenciada pelo nível de expressão, pH, fotobranqueamento e variabilidade do caminho óptico, e a quantificação absoluta de ^NAD+ requer calibração ou validação bioquímica ortogonal. AAV-X1.1 foi selecionado porque variantes endotelial-trópicas do AAV foram relatadas como capazes de transduzir eficientemente a vasculatura do sistema nervoso^{central 6,7}. Em nossa comparação preliminar de vários sorótipos de AAV, incluindo AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT e AAV-X1.1, utilizando expressão de proteína fluorescente verde aprimorada impulsionada por CAG ou Cdh5 como relator, AAV-X1.1 produziu o padrão de expressão mais favorável associado a vasculares entre os sorótipos testados. O promotor Cdh5 foi posteriormente usado para restringir ainda mais a expressão de transgenes a células endoteliais vasculares, consistente com relatos anteriores que demonstraram expressão seletiva de transgenes endotelianos in vivo⁶.

Comparado aos ensaios ex vivo NAD⁺, essa abordagem preserva a rede vascular intacta, possibilita medições longitudinais no mesmo animal e possibilita a avaliação simultânea dos sinais metabólicos endotelianos e de uma referência de lúmen vascular. O fluxo de trabalho é particularmente útil para estudos sobre envelhecimento, estresse inflamatório, disfunção da BBB e respostas rápidas a intervenções metabólicas como a administração de mononucleotídeos de nicotinamida (NMN⁾ 9,10,11,12,13. Esse método é mais apropriado quando a questão experimental requer visualização repetida de microvasos corticais em camundongos vivos e alterações relativas no sinal do canal sensorial endotelial. É menos adequado para quantificação absoluta de ^NAD+ sem calibração ratiométrica adicional ou validação bioquímica. Limitações práticas incluem acessibilidade óptica cortical, restrições de profundidade de imagem, dependência de transdução endotelial bem-sucedida do AAV, potencial inflamação associada à janela craniana e a necessidade de um microscópio de dois fótons de duplo comprimento de onda. A implantação crônica na janela craniana pode induzir inflamação local, reatividade vascular, gliose, opacidade ou remodelação tecidual, todos fatores que podem influenciar a fisiologia endotelial e as medições dos canais^{sensoriais1,3,4}. Para minimizar esses fatores de confusão, o protocolo exige cirurgia asséptica, perfuração intermitente com resfriamento frequente, hemostasia cuidadosa, evitação do contato adesivo com a dura-máter, analgesia pós-operatória, monitoramento diário e exclusão de animais com opacidade persistente, detritos inflamatórios, infecção, morfologia vascular instável ou baixa estabilidade do sinal de base.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciências da Saúde e Reabilitação no âmbito do projeto intitulado "Estudo Mecanicista da Observação Baseada em Sonda Metabólica da Integridade da Barreira Hématoencefálica" (número de aprovação KFDX: NO. 2023-1023). Realize todas as cirurgias sob condições assépticas e forneça analgesia perioperatória e cuidados de suporte conforme o protocolo animal aprovado. No fluxo de trabalho representativo, administre buprenorfina cloridrato (0,05–0,1 mg/kg, subcutâneo) antes ou imediatamente após a cirurgia e depois a cada 8–12 horas por 24–48 horas, conforme necessário. Recupere camundongos em uma gaiola aquecida e monitore-os até que a postura normal, o movimento espontâneo e a respiração estável sejam restaurados.

1. Visão geral experimental

1. Use camundongos adultos C57BL/6J com idades entre 10 e 12 semanas e pesando 23–25 g para os experimentos representativos.
2. Mantenha os camundongos sob condições específicas livres de patógenos, com um ciclo de 12 horas de luz/escuro, temperatura ambiente de 22°C–24°C, umidade relativa de 40%–60% e acesso ad libitum a comida e água.
3. Aclimate os animais por pelo menos 7 dias antes dos procedimentos.
4. Use qualquer um dos sexos conforme apropriado para o desenho experimental. Relate sexo, número de animais e alocação de grupos para cada experimento. O conjunto de dados representativo de imagem mostrado aqui usou N = 3 camundongos.
5. Administre primeiro o VA sistêmico e permita um período de expressão de 3 a 4 semanas antes da imagem.
6. Realize a cirurgia da janela craniana de 3 a 5 dias antes da imagem de imagem.
7. Anestesie os camundongos no dia da imagem de imagem, injete TMR–dextrano por via intravenosa e realize imagens após circulação adequada dos traçadores.
8. Administrar NMN de acordo com o cronograma de intervenção selecionado. Fornecer suplementação com água potável por 5 dias antes da imagem, realizar a manipulação oral no intervalo pré-definido antes da imagem ou administrar NMN intravenoso durante a sessão de imagem após a aquisição do ponto de partida.
   NOTA: Pause o protocolo após a administração de AAV durante o período de expressão de 3 a 4 semanas e mantenha os animais sob monitoramento de saúde rotineiro e condições padrão de moradia. Pause o protocolo após a cirurgia da janela craniana durante o período de recuperação de 3 a 5 dias. Antes de prosseguir com a imagem de imagem, confirme peso corporal estável, cuidado e atividade normais, ausência de infecção ou inflamação excessiva e uma janela craniana desobstruída.

2. Cirurgia da janela craniana para imagem cortical longitudinal

1. Preparação pré-cirúrgica
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e estabeleça um campo estéril antes da indução da anestesia.
   2. Ajuste o sistema de aquecimento homeotérmico para manter a temperatura corporal entre 36,5°C e 37,5°C, preferencialmente usando um controlador de realimentação de sonda retal.
   3. Prepare equipamentos de monitoramento respiratório e confirme a estabilidade da operação antes da cirurgia.
   4. Prepare soro fisiológico estéril, swabs absorventes, materiais hemostáticos, uma capa de vidro estéril No. 1.5, uma placa de metal e cimento dental antes de iniciar o procedimento.
   5. Use uma cobertura de vidro estéril nº 1.5 para cobrir completamente a janela craniana de 3 mm × 3 mm e fique alinhada na borda do crânio.
   6. Prepare uma microbroca de alta velocidade equipada com uma muela de 0,5–1,0 mm.
   7. Opere a broca aproximadamente metade da velocidade máxima e confirme que a irrigação estéril com soro fisiológico pode ser aplicada imediatamente durante o afinamento do crânio.
   8. Aplique soro fisiológico estéril em temperatura ambiente com um cotonete ou conta-gotas durante a perfuração para resfriar o crânio e remover a poeira óssea.
2. Anestesia, preparação do couro cabeludo e exposição do crânio
   1. Anestesiar camundongos com solução de trabalho de Avertin recém-preparada (1,25%, 12,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal a 200–250 mg/kg.
      1. Prepare a solução de trabalho de Avertin a partir de 2,2,2-tribromoetanol e 2-metil-2-butanol de acordo com os procedimentos operacionais padrão institucionais, proteja a solução da luz e descarte preparações que mostrem precipitação ou descoloração.
   2. Confirme um plano cirúrgico estável pela perda do reflexo de retirada do pedal e respiração estável.
   3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos imediatamente após a indução da anestesia.
   4. Se for usada anestesia por inalação, induza anestesia com isoflurano de 3% a 4%.
   5. Mantenha a anestesia com 1%–2% de isoflurano em oxigênio entre 0,5–1,0 L/min e ajuste de acordo com a respiração e os reflexos.
      ATENÇÃO: Manuseie agentes anestésicos de acordo com os procedimentos institucionais de segurança e utilize sistemas adequados de limpeza ao administrar anestesia por inalação.
   6. Fixe o mouse em uma estrutura estereotáxica ou suporte de cabeça personalizado que ofereça acesso estável ao crânio dorsal.
   7. Mantenha a temperatura corporal entre 36,5°C e 37,5°C usando uma almofada térmica controlada por feedback e uma sonda retal, quando disponíveis.
   8. Raspe o couro cabeludo e remova os pelos soltos do campo cirúrgico.
   9. Desinfete o couro cabeludo usando solução alternada de povidona-iodo ou iodóforo e etanol a 70% por três ciclos.
   10. Evite permitir que o desinfetante entre nos olhos ou na abertura craniana.
   11. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média e retraia suavemente a pele.
   12. Expor o crânio o suficiente para permitir tanto a criação da janela craniana quanto a fixação da placa da cabeça.
   13. Remova o periósteo e o tecido conjuntivo residual usando pinças finas ou uma lâmina de bisturi.
   14. Seque o crânio suavemente com cotonetes estéreis por aproximadamente 10–20 segundos até que a superfície pareça fosca em vez de úmida.
   15. Evite desidratação excessiva dos tecidos expostos.
3. Marcando uma craniotomia de 3 mm × 3 mm
   1. Identifique bregma e lambda sob o microscópio cirúrgico.
   2. Use esses marcos anatômicos para orientar a linha média e direcionar a região cortical.
   3. Marque um quadrado de 3 mm × 3 mm sobre um hemisfério do córtex somatossensorial dorsal.
   4. Posicione a borda anterior aproximadamente 0,5 mm posterior à bregma e a borda medial aproximadamente 1,0 mm lateral à linha média.
   5. Evite suturas grandes no crânio e grandes vasos superficiais sempre que possível.
4. Perfuração e remoção de retalhos ósseos
   1. Afine o crânio ao longo do perímetro marcado usando contato intermitente com perfuração em vez de pressão contínua.
   2. Aplique soro fisiológico estéril repetidamente durante a perfuração para evitar danos térmicos.
   3. Administre aproximadamente 20–50 μL de soro fisiológico estéril por aplicação, ou o suficiente para manter a superfície do crânio úmida e fresca.
   4. Repita a irrigação a cada 10–20 segundos ou sempre que houver acumulação de poeira óssea ou suspeita de acúmulo de calor.
   5. Continue afinando até que o osso fique uniformemente translúcido e levemente flexível.
   6. Confirme o afinamento adequado observando vasos durais visíveis, pulsação dural preservada e ausência de compressão cortical ou descoloração térmica.
   7. Pare de furar imediatamente se houver acúmulo excessivo de calor, sangramento ou pulsação dural reduzida.
   8. Regue a área e reavalie antes de continuar.
   9. Levante a aba óssea suavemente de um canto usando pinças finas ou a ponta da agulha.
   10. Afine novamente o perímetro se ainda houver resistência.
   11. Mantenha a dura-máter intacta durante a remoção do retalho ósseo.
   12. Enxágue o pó ósseo usando soro fisiológico estéril.
   13. Controle sangramentos leves usando irrigação suave com soro fisiológico e swabs absorventes.
   14. Considere o sangramento aceitável se ele desaparecer em 1–2 minutos após a irrigação e o contato com o swab absorvente.
   15. Exclua o animal ou interrompa o procedimento se o sangramento persistir por mais de aproximadamente 5 minutos.
   16. Exclua o animal ou interrompa o procedimento se a dura-madre estiver rompida, ocorrer compressão cortical ou o sangue obstruir a área de imagem.
       NOTA: O procedimento pode ser pausado temporariamente após a hemostasia completa e antes da colocação do coverslip. Mantenha a dura-máter exposta em estado úmido usando soro estéril e retome somente após confirmar a ausência de sangramento ativo.
5. Vedação de janelas e fixação da placa de cabeça
   1. Confirme que a dura-máter exposta está limpa, úmida e livre de sangramento ativo.
   2. Coloque uma cobertura estéril sobre a craniotomia.
   3. Posicione o coverslip na borda do crânio ao redor da craniotomia sem comprimir a dura-máter.
   4. Verifique o posicionamento correto confirmando uma superfície de cobertura enxague, ausência de bolhas de ar aprisionadas, pulsação dural preservada e um caminho óptico claro.
   5. Prepare cimento dental ou adesivo Super-Bond C&B conforme as instruções do fabricante.
      1. Para a preparação representativa Super-Bond C&B, misture 1 colher de pó com 1 gota de catalisador e 4 gotas de monômero em uma placa cerâmica pré-resfriada mantida a aproximadamente −20°C imediatamente antes da aplicação.
   6. Aplique adesivo apenas ao redor da borda externa do crânio ao redor da capa de cobertura.
   7. Evite contato adesivo com a dura-máter e evite que o capilar recue sob o vidro.
   8. Deixe o adesivo endurecer por aproximadamente 5–10 minutos em temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: Cimento dentário e componentes adesivos podem conter substâncias químicas voláteis ou irritantes. Manuse-os de acordo com os procedimentos de segurança institucionais e utilize ventilação adequada.
   9. Posicione uma placa de cabeça personalizada de titânio ao redor da janela craniana.
   10. Use uma placa de cabeça contendo uma abertura central de aproximadamente 10 mm compatível com o suporte de cabeça de imagem.
   11. Centralize a janela craniana dentro da abertura da placa da cabeça.
   12. Aplique cimento dental apenas nas regiões que tocam o crânio fora da janela óptica.
   13. Deixe o cimento endurecer completamente por aproximadamente 5 a 10 minutos antes de mover o animal.
6. Recuperação pós-operatória e controle de qualidade das janelas
   1. Administrar analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo animal aprovado.
   2. No fluxo de trabalho representativo, administre buprenorfina cloridrato de 0,05–0,1 mg/kg por via subcutânea a cada 8–12 horas por 24–48 horas.
   3. Recuperar ratos em uma gaiola aquecida.
   4. Monitore diariamente a respiração, postura, movimento, higiene e peso corporal.
   5. Aceite janelas cranianas que exibam superfície de vidro transparente, vasculatura cortical visível, dura-madre intacta, sangue residual mínimo, ausência de adesivo sob a capa de cobertura, sem infecção e fixação estável da placa da cabeça.
   6. Exclua animais com opacidade marcada, sangramento persistente, detritos inflamatórios, infecção, deslocamento de janelas, perda de peso severa (>15%) ou cuidados e atividades inadequados.
   7. Prossiga para a imagem após 3 a 5 dias de recuperação.
   8. Confirme atividade normal, comportamento normal de tosa, peso corporal estável, ausência de dor ou infecção, e uma janela craniana transparente com vasos claramente visíveis antes da imagem.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado durante o período de recuperação pós-operatória. Mantenha os camundongos sob condições padrão de habitação, monitore diariamente o peso corporal e a clareza da janela, e retome as imagens somente após todos os critérios de recuperação serem cumpridos.

3. Expressão do sensor endotelial ^NAD+ mediada por AAV

1. Construção viral e preparação
   1. Use um biossensor ^NAD+ geneticamente codificado baseado em eGFP/cpVenus, acionado pelo promotor endotelial Cdh5.
   2. Use o Cambronne et al. Sequência ^{biossensorial} NAD+ citoplasmática LigA-cpVenus (por exemplo, plasmídeo Addgene #186787 ou um inserto equivalente verificado por sequência).
   3. Clone o promotor Cdh5 a montante da sequência ^de codificação do biossensor NAD+ usando a espinha dorsal vetorial CV232.
   4. Embale a fita cassete de expressão na capsídea AAV-X1.1 como uma preparação viral personalizada.
      1. Registre o fornecedor de produção viral, método de purificação, método de quantificação do genoma viral, número do lote de produção e certificado de análise para cada preparação de AAV.
   5. Registre o mapa plasmídico, resultados da verificação de sequência, informações sobre produção viral, informações de purificação, título do genoma viral e certificado de análise para cada preparação viral.
      1. Registre o mapa de construtos, relatório de verificação de sequência, número de lote de produção viral, relatório quantitativo de reação em cadeia da polimerase (qPCR), documentação de purificação e certificado de análise para cada preparação viral utilizada no estudo.
   6. Consulte a Tabela de Materiais para todos os detalhes das construções.
   7. Use preparações AAV de alto título com títulos específicos de qPCR para lote, tipicamente maiores que 2 × 10¹³ vg/mL.
   8. Armazene alíquotas descartáveis a −80°C.
   9. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
   10. Registre o lote de produção, o título qPCR, a duração do armazenamento e a variação aceitável de lote a lote antes do uso.
2. Administração sistêmica de AAV
   1. Descongelar uma alíquota viral no gelo.
   2. Dilua o vírus em soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) até um volume final de injeção de 100–200 μL por camundongo.
   3. Mantenha uma dose final de 2 × 10¹² vg por camundongo em todos os animais.
      1. Calcule o volume de injeção a partir do título do genoma viral específico do lote. Para a preparação representativa com título qPCR de 1,39 × 10¹³ vg/mL, injete aproximadamente 144 μL para administrar uma dose de 2 ×^{10 12} vg por camundongo.
   4. Administre o vírus por injeção retro-orbital do seio venoso usando uma seringa estéril de insulina de 29 G.
   5. Injete a suspensão viral lentamente por aproximadamente 10–20 s.
   6. Confirme o parto bem-sucedido verificando a ausência de vazamento, sangramento excessivo e lesão ocular.
   7. Valide e relate qualquer rota alternativa de administração separadamente.
   8. Observe o rato até que a postura normal e o movimento espontâneo sejam restaurados.
   9. Confirme respiração estável e ausência de sangramento ou sofrimento.
   10. Devolva o animal à gaiola de origem somente após a recuperação total.
   11. Deixe de 21 a 28 dias para a expressão do sensor antes da imagem.
   12. Mantenha um intervalo de expressão consistente dentro de cada conjunto de comparação.
   13. Valide intervalos de expressão fora da faixa de 21–28 dias separadamente.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado durante o período de expressão de AAV. Mantenha a manutenção rotineira e o monitoramento da saúde e prossiga para a cirurgia da janela craniana somente após o intervalo de expressão planejado ter passado e o animal permanecer saudável.
3. Validação da restrição endotelial
   1. Faça uma triagem dos animais antes da coleta formal de dados.
   2. Aceite animais quando o sinal verde do canal sensor for detectável e seguir a rede vascular.
   3. Confirme que o sinal está enriquecido ao longo das paredes do vaso adjacentes ao lúmen TMR–dextran–positivo.
   4. Confirme a ausência de fluorescência parênquimatosa difusa dominante.
   5. Aplique critérios de aceitação idênticos em todos os grupos experimentais.
   6. Perfunda camundongos com PBS seguido de 4% de paraformaldeído quando for necessária validação post hoc.
   7. Colete o cérebro e prepare 30–40 μm de seções coronais ou sagitales.
   8. Seções de coloração com marcadores endoteliais, como lectina de tomate, CD31, ou caderina endotelial vascular (VE-cadherina).
      1. Registre a fonte do anticorpo, número do catálogo, número do lote, espécie hospedeira, diluição, condições de incubação e método de detecção para cada experimento de validação.
   9. Avalie a expressão da nicotinamida fosforibosiltransferase (NAMPT) e da poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) quando necessário.
   10. Use diluições primárias de anticorpos otimizadas para a preparação do tecido.
   11. Adquira imagens fluorescentes ou confocais usando configurações idênticas de aquisição entre os grupos.
   12. Quantifique a colocalização como a fração de sinal positivo para sensores que se sobrepõe ou está imediatamente adjacente a regiões positivas para marcadores vasculares.
   13. Exclua animais quando o sinal mais detectável estiver localizado fora das estruturas vasculares.
   14. Exclua animais quando o enriquecimento da parede do vaso não houver.
   15. Exclua animais quando a fluorescência parênquima fora do alvo impede a seleção confiável da região de interesse.
   16. Exclua animais quando a fluorescência do canal sensorial está saturada ou instável durante a aquisição basal.

4. Imagem de dois fótons e análise quantitativa

1. Preparação no dia de imagem e rotulagem de referência intravascular
   1. Anestesie camundongos com solução de trabalho recém-preparada de Avertin (1,25%, 12,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal a 200–250 mg/kg, ou utilize o regime anestésico aprovado pelo protocolo animal institucional.
   2. Confirme um plano cirúrgico estável por perda de retirada do pedal e respiração estável.
   3. Aplique pomada oftálmica imediatamente após a indução.
   4. Se for usada anestesia por inalação, induza anestesia com isoflurano de 3% a 4%.
   5. Mantenha a anestesia com 1%–2% de isoflurano em oxigênio entre 0,5–1,0 L/min e ajuste de acordo com a respiração e os reflexos.
   6. Prepare TMR–dextrano de 70 kDa em PBS estéril a 10–25 mg/mL.
   7. Proteja a solução TMR–dextrano da luz e filtre a solução se necessário pela prática institucional.
   8. Injete TMR–dextrano por via intravenosa a 20 mg/kg.
   9. Ajuste o volume de injeção de acordo com a concentração do estoque. Para um camundongo de 25 g, administre aproximadamente 0,5 mg de corante total.
   10. Prepare o traçador fresco ou armazene alíquotas protegidas contra a luz conforme as recomendações do fabricante.
   11. Deixe o TMR–dextrano circular por 5–10 minutos antes da aquisição da imagem.
2. Configuração do microscópio
   1. Use um microscópio de dois fótons de comprimento de onda duplo configurado para excitação de 920 nm do canal sensor baseado em eGFP.
   2. Use um caminho de excitação de 1040 nm para o canal de referência vascular TMR–dextran.
   3. A imagem representativa foi realizada em um microscópio multifóton Nikon A1 MP/A1R MP+ controlado pelo software NIS-Elements AR/AR Analysis (versão 5.42.06).
   4. Registre as fontes de laser, parâmetros de pulso, configuração de combinação de feixe, tipo de detector e versão do software para cada sistema de imagem.
   5. Configure os canais de detecção para separar o sinal do canal do sensor do sinal TMR–dextran.
   6. Use tubo fotomultiplicador não escaneado (PMT) ou detectores de fosfeto de arseneto de gálio (GaAsP).
   7. Colete a emissão verde do canal do sensor entre aproximadamente 500 e 550 nm.
   8. Colete a emissão de TMR–dextrano entre aproximadamente 570 e 650 nm.
      1. No conjunto de dados representativo, colete a emissão verde do canal sensor usando um filtro de emissão de 525/50 nm e colete a emissão TMR–dextrano usando um filtro de emissão de 575/25 nm ou 610/75 nm.
   9. Minimize o vazamento espectral entre os canais.
   10. Mantenha as configurações de ganho e deslocamento do detector constantes dentro de cada conjunto de comparação.
   11. Verifique a separação de canais usando controles de canal único quando disponíveis.
   12. Use um objetivo de imersão em água Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 ou equivalente (25×, abertura numérica 1,10, distância de trabalho 2,0 mm).
   13. Confirme o co-registro do canal usando marcos vasculares fixos, como bifurcações e bordas de lúmen.
   14. Repita a verificação de co-registro após qualquer ajuste do caminho óptico.
   15. Meça a potência do laser no plano da amostra antes da imagem.
   16. Mantenha a potência do laser constante de 920 nm em cada conjunto de comparação.
   17. Mantenha uma constante de potência do laser de 1040 nm em cada conjunto de comparação.
   18. Use aproximadamente 10–20 mW a 920 nm e 8–18 mW a 1040 nm como faixas representativas de trabalho.
   19. Ajuste a potência do laser de acordo com a profundidade de imagem e a qualidade da janela craniana.
   20. Exclua campos que mostrem perda de sinal superior a 20% durante o período de referência de 120 s.
   21. Exclua campos que mostrem mudanças fototóxicas visíveis.
3. Configurações de aquisição
   1. Selecione campos de visão com uma janela óptica clara, microvasos nitidamente focados e movimento mínimo.
   2. Janelas aceitas com cobertura transparente, vasculatura cortical visível, dura-máter intacta, sangue residual mínimo, sem adesivo sob a cobertura, sem infecção e fixação estável na placa da cabeça.
   3. Exclua animais com opacidade marcada, sangramento persistente, detritos inflamatórios, infecção, deslocamento de janelas, perda de peso severa (>15%) ou má limpeza/atividade.
   4. Adquira imagens em time-lapse em 512 × 512 pixels.
   5. Adquira imagens estáticas representativas em 1024 × 1024 pixels quando for necessário maior detalhe espacial.
   6. Mantenha o tamanho do pixel, zoom, velocidade de varredura e campo de visão constantes dentro de cada conjunto de comparação.
   7. Adquira pilhas z usando um passo de 1–3 μm.
   8. Imagem de microvasos corticais a profundidades de aproximadamente 200–250 μm abaixo da superfície pial.
   9. Estenda a profundidade de imagem para aproximadamente 400 μm quando a qualidade das janelas permitir.
   10. Mantenha a profundidade de imagem constante para comparações pareadas.
   11. Adquira uma linha de base de 120 s em intervalos de 1 s antes das intervenções agudas.
   12. Continue a aquisição pelo período pré-definido após a intervenção.
   13. Registre as respostas intravenosas de NMN por aproximadamente 10–30 minutos após a injeção.
   14. Adquirir conjuntos de dados de água potável e gavage oral em pontos experimentais predefinidos.
   15. Mantenha as mesmas configurações de aquisição em todos os grupos de comparação.
4. Intervenção NMN (exemplo de aplicação)
   1. Dissolva NMN em água potável estéril.
   2. Ajuste a concentração de NMN para administrar aproximadamente 100 mg/kg/dia.
   3. Proteja a garrafa da luz.
   4. Substitua a água potável contendo NMN a cada 24–48 horas.
   5. Monitore o consumo de água usando medições de peso de garrafa.
   6. Calcule a ingestão estimada de NMN usando o consumo de água e o peso corporal.
   7. Continue a suplementação por 5 dias antes da imagem.
   8. Prepare NMN em 1 mg/mL para gavage oral.
   9. Administre 200 μL por camundongo usando uma agulha de ponta arredondada de 20G, 38 mm.
   10. Realize exames de imagem de 30 a 60 minutos após a gavage.
   11. Prepare NMN a 1 mg/mL para parto intravenoso.
   12. Injetar 100 μL por camundongo através do seio venoso retroorbital ou veia caudal.
   13. Administre a injeção lentamente por 10–20 segundos.
   14. Comece a fazer exames imediatamente ou em até 5 minutos após a injeção.
   15. Adquira conjuntos de dados de água potável após 5 dias de suplementação.
   16. Adquira conjuntos de dados orais de gavage em um ponto fixo pós-gavage.
   17. Adquira uma linha de base imediatamente antes da injeção intravenosa.
   18. Registre respostas agudas por aproximadamente 10–30 minutos após a injeção intravenosa.
5. Processamento de imagem e extração de sinais
   1. Realize correção de movimento quando houver artefatos de movimento.
   2. Use Fiji/ImageJ (versão 1.8.0 ou posterior) com StackReg, TurboReg ou um algoritmo equivalente de registro de corpo rígido.
   3. Use marcos vasculares no canal TMR–dextrano para orientar o registro.
   4. Aceite conjuntos de dados apenas quando o deslocamento residual for inferior a aproximadamente 1–2 pixels após a correção.
   5. Confirme que os limites da região vascular de interesse (ROI) permanecem estáveis durante toda a aquisição.
   6. Use o canal TMR–dextrano para segmentar lúmens do vaso.
   7. Defina ROIs endoteliais imediatamente adjacentes ao lúmen.
   8. Selecione microvasos com marcagem lúmena estável, movimento mínimo e sinal visível no canal do sensor.
   9. Analisar diâmetros de vasos de aproximadamente 5–80 μm.
   10. Defina ROIs endoteliais como regiões associadas à parede vasal, com aproximadamente 2–5 μm de largura.
   11. Analise de 3 a 5 embarcações por campo de visão quando disponível.
   12. Analise de 1 a 3 campos de visão por mouse quando disponíveis.
   13. Defina ROIs de fundo em regiões de tecido que não possuem sinal traçador e sensor.
   14. Coloque os ROIs de fundo pelo menos 20 μm de distância dos vasos analisados e artefatos de imagem.
   15. Subtraia a intensidade média de fundo de cada canal antes da normalização.
   16. Aplique a mesma estratégia de subtração de fundo a todas as amostras.
   17. Extraia valores médios de intensidade de séries temporais para F_sensor(t).
   18. Extraia valores médios de intensidade de séries temporais para F_ref(t).
   19. Realize medições usando a análise AR/AR de elementos NIS ou Fiji/ImageJ.
   20. Exporte arquivos de imagem raw como arquivos ND2.
   21. Exporte cópias de análise como pilhas TIFF de 16 bits sempre que possível.
   22. Exporte dados de séries temporais de ROI como arquivos CSV.
   23. Calcule valores de fluorescência subtraídos do fundo antes da normalização.
   24. Calcule ΔF/_{F 0} usando ΔF/_{F 0} = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Defina F₀ como o sinal médio durante o período de referência de 120 s.
   26. Calcule a normalização de referência vascular como F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Reporte a variação de pico, o tempo até o pico, a área sob a curva e a cinética de recuperação quando a duração da aquisição permitir.
   28. Não interprete o sinal do canal do sensor de 920 nm como uma concentração calibrada de NAD⁺ .
   29. Realize calibração ratiométrica adicional ou validação bioquímica quando medições quantitativas de ^NAD+ forem necessárias.
6. Estatísticas e relatórios
   1. Defina o rato como a unidade experimental biológica.
   2. Faça medições médias em nível de vaso dentro de cada camundongo antes da análise em nível de grupo ou aplique um modelo estatístico aninhado.
   3. Use testes t de duas caudas pareados para comparações normalmente distribuídas dentro do camundongo.
   4. Use testes de pares pareados de Wilcoxon com patente gestual quando as suposições de normalidade não forem atendidas.
   5. Use modelos ANOVA de medidas repetidas ou de efeitos mistos para análises envolvendo mais de duas condições relacionadas.
   6. Aplique correções apropriadas de múltiplas comparações.
   7. Realize análises estatísticas usando GraphPad Prism ou software equivalente.
   8. Defina significância estatística como p < 0,05.
   9. Informe o teste estatístico exato em cada legenda de figura.
   10. Código de arquivos de imagem antes da seleção e quantificação do ROI sempre que possível.
   11. Mantenha o analista cego até que as medições de ROI e as decisões de controle de qualidade estejam concluídas.
   12. Use N = 3 camundongos como unidade experimental biológica no conjunto de dados representativo.
       NOTA: Não pause a aquisição de imagem durante a imagem ativa em time-lapse. O processamento de imagem e a análise quantitativa podem ser pausados após a exportação de dados brutos. Armazene arquivos ND2, arquivos de análise TIFF, arquivos ROI, metadados e tabelas de medição CSV em um arquivo com backup. Registre potência do laser, configurações do detector, profundidade de imagem, identificação do animal, atribuição de tratamento e decisões de exclusão para cada sessão de imagem.

Resultados

Uma preparação bem-sucedida gera uma janela craniana transparente e mecanicamente estável, adequada para imagem longitudinal. A Figura 1A resume o fluxo de trabalho procedural, desde anestesia e exposição ao crânio até craniotomia, colocação do coverslip, fixação da placa de cabeça e recuperação pós-operatória. A Figura 1B apresenta fotografias seriadas representativas das principais etapas cirúrgicas. Janelas adequadas para ima...

Discussão

Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho completo para monitorar o metabolismo do ^NAD+ endotelial cerebral in vivo. Determinantes chave do sucesso incluem: (i) clareza e estabilidade das janelas, incluindo minimização de danos térmicos e controle de sangramento durante a perfuração; (ii) especificidade endotelial e expressão adequada do sensor alcançadas por meio da seleção adequada do capside, promotor, dose e intervalo de expressão do AAV; e (iii) configurações c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	CUIDADO: Químico tóxico/nocivo. Usado para preparar solução anestésica Avertin para cirurgia de janela craniana. Solução de trabalho típica: 1,25% (12,5 mg/mL), administrado intraperitonealmente a 200–250 mg/kg.
2-Metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	CUIDADO: Químico tóxico/nocivo. Solvente usado para preparação da solução concentrada do estoque Avertin. Proteger da luz e descartar preparações que apresentem precipitação ou descoloração.
Amostras absorventes	Winner Medical	Amostras de algodão estéreis médicas	Usado para hemostasia, secagem do crânio, irrigação e manutenção do campo cirúrgico.
AAV-X1.1-Cdh5-citoplasmático NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene fontes para plasmídeos	Construção GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Biosensor NAD+ direcionado para endotélio empacotado em AAV-X1.1. Cassete de expressão: promotor Cdh5–biosensor citoplasmático NAD+–poli(A) SV40. Dose de injeção representativa: 2 × 10¹² vg/rato. Armazenar aliquotas a −80 °C e evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Registrar titer qPCR específico do lote, número do lote, mapa do plasmídeo, verificação de sequência e certificado de análise.
Agente analgésico (cloridrato de buprenorfina)	MCE	HY-B0071	Analgesia perioperatória e pós-operatória. Dose representativa: 0,05–0,1 mg/kg subcutaneamente a cada 8–12 h por 24–48 h.
Sistema de administração de anestesia	RWD Life Science	R500 com vaporizador R580	Usado para entrega de isoflurano durante a imagem. Fluxo de oxigênio típico: 0,5–1,0 L/min.
Agente anestésico (isoflurano)	RWD Life Science	Série R510-22	Usado para anestesia de imagem. Configurações típicas: 3–4% de indução e 1–2% de manutenção.
Lâmina de cobertura	Feita sob medida	Sem número de catálogo	Lâmina de vidro No. 1,5 estéril dimensionada para cobrir completamente uma janela craniana de 3 × 3 mm e assentar no rebordo do crânio.
Cimento/adesivo dentário	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Usado para selagem da janela craniana e fixação da placa de cabeça de titânio. Preparação representativa: 1 colher de pó, 1 gota de catalisador e 4 gotas de monômero. Endurecer aproximadamente 5–10 min em temperatura ambiente.
Broca dentária	RWD Life Science	Microbroca 78001	Broca de alta velocidade usada para desbaste do crânio e craniotomia. Use aproximadamente metade da velocidade máxima com resfriamento frequente com solução salina.
Solução desinfetante	Winner Medical	Povidona-iodina/iodóforo e etanol 70%	Usado para preparação do couro cabeludo antes da cirurgia. Aplique desinfetantes alternados por três ciclos.
Pinça fina	Marca JZ	JD1050/JD1070	Usado para remoção do periósteo, manipulação de tecidos e elevação do retalho ósseo.
Agulha de sondagem	RWD Life Science	20G, 38 mm, ponta esférica	Usado para administração oral de NMN.
Placa de cabeça	Feita sob medida	Sem número de catálogo	Placa de cabeça de titânio com abertura central de aproximadamente 10 mm compatível com o suporte de imagem.
Almohadilla térmica/controlador homeotérmico	RWD Life Science	69020 com almohadilla 69023	Usado para manter a temperatura corporal em aproximadamente 36,5–37,5 °C durante a cirurgia e a imagem.
Software de aquisição de imagem	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Usado para controle do microscópio e aquisição de imagem. Configurações representativas incluem 512 × 512 ou 1024 × 1024 pixels, passo z de 1–3 µm e intervalo de lapso de tempo de 1 s.
Software de análise de imagem	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 ou posterior	Usado para correção de movimento, seleção de ROI, subtração de fundo, extração de intensidade e exportação CSV.
Suprimentos para injeção intravenosa	BD	329461	Seringa de insulina estéril de 1 mL com agulha 29G para injeções de AAV, TMR–dextrano e NMN.
NMN (mononucleotídeo de nicotinamida)	Selleck Chemicals	S5259	Precursor de NAD+ usado para experimentos de administração por água potável, por sondagem oral e intravenosa.
Pomada oftálmica	Farmácia certificada local	Não aplicável	Usado para prevenir o ressecamento da córnea durante a anestesia.
Soro fisioológico tamponado com fosfato (PBS)	Servicebio	G4202-100ML ou G4202-500ML	PBS estéril 1× usado para diluição viral, preparação de marcadores, lavagem de tecidos e preparação de reagentes.
Sistema de monitoramento respiratório	RWD Life Science	Módulo de monitoramento integrado	Usado para monitorar a respiração e a profundidade anestésica durante a cirurgia e a imagem.
Solução salina (NaCl 0,9%, estéril)	Servicebio	G4702-500ML	Usado para resfriamento do crânio, irrigação, umectação de tecidos e preparação de solução.
Estrutura estereotáxica/suporte de cabeça	Feita sob medida	Sem número de catálogo	Usado para posicionamento estável durante cirurgia de janela craniana e imagem.
Microscópio cirúrgico	Olympus	SZ61	Usado durante a cirurgia de janela craniana para desbaste do crânio, craniotomia e colocação de lâmina de cobertura.
TMR–dextrano (70 kDa)	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D1818	Marcador fluorescente intravascular usado para rotulagem de referência vascular. Concentração típica: 10–25 mg/mL. Injetar a 20 mg/kg e permitir circulação de 5–10 min antes da imagem.