Técnicas eficientes de identificação para 61 cultivares de chá oleóleo (Camellia oleifera abel) usando a estratégia MCID e marcadores de DNA

Resumo

Este estudo utilizou um diagrama manual de identificação de cultivares (MCID) derivado de padrões de bandagem de DNA Polimórfico Amplificado Aleatório (RAPD) para identificar de forma eficiente e reprodutiva 61 cultivares de Camellia oleifera Abel para utilização de recursos de germoplasma e identificação de cultivares de chá oleoso.

Resumo

É fundamental identificar materiais e cultivares de germoplasma de Camellia oleifera Abel [Chá de óleo (Ot)] para avaliar os recursos de germoplasma e avaliar os mecanismos de proteção das variedades Ot. Esse estudo utilizou uma técnica otimizada de RAPD aumentando o comprimento do primer RAPD e triando a temperatura de recozimento por PCR, que identificou 61 cultivares Ot de várias regiões. Além disso, foi desenvolvido um MCID para projetar marcadores RAPD eficientes para identificação de cultivares. De 80 primers arbitrários de 11-nt do RAPD, 10 primers produzindo bandas polimórficas claras (PBs) foram selecionados para análise por PCR das 61 cultivares. Além disso, a estratégia MCID foi empregada para distinguir manualmente 61 cultivares com base nos PBs observados nas impressões digitais de DNA dos 10 primers, que geraram o diagrama de identificação de cultivares Ot (Ot-CID). Este Ot-CID indicava cada cultivar individualmente, utilizando PBs para identificação, com os espoletas apropriados posicionados corretamente no Ot-CID. A estratégia MCID oferece uma abordagem simples e prática para identificação de plantas usando marcadores de DNA. Além disso, essa abordagem oferece um método prático e eficiente para identificação de cultivares. O Ot-CID resultante, com 61 cultivares Ot, distinguiu efetivamente as variantes Ot usando marcadores RAPD, facilitando assim a diferenciação de cultivares para proteção do direito do cultivar e identificação precoce de mudas na indústria de viveiros.

Introdução

Camellia oleifera Abel [Chá de óleo (Ot)] é uma das espécies de árvores oleógicas mais importantes do mundo¹. A China é considerada o centro de origem e diversidade da Ot, com abundantes recursos de germoplasma². A antiga tradição do Ot, a propagação vegetativa e os diversos programas globais de melhoramento resultaram no surgimento de inúmeros^cultivares. O cultivo global generalizado da cultura Ot resultou em cultivares com homônimos (cultivares distintos com o mesmo nome) e sinônimos (cultivares com mais de um nome)⁴. Portanto, é fundamental desenvolver técnicas para o manejo de uma vasta gama de germoplasma Ot e distinguir com precisão várias variedades ^3,5.

Apesar da aplicação de marcadores moleculares baseados em DNA na caracterização de cultivares, pesquisas genéticas e identificação de Ot, que podem elucidar a diversidade genética e diferenciar indivíduos de plantas, nenhum estudo conseguiu identificar com sucesso um número substancial de cultivares Ot ou fornecer uma base confiável para a diferenciação^{de cultivares} 6,7,8,9 . A falta de métodos confiáveis é a principal limitação para a aplicação de marcadores de DNA na identificação de culturas vegetais. Isso pode ocorrer porque as técnicas analíticas usadas para impressões digitais de DNA não conseguem fornecer informações pertinentes que especifiquem claramente primers e marcadores polimórficos para diferenciar os cultivares que exigem identificação. As técnicas analíticas para padrões de faixas de DNA (chamadas de análises por clusters) são inadequadas para distinguir efetivamente cultivares ou espécies.

Embora cartões de identificação molecular (IDs) de DNA tenham sido desenvolvidos para mais de 200 cultivares Ot utilizando os marcadores SNP ^2,3,10,11, ainda existem vários desafios: (1) O genoma Ot é complexo, com a maioria das camélias cultivadas sendo hexaploide, enquanto o genoma de referência utilizado para construir os IDs moleculares de DNA é triploide, o que pode resultar em certa imprecisão³. (2) O sequenciamento do genoma completo é caro, especialmente para laboratórios com instalações limitadas, impedindo sua aplicação generalizada para análise de variedades em larga escala. Além disso, produtos de amplificação por PCR exigem sequenciamento ou detecção por fluorescência, complicando ainda mais o processo¹². (3) Na ausência de marcadores distintivos para novas variedades, é necessário desenvolver novos primers de marcadores, o que também exigirá a recodificação dos códigos de carteira de identificação para os tipos existentes. Isso resulta em uma quantidade esmagadora de posições de código, diminuindo a eficácia da diferenciação de variedades. Portanto, é essencial empregar técnicas que forneçam verificação fácil, confiável, confiável e prática das cultivares Ot para o setor de viveiros Ot, negócios agrícolas, proteção de patentes de plantas e conservação e avaliação de recursos^{genéticos 5}.

Estratégias tradicionais para identificação de cultivares baseavam-se em características morfológicas, fisiológicas e agronômicas, mas essas características têm limites, pois são suscetíveis a influências ambientais e exigem uma avaliação abrangente de plantas totalmente^{desenvolvidas 13,14}. Além disso, marcadores moleculares têm o benefício distinto de não serem afetados por variáveis ambientais, servindo assim como uma ferramenta eficiente para a caracterização precisa dos^{cultivares 14,15}. Recentemente, vários índices baseados em DNA foram estabelecidos para avaliar impressão digital, diversidade genética, cultivar e^pureza 16,17,18,19,20,21,22. O marcador RAPD é vantajoso para análise de cultivares devido à sua simplicidade, eficiência e à ausência de requisitos de dados de sequência^{anteriores 23,24}. A abordagem RAPD pode ser aprimorada selecionando primers de 11 nucleotídeos (nt) juntamente com sua temperatura especificada de recozimento por PCR para sua aplicação na impressão digital de plantas, estabelecendo assim o RAPD como um método preferível para identificação de variedades de plantas e avaliação da diversidade^{genética 25,26}. Esses marcadores têm sido amplamente utilizados em estudos de diferenciação de culturas e correlação genética de várias espécies de plantas, incluindo^{damasco 27}, pêssego^{ornamental 28}, romã²⁹, landraces²⁰ e^{nogueira 30} (Çilesiz et al., 2025). Apesar de seu uso generalizado, muitas abordagens baseadas em marcadores de DNA continuam insuficientemente práticas ou simplificadas para a identificação rotineira de variedades de plantas.

Portanto, este estudo utilizou uma técnica analítica inovadora para a identificação reprodutível de várias variedades de Ot. O MCID, derivado dos padrões de faixas do RAPD, diferenciou 61 cultivares Ot para utilização de recursos de germoplasma e identificação de cultivares.

A estratégia RAPD-MCID descrita aqui (Figura 1) é mais adequada para caracterização de germoplasma em pequena a média escala em laboratórios com infraestrutura padrão de PCR e eletroforese em gel, mas acesso limitado a instalações de sequenciamento. Também é muito adequado para triagem preliminar rápida e econômica antes de análises genéticas mais detalhadas. Os principais limites operacionais do método incluem sua dependência de marcadores dominantes e a necessidade de padronização cuidadosa das condições de PCR para garantir a reprodutibilidade entre laboratórios. Para bancos de germoplasma em grande escala ou registro legal de variedades, recomenda-se o uso complementar de marcadores codominantes, como SSRs ou SNPs.

Protocolo

1. Material vegetal

1. Colete folhas jovens de brotos saudáveis e em crescimento ativo de cada cultivar de chá oleoso no Repositório Nacional de Germoplasma de Camélia, Condado de Shucheng, Província de Anhui.
2. Consulte a Tabela 1 para os nomes e origens dessas cultivares.

2. Extração de DNA genômico

1. Extraia DNA genômico total usando um kit de extração de DNA vegetal conforme as instruções do fabricante.
2. O DNA foi eluído com um buffer de 1× TE. Após a elução, confirme que a solução extraída de DNA está clara e incolor. Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
3. Ajuste a concentração de DNA para 30 ng·^μL-1 com 1× tampão TE e armazene a solução ajustada de DNA a -20 °C.

3. Seleção de primer RAPD

1. Desenvolva 80 primers aleatórios para análise de RAPD e analise-os usando alguns genótipos. Selecione primers RAPD 11-nt que produzam padrões de banda claros e inequívocos em todos os genótipos testados.
2. Use os primers selecionados para genotipagem para aumentar a credibilidade dos fragmentos amplificados. Selecione 10 primers bem resolvidos com bandas reproduzíveis para análise adicional, conforme listado na Tabela 2.

4. PCR de DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD)

1. Prepare as reações de amplificação modificando levemente o método²³ descrito anteriormente. Prepare as soluções de reação de acordo com a composição listada na Tabela S1.
2. Realize PCR usando um ciclador térmico com as seguintes condições: pré-desnaturação a 94 °C por 5 minutos; 42 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento por 1 minuto à temperatura otimizada listada na Tabela 2, e extensão a 72 °C por 2 minutos; e uma extensão final a 72 °C por 10 minutos.

5. Detecção e análise de produtos de PCR

1. Separe os fragmentos de DNA amplificados por eletroforese em gel a 100 V em 1,3% de agarose (p/v) preparada em tampão 1× TAE contendo 0,001 M EDTA e 0,04 M Tris-acetato a pH 8,0. Tinga os géis com brometo de etídio a 0,5 μg·^μL-1.
   ATENÇÃO: Brometo de etídio é um mutagênico potente. Use equipamentos de proteção individual adequados ao manusear soluções de brometo de etídio ou géis manchados.
2. Faça o gel funcionar em uma tensão constante de 100 V por 45–60 minutos, ou até que a frente do corante azul de bromofenol tenha migrado aproximadamente dois terços do comprimento do gel. Após a coloração e a descoloração, observe o gel sob transiluminação UV.
   NOTA: Confirme que faixas distintas de DNA são claramente visíveis sob transiluminação UV. Certifique-se de que a escada de DNA apresente faixas nítidas e bem separadas, variando de 100 pb a 2.000 pb.
3. Registre as bandas polimórficas (PBs) dos cultivares com base em sua presença ou ausência sob luz ultravioleta.
4. Realize cada amplificação de PCR em triplicado para garantir a reprodutibilidade. Apenas bandas de pontuação que estejam consistentemente presentes ou ausentes em todas as três réplicas independentes para análise a jusante. Confirme que a taxa de concordância de pontuação de bandas entre réplicas excede 95%.

6. Análise de dados

1. Pontue as faixas para identificação de cultivares com base em sua presença ou ausência, atribuindo "+ o" às bandas claramente visíveis e "−" às bandas ausentes na posição molecular correspondente em todas as cultivares. Inclua apenas bandas que sejam consistentemente observadas em três réplicas independentes.
2. Classifique cultivares com faixas distintas na impressão digital produzida por um único primer independentemente. Categorize cultivares com padrões idênticos de faixas no mesmo subgrupo. Diferencie progressivamente e completamente todas as variedades de chá oleoso com base nesses parâmetros.

7. Aplicação e eficiência do diagrama na identificação de cultivares

1. Selecione aleatoriamente dois grupos de cultivares de chá de óleo entre os intra e intergrupos para verificar a aplicabilidade e funcionalidade do diagrama que ilustra 61 cultivares de chá de óleo. Realize a seleção manualmente consultando diferentes ramos do diagrama Ot-CID, sem o uso de nenhum software.
   NOTA: 2 grupos de cultivares Ot foram selecionados aleatoriamente para verificar a aplicabilidade e funcionalidade do diagrama que ilustra 61 cultivares Ot.
2. Designe os dois grupos selecionados como "A" e "B". Selecione os orientadores relevantes para cada grupo do Ot-CID.

8. Orientação para descarte de resíduos perigosos

1. Prepare e manuseie todas as soluções de brometo de etídio em uma área designada. Colete separadamente todos os resíduos sólidos contaminados com brometo de etídio e resíduos líquidos para descarte conforme as diretrizes institucionais sobre resíduos perigosos.
2. Descarte todos os materiais contaminados com brometo de etídio em recipientes de resíduos perigosos designados. Entre em contato com o escritório de saúde e segurança ambiental da instituição para procedimentos aprovados de descarte caso tenha dúvidas.

Resultados

Os Resultados Representativos apresentados aqui ilustram o fluxo de trabalho completo da estratégia RAPD-MCID, desde a triagem inicial dos primers passando pela discriminação hierárquica de cultivares até a validação final. O processo de discriminação passo a passo está documentado nas Figuras 2, Figuras 3, Figuras 4,

Discussão

Marcadores de DNA são ferramentas poderosas usadas para identificar cultivares de plantas e^{espécies 24}. Esses marcadores foram desenvolvidos e empregados em milhares de estudos sobre análise genética, identificação de cultivares, etc.; no entanto, eles não são fáceis nem amplamente utilizados na^{genotipagem 24,31}. Isso se deve à falta de métodos eficientes e fáceis que utilizem marcadores de DNA pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrifuge	Eppendorf,Germany	5427R	Usado para extração de DNA genômico de folhas de chá de óleo
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, China	DP350	Usado para extração de DNA genômico de folhas de chá de óleo
Instrumento de amplificação gênica PCR	Monad, China	MP60901	Usado para amplificação PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	Usado para eletroforese de fragmentos de PCR
TAE	Tsingke, China	TSG001	Usado para eletroforese de fragmentos de PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japão	RR001A	Usado para amplificação PCR
Espectrofotômetro Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI,EUA		Usado para determinar a concentração de RNA