Isolamento e validação de subpopulações de células-tronco mesenquimais positivas para podoplanina usando uma estratégia indireta de esferas magnéticas

Resumo

Este protocolo descreve um método de triagem baseado em esferas magnéticas, utilizando anticorpos de citometria de fluxo marcados com ficoeritrina (PE) e microesferas anti-PE para isolar subpopulações específicas de células-tronco mesenquimatosas com alta positividade de marcadores-alvo pós-sorte, preservando a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 sob as condições testadas, sem exigir classificadores celulares caros ou esferas personalizadas específicas para o alvo.

Resumo

O estudo da heterogeneidade funcional em células-tronco mesenquimatosas baseia-se no isolamento eficiente de subpopulações específicas (por exemplo, células positivas para podoplanina (PDPN)). No entanto, para a maioria dos alvos proteicos de membrana, as contas magnéticas comerciais diretamente disponíveis para triagem são limitadas. Para resolver isso, nosso laboratório estabeleceu e testou um protocolo padronizado de separação de esferas magnéticas baseado no princípio de acoplamento indireto dos "anticorpos de citometria de fluxo marcados com ficoeritrina (PE)/anti-PE". Utilizando células PDPN-positivas como população-alvo modelo, esse protocolo enriquece uma fração celular alvo sem depender de classificadores de células citométricas de fluxo caros.

Pesquisadores podem usar anticorpos compatíveis de citometria de fluxo marcados por PE direcionados a proteínas acessíveis da superfície celular e combiná-los com microesferas anti-PE comercialmente disponíveis para estabelecer um fluxo de trabalho de separação para alvos selecionados após a otimização específica do alvo. Essa abordagem evita os longos prazos de entrega e os altos custos associados à personalização ou pedido de esferas magnéticas específicas para cada novo alvo, tornando-a especialmente adequada para marcadores de superfície acessíveis que são raros ou pouco estudados. No sistema modelo PDPN testado aqui, o protocolo permitiu o enriquecimento da subpopulação-alvo com alta positividade pós-triagem de PDPN e preservou a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 em comparação com MSCs não classificados.

Introdução

No campo da ortopedia, lesões como danos na cartilagem e lesões na zona avascular (zona branca) do menisco frequentemente resultam em destruição irreversível das articulações e perda de função, levando, em última análise, à osteoartrite. Isso se deve em grande parte à fraca capacidade regenerativa desses tecidos, que decorre da falta de sangue direto e suprimento linfático, bem como da presença de células altamente diferenciadas com capacidade limitada de proliferação e ^migração 1,2,3,4. Para enfrentar esse desafio, várias estratégias clínicas foram exploradas, incluindo o uso dos exossomos ^5,6, transplante autólogo ou alogênico de condrócitos ^7,8, e as abordagens de engenharia de tecidos ^9,10,11,12. Nos últimos anos, as células-tronco mesenquimatosas (MSCs) emergiram como uma fonte celular promissora para reparação regenerativa, devido ao seu potencial de diferenciação multilinhagem e propriedades imunomoduladoras, oferecendo nova esperança para a regeneração^{da cartilagem} 13,14,15,16.

Apesar de seu potencial terapêutico, as MSCs apresentam grande heterogeneidade. Mesmo dentro de uma única fonte de tecido, como medula óssea ou cordão umbilical, subpopulações distintas de MSCs podem apresentar considerável variabilidade na capacidade de proliferação, potencial de diferenciação multilinhagem (particularmente diferenciação condrogênica) e função regenerativa in^vivo 17,18,19. Portanto, a identificação precisa e o isolamento de subpopulações de MSC funcionalmente definidas — como aquelas com capacidade condrógena aprimorada — é essencial para avançar nossa compreensão de suas propriedades biológicas e melhorar a eficácia da reparação da cartilagem. Isso representa um passo crítico em nossa pesquisa.

À medida que a pesquisa avança, um número crescente de novas proteínas de membrana foi identificado como marcadores de subpopulações de MSC funcionalmente distintas. No entanto, traduzir essas descobertas em estratégias eficazes de separação de células continua sendo tecnicamente desafiador. A separação celular ativada por fluorescência convencional (FACS), embora poderosa, requer instrumentação especializada e expertise técnica, limitando seu acesso em muitos laboratórios. Por outro lado, a separação de células imunomagnéticas — embora mais amplamente utilizada — é limitada pela disponibilidade limitada de reagentes comerciais, que são projetados principalmente para alguns alvos de membrana bem estabelecidos. Consequentemente, para muitos marcadores recém-descobertos com potencial significado biológico, não existem contas magnéticas comercialmente disponíveis, tornando difícil enriquecer especificamente essas valiosas subpopulações de MSC.

Para superar essa limitação, o presente estudo visa estabelecer e padronizar um protocolo flexível, econômico e eficiente para seleção positiva de células. Essa abordagem baseia-se na conjugação indireta de anticorpos conjugados com ficoeritrina (PE) comercialmente disponíveis com esferas imunomagnéticas anti-PE. Relatórios anteriores demonstraram que os MSCs positivos para podoplanina (^PDPN+) possuem superior capacidade de manutenção e diferenciação da estamina em comparação com ^{seus equivalentes PDPN-- 20}. Além disso, o envolvimento dos MSCs ^PDPN+ na regeneração da cartilagem e na progressão da osteoartrite (OA) foi documentado na literatura^21,22. Usando podoplanina (PDPN) — um marcador candidato recentemente identificado para subpopulações funcionais de MSC — como alvo modelo, separamos células positivas para PDPN das MSCs derivadas da medula óssea. Fornecemos um protocolo detalhado passo a passo que cobre preparação de suspensão de célula única, marcação de anticorpos e esferas magnéticas, e separação magnética. Além disso, avaliamos o rendimento, a positividade pós-triagem de PDPN e a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 das células separadas. Ao padronizar esse protocolo, buscamos fornecer aos pesquisadores um método versátil e acessível para isolar subpopulações celulares-alvo usando anticorpos compatíveis contra marcadores acessíveis na superfície celular, facilitando assim pesquisas fundamentais com células-tronco e futuras aplicações translacionais em medicina regenerativa.

Protocolo

As MSCs derivadas da medula óssea humana foram adquiridas comercialmente (veja a Tabela de Materiais). O fornecedor confirmou a identidade do MSC pela expressão positiva de CD73, CD90 e CD105; expressão negativa de CD34, CD45 e HLA-DR; e potencial de diferenciação por trilinhagem. As células foram expandidas em cultura e usadas nas passagens 3–5. Todo o trabalho celular de origem humana foi realizado em um gabinete de segurança biológica Classe II sob condições estéreis. Como as células foram adquiridas comercialmente e nenhum sujeito humano foi recrutado ou amostrado diretamente nesse protocolo, não foi necessária aprovação direta do IRB.

1. Preparação da suspensão de célula única

NOTA: A qualidade da suspensão de célula única afeta diretamente a eficiência da separação. Certifique-se de que as células estejam bem dispersas, altamente viáveis e livres de aglomerados. Aglomerados visíveis devem ser dispersos por pipeteamento suave e repetido até que os aglomerados não sejam mais visíveis.

1. Selecione MSCs (passagens 3–5) que tenham atingido 80–90% de confluência. Descarte o meio cultural.
2. Lave as células com 2 × 10 mL de PBS pré-aquecido. Balance suavemente o recipiente e descarte o PBS.
3. Adicione 2 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA e incube a 37 °C por 3–5 minutos. Observe as células ao microscópio até que elas se reúnam e comecem a se desprender.
4. Adicione 4 mL de meio de cultivo contendo 16,5% de FBS (veja a Tabela de Materiais) para neutralizar a tripsina. Pipete suavemente as células para garantir o descolamento completo. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo de 15 mL.
   NOTA: Verifique ao microscópio que todas as células foram coletadas.
5. Centrifuge a 300 × g por 3 minutos e descarte o sobrenadante.
6. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão (veja a Tabela de Materiais). Proceda para a contagem de células.

2. Contagem celular e ajuste de concentração

NOTA: Se o número total de células for menor que 1 × 10⁷, ainda adicione os anticorpos e reagentes magnéticos com base no volume padrão para 1 × 10⁷ células para garantir a eficiência da marcação.

1. Centrifuge novamente a suspensão da célula a 300 × g por 3 minutos e descarte o sobrenadante.
2. Resuspenda as células no buffer para alcançar uma densidade de 1 × 10⁸ células/mL.
   NOTA: Por exemplo, para processar 1 × 10⁷ células, ressuspenda o pellet em 100 μL de buffer.
3. Transfira a suspensão da célula para um tubo de fundo arredondado de poliestireno de 5 mL.

3. Marcagem de anticorpos

1. Adicione 10 μL de Fc gamma RII Blocker (veja a Tabela de Materiais) por 1 × 10⁷ células. Misture delicadamente e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Adicione 5 μL de anticorpo anti-PDPN humano conjugado com PE (veja a Tabela de Materiais) por 1 × 10⁷ células, seguindo a concentração recomendada pelo fabricante. Misture delicadamente e incube em temperatura ambiente por 15–20 minutos, protegido da luz.
   NOTA: O volume do anticorpo deve ser ajustado de acordo com a ficha técnica do anticorpo específico de citometria de fluxo utilizado, pois as concentrações podem variar entre os produtos.

4. Rotulagem de contas magnéticas

NOTA: Mantenha todos os reagentes no gelo antes do uso e devolva-os ao gelo imediatamente após cada adição para manter a atividade e a consistência.

1. Adicione 10 μL de Cocktail de Seleção por 1 × 10⁷ células (veja a Tabela de Materiais). Misture delicadamente e incube em temperatura ambiente por 15 minutos.
2. Adicione 5 μL de esferas magnéticas por 1 × 10⁷ células (veja a Tabela de Materiais). Misture delicadamente e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
   NOTA: Faça vórtice nas esferas magnéticas com vigor por 30 segundos antes do uso para garantir uma dispersão uniforme.

5. Separação magnética

1. Coloque um tubo de fundo arredondado de poliestireno de 5 mL contendo a amostra da célula marcada no suporte de separação magnética (veja a Tabela de Materiais).
2. Adicione buffer ao tubo para elevar o volume total para 2,5–3 mL. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
3. Realize a separação: Segurando o ímã e o tubo juntos como uma única unidade, inverta-os para despejar o sobrenadante em um novo tubo de coleta. Essa fração coletada contém as células negativas para PDPN; Mantenha esse tubo no gelo.
   NOTA: Não remova o tubo do suporte magnético durante essa etapa, pois isso pode interromper a separação e causar a falha do procedimento.
4. Repita os passos 5.1–5.3 3 vezes. Cada vez, adicione buffer ao tubo original no ímã, espere 5 minutos e despeje o sobrenadante no mesmo tubo de coleta de frações negativas usado no passo 5.4.
5. Após a lavagem final, remova o tubo contendo as células magneticamente ligadas do suporte. Este tubo contém a fração celular positiva para PDPN.
6. Adicione 3 mL de buffer para resuspender as células positivas. Transfira essa suspensão para um tubo novo e marcado (o tubo de fração positiva).

6. Coleta, cultura e validação das células-alvo

1. Conte as células tanto dos tubos de fração positiva quanto negativa. Registre o rendimento da célula para cada fração.
2. Centrifuge a suspensão de célula de fração positiva a 300 × g por 3 minutos. Descarte o supernadante.
3. Resuspenda o pellet celular em meio de cultura Alfa MEM contendo 16,5% de FBS. Ajuste a densidade celular conforme necessário e semeie as células em placas de cultivo ou frascos.
4. Incube as células a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂.

7. Preparação da amostra para validação de pureza e funcionamento

1. Conte as células e semee-as em um prato de cultura de 100 mm com densidade de 3 × 10⁶ células por recipiente em 12 mL de meio de cultura. Vinte e quatro horas após a semeadura, observe a fixação da célula. Substitua o meio de cultivo por meio fresco para remover quaisquer esferas magnéticas residuais e células não aderentes.
2. Colhe as células por tripsinização. Pipete suavemente para cima e para baixo 10–15 vezes para desalojar e remover esferas magnéticas e anticorpos residuais.
3. Avalie a porcentagem de células positivas para PDPN-PE por citometria de fluxo (veja o Arquivo Suplementar 1 para o protocolo detalhado).
4. Colete células durante a fase de crescimento logarítmico. Seme-as em uma placa de 96 poços. Em diferentes momentos de tempo (0 h, 24 h, 48 h, 72 h), adicione o reagente CCK-8 (veja a Tabela de Materiais) e meça a absorção de acordo com as instruções do fabricante. Trace uma curva de proliferação com base nos dados.

Resultados

O princípio geral e o fluxo de trabalho do experimento são ilustrados na Figura 1. Todos os dados experimentais subsequentes são baseados em células da passagem 5. Após a separação magnética, as células ^PDPN+ obtidas foram cultivadas por 24 a 48 horas. Após substituir o meio de cultivo para remover células não aderentes e possíveis contas magnéticas residuais (Figura 2A), avaliamos a eficiência de triagem e o rendimen...

Discussão

Neste estudo, estabelecemos um protocolo baseado em esferas magnéticas para isolar células de PDPN+ de MSCs derivadas da medula óssea. Essa abordagem permite o enriquecimento eficiente da subpopulação PDPN-positiva, mantendo a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 sob as condições testadas.

Comparado aos métodos convencionais de triagem imunomagnética direta, a vantagem mais significativa dessa estratégia está em sua versatilidade. Abordagens trad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
7-AAD Cell Viability Assay Kit	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)	STEMCELL Technologies	18520
Buffer	STEMCELL Technologies	20104	Buffer
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dextran Magnetic Particles	STEMCELL Technologies	50100	Magnetic Particles
Fetal Bovine Serum	Gibco	16050-122
Magnet	STEMCELL Technologies	18000	magnetic separation stand
MEM Alpha Medium	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Medium (82,5%) + FBS (16,5%) + Penicillin-Streptomycin (1,0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
PE-conjugated Anti-Human PDPN Antibody	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Selection Cocktail	STEMCELL Technologies	18151	Selection Cocktail
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072