Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Resumo

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Resumo

As células natural killer (NK) são linfócitos inatos que desempenham um papel crítico na imunidade protetora contra diversos patógenos intracelulares e cânceres. Sua função principal é eliminar células-alvo que estão infectadas, transformadas malignamente ou revestidas por anticorpos por meio da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). As células NK também podem ser geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quiméricos (CARs) que permitem o reconhecimento direcionado de antígenos específicos. A medição quantitativa da citotoxicidade das células NK é essencial para avaliar a funcionalidade basal e para a avaliação pré-clínica de anticorpos monoclonais e estratégias de engenharia CAR. No entanto, os ensaios funcionais in vitro continuam altamente variáveis entre laboratórios devido às diferenças na preparação celular, células-alvo, razões efetor-alvo, tempos de co-incubação e métodos de leitura, limitando a reprodutibilidade e comparações entre estudos. Este artigo apresenta um protocolo padronizado para avaliação quantitativa da citotoxicidade das células NK usando citometria de fluxo e imagens em tempo real de células vivas. Células NK humanas primárias e células NK-92 que expressam CAR foram avaliadas quanto à sua capacidade de eliminar células cancerígenas e células-alvo revestidas por anticorpos em um formato de placas de 96 poços para medir citotoxicidade natural, morte mediada por CAR e ADCC. A sobrevivência da célula-alvo foi medida de forma contínua usando imagens de células vivas ou em um ponto de tempo definido por citometria de fluxo, que também permitiu a caracterização fenotípica das células NK e das células-alvo. Esses protocolos fornecem uma estrutura robusta utilizando métodos rotineiros de cultura de tecidos, imagem e citometria de fluxo para possibilitar a quantificação reprodutível das funções efetoras das células NK para estudos de imunidade inata e imunoterapias baseadas em células NK.

Introdução

As células natural killer (NK) são linfócitos inatos que desempenham um papel central na vigilância imune contra células infectadas pelo vírus e malignas, exibindo citotoxicidade^{rápida e potente 1}. Ao contrário das células B e T, as células NK não expressam receptores específicos de antígeno e, em vez disso, dependem de uma série de receptores ativadores e inibitórios para detectar a perda da expressão do complexo maior de histocompatibilidade classe I ou estresse celular. Isso permite que eles mediem a citotoxicidade direta liberando grânulos citotóxicos contendo perforina e granzimas ou, em alguns casos, ativando receptores de morte 1,2,3,4. Além da citotoxicidade natural, as células NK expressam FcγRIII (CD16), um receptor que reconhece a porção Fc da imunoglobulina G (IgG) e media a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células-alvo revestidas de^{IgG 5,6}.

Devido aos seus mecanismos citotóxicos intrínsecos e perfil de segurança favorável, as células NK emergiram como candidatas promissoras para a imunoterapia celular. Com potencial para uso alogênico, as células NK podem funcionar como uma terapia "pronta a usar" com risco mínimo de doença enxerto contra hospedeiro, possibilitando uma aplicabilidade clínica mais ampla e redução de custos⁷. Avanços recentes ampliaram ainda mais o potencial terapêutico das células NK por meio de estratégias de engenharia genética, incluindo a introdução de receptores de antígenos quiméricos (CARs) que redirecionam as células NK para reconhecer antígenos tumorais específicos. As células CAR-NK demonstraram eficácia antitumoral em modelos in vivo de xenoenxertos e ensaios clínicos, com toxicidade reduzida em comparação com células^{CAR-T 8,9,10}. Portanto, há um interesse crescente no desenvolvimento de plataformas de células NK engenheiradas e estratégias terapêuticas baseadas em anticorpos. Nesse contexto, a medição precisa e quantitativa da capacidade de matar células NK é essencial para entender a biologia das células NK, avaliar a eficácia de terapias com células NK ou outras engenharias e avaliar anticorpos monoclonais que dependem da ADCC.

Uma variedade de ensaios in vitro tem sido amplamente utilizada em laboratórios para avaliar a citotoxicidade das células NK. Métodos comuns incluem ensaios de liberação de cromo-51 radioativo, ensaios de liberação de lactato desidrogenase e ensaios de liberação de calcina-acetoximetil^11,12. Embora esses métodos tradicionais tenham sido amplamente usados para medir citotoxicidade, eles dependem de leituras indiretas da morte celular, fornecem medições de desfechos em vez de dados cinéticos e oferecem sensibilidade e faixa dinâmica limitadas. Eles também não fornecem informações sobre o fenótipo ou o estado de ativação das células efetoras. Mais recentemente, plataformas de imagem de células vivas e citometria de fluxo têm sido cada vez mais adotadas porque permitem quantificação direta da sobrevivência da célula-alvo, monitoramento da morte ao longo do tempo e análise fenotípica simultânea de células efetoras e alvo^13,14. No entanto, mesmo entre essas abordagens mais recentes, existe uma variabilidade substancial entre laboratórios e estudos publicados, incluindo diferenças na preparação célula-alvo, nas razões efetor-alvo (E:T) e tempos de co-incubação, limitando a reprodutibilidade e comparações entre estudos, especialmente em avaliações pré-clínicas de imunoterapias baseadas em células NK.

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho padronizado para avaliação quantitativa da citotoxicidade das células NK utilizando duas plataformas independentes e complementares: imagens em tempo real de células vivas (IncuCyte SX5) e ensaios de endpoint baseados em citometria de fluxo. A imagem de células vivas permite monitoramento contínuo da sobrevivência da célula-alvo durante a co-cultura com células efetoras, possibilitando a avaliação cinética da citotoxicidade em múltiplas razões E:T e condições experimentais com manipulação mínima do^{ensaio 15}. Em contraste, a citometria de fluxo fornece uma medição altamente sensível do ponto final da morte célula-alvo, juntamente com caracterização fenotípica simultânea das células NK e células-alvo usando um painel de coloração multimarcador.

Além disso, esse protocolo incorpora parâmetros experimentais padronizados, incluindo razões E:T, condições de incubação, formato de placa e fluxos de trabalho analíticos, para melhorar a reprodutibilidade e facilitar a comparação de medições de citotoxicidade entre laboratórios e estudos. O fluxo de trabalho permite a avaliação quantitativa de múltiplas funções efetoras NK, incluindo citotoxicidade natural, eliminação mediada por CAR e ADCC, sendo compatível com células NK humanas primárias e linhagens celulares NK. Esse protocolo fornece uma estrutura prática para estudos da biologia das células NK e avaliação pré-clínica do desenvolvimento de imunoterapias baseadas em células NK.

Protocolo

O uso das amostras de doadores humanos para pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional e realizado de acordo com as diretrizes institucionais (Approval #2022P000699).

1. Ensaio de morte por imagem de células vivas em tempo real

1. Placas de revestimento
   1. Adicione 50 μL/poço poli-D-lisina (0,1 mg/mL em soro salino tamponado com fosfato [PBS]) a uma grade de 6 × 10 em uma placa de fundo plano de 96 poços. Agite suavemente a placa para garantir que o fundo de cada poço esteja totalmente coberto.
   2. Incube a placa por 2 horas em temperatura ambiente (RT; 18°C–26°C) com a tampa colocada.
   3. Lave os poços 3× com 200 μL/poço PBS e descarte o sobrenadante.
      NOTA: Placas revestidas podem ser seladas com parafilme e armazenadas a 4°C por até 1 semana, com 200 μL de PBS adicionados a cada poço. Certifique-se de que as placas permaneçam estéreis, descarte PBS e permita que se equilibrem com RT antes do uso.
2. Prepare as células-alvo
   1. Prepare 10 mL de 2× SYTOX Orange (200 nM) diluindo a solução de estoque SYTOX Orange (250 μM em DMSO) em meio de cultura NK-92 (adicione 8 μL de estoque a 10 mL no volume total) em um tubo de centrífuga de fundo cônico de 15 mL.
      NOTA: O meio de cultivo para células NK-92 consiste em meio avançado RPMI-1640, 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, 100 μg/mL de primocina e 500 U/mL de IL-2 humana.
      ATENÇÃO: SYTOX Orange é um corante fluorescente e pode representar riscos para a exposição à pele ou aos olhos. Manuse-se com equipamentos de proteção individual adequados e de acordo com as diretrizes de segurança da instituição.
   2. Conte células-alvo usando um método de contagem de células baseado em exclusão de corante (por exemplo, azul de tripano) ou um método validado equivalente (por exemplo, contador automático de células).
      NOTA: Neste ensaio, as células-alvo eram células de Ramos, uma linha celular de linfoma de células B expressora de antígeno de maturação de células B (BCMA⁺), que modificamos para expressar a proteína fluorescente no infravermelho próximo (NIR) emiRFP670.
   3. Transfira a quantidade necessária para um tubo centrífugo cônico de fundo cônico de 15 mL.
   4. Centrífuga (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   5. Descarte o supernadante.
   6. Resuspenda as células-alvo até uma concentração final de 2,5 × 10⁵ células/mL (2,5 × 10⁴ células/100 μL) em meio ×SYTOX Orange.
      NOTA: Células-alvo ressuspensas podem ser mantidas a 37°C com 5% de CO₂ no tubo por até 30 minutos enquanto preparam as diluições das células efetoras.
      NOTA: Para uma placa completa, 60 poços × 2,5 × 10⁴ células/poço = 1,5 × 10⁶ células-alvo no total. Prepare 2.0 × 10⁶ células para compensar a perda. Ajuste o número de células com base no tamanho do ensaio e na densidade de semeadura desejada.
3. Preparar células efetoras
   1. Avalie a concentração e viabilidade das células NK-92 usando um método de contagem celular baseado em exclusão de corante (por exemplo, azul de tripano) ou um método validado equivalente. Prossiga apenas se a viabilidade for ≥80%, pois menor viabilidade pode impactar o desempenho do ensaio.
      NOTA: Células NK-92 projetadas para expressar estabilmente a proteína fluorescente ZsGreen, sozinhas (controle) ou com construções CAR direcionadas para BCMA, foram usadas como células efetoras.
   2. Conte e transfira o número necessário de células para tubos centrífugos individuais de fundo cônico de 15 mL.
      NOTA: Calcule o número total de células efetoras necessárias somando o número de células necessárias em todas as razões E:T para uma réplica, multiplicando pelo número de réplicas e adicionando 50% de excesso para levar em conta a perda celular. Arredondar os números conforme necessário para facilitar a preparação. Por exemplo, para razões E:T variando de 2:1 a 0,25:1, use 1,5 × 10 células^{de 5} NK por replicação. Para triplicados, prepare 4,5 × 10^{células de 5} por condição com base na disposição de placas descrita na Figura Suplementar 1A.
   3. Células centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   4. Descarte o supernadante.
   5. Resuspenda as células até uma concentração final de 5,0 × 10⁵ células/mL (5,0 × 10⁴ células/100 μL).
4. Preparar diluições das células efetoras
   1. Prepare diluições das células efetoras, incluindo um controle apenas alvo, em uma placa de fundo arredondado de 96 poços (veja a Figura Suplementar 1A para um layout representativo de placas com quatro condições em triplicados). Cada condição é preparada em triplicado.
   2. Adicione 240 μL/poço de células efetoras (5,0 × 10⁵ células/mL) aos poços correspondentes a uma razão E:T de 2:1.
   3. Adicione 120 μL/poço de meio a todos os poços restantes.
   4. Realize diluições seriais 2 vezes de poços E:T = 2:1 até poços E:T = 0,25:1. Misture bem pipetando ≥5 vezes e troque as pontas entre as transferências.
      NOTA: Se as execuções de imagem não foram agendadas no sistema de imagem, agende-as antes de montar a cocultura. Diluições preparadas de células efetorais podem ser mantidas a 37°C com 5% de CO₂ em uma placa de fundo arredondado de 96 poços por até 30 minutos durante a montagem do sistema de imagem de células vivas.
5. Criar co-cultura
   1. Obtenha a placa de fundo plano revestida a poli-D-lisina de 96 poços.
   2. Adicione 100 μL/poço de suspensão de célula-alvo em todos os poços. Resuspenda completamente as células-alvo imediatamente antes de dispensar, pipetando para cima e para baixo ≥5 vezes usando uma pipeta apropriada (por exemplo, 200 μL) e evite a formação de bolhas durante a transferência.
   3. Adicione 100 μL/poço de suspensão de célula efetora aos poços correspondentes. Resuspenda completamente as células efetoras imediatamente antes da dispensação, pipeteando para cima e para baixo ≥5 vezes usando uma pipeta apropriada (por exemplo, 200 μL) e evite a formação de bolhas durante a transferência.
   4. Adicione 200 μL/PBS por poço aos poços não utilizados ao redor.
   5. Centrifuge a placa (2 min, 100 × g, RT, aceleração = baixa [ex., 2]; desaceleração [freio] = baixa [ex., 2]).
      NOTA: Esse spin suave é fundamental para assentar as células rápida e uniformemente no fundo do poço, permitindo imagens precisas no IncuCyte SX5. Usamos uma centrífuga de bancada Eppendorf 5810R compatível com rotor de balde oscilante, com as configurações de aceleração e desaceleração definidas para 2 (de 9).
   6. Coloque a placa no sistema de imagem de células vivas e adquira imagens a cada 1 hora por 24 horas (extensível até 72 horas, se necessário). Certifique-se de que as imagens de imagem sejam realizadas sob condições padrão de incubação (37°C/5% CO₂).
      NOTA: Para garantir que a imagem em t = 0 h reflita com precisão a contagem de células-alvo de base, inicie a aquisição da imagem em 10–15 minutos após a co-cultura e a centrifugação. Para uma placa completa com três canais de imagem (ou seja, verde, laranja e NIR), o tempo de varredura é de aproximadamente 10 minutos por hora para 3 imagens/poço com ampliação de 20×.
   7. Verifique a qualidade da imagem após a primeira varredura e ajuste as configurações, se necessário.
6. Configurações do instrumento
   1. Defina a mistura espectral para corrigir o vazamento de fluorescência do SYTOX Orange para o canal verde. Ajuste o valor de desmistura no software comparando os canais verde e laranja e confirmando que células mortas ^Laranja+ não são detectadas erroneamente como Verde⁺. Para o experimento representativo (Figura 1), a contribuição do canal laranja para o canal verde foi definida em 8,5%. Esses valores são específicos de cada conjunto de dados e devem ser otimizados para cada experimento.
   2. Configure a análise não aderente célula a célula para garantir segmentação e mascaramento precisos de todas as células dentro de cada campo de visão (veja a Figura Suplementar 1B para configuração representativa). Os seguintes parâmetros são recomendados para o sistema de imagem de células vivas usando modelos de efetor de suspensão e linha celular-alvo:
      1. Defina o diâmetro esperado do objeto para 15 μm (diâmetro aproximado da célula).
      2. Defina a sensibilidade do limiar e a sensibilidade da textura para 5.
      3. Defina a sensibilidade das bordas para 10 para facilitar a separação dos agrupamentos celulares.
      4. Defina a faixa de área de filtro aceita para 50–2000^μm2 para excluir detritos e objetos grandes.
      5. Defina o máximo de excentricidade para 0,95 para excluir objetos não celulares.
   3. Configure os limiares de classificação (veja a Figura Suplementar 1C para gating representativo). Use poços de controle apenas alvo para definir a população de células-alvo vivas de base ^NIR+/^Laranja−. Depois, use poços de co-cultura em pontos de tempo posteriores (por exemplo, t = 4 h) para confirmar a separação clara com sobreposição mínima entre as populações ^NIR+/− e Orange^+/−. Exemplos de limiares de classificação e parâmetros de análise são mostrados na Figura Suplementar 1C.
      1. Defina o limite de intensidade do Laranja para aproximadamente 15.
      2. Defina o limiar de intensidade NIR para aproximadamente 0,1.
         NOTA: Parâmetros e valores de limiar podem variar dependendo do instrumento, software, modelo de linhagem celular e intensidade do sinal de fluorescência.
         NOTA: Este protocolo pode ser adaptado para ensaios primários de citotoxicidade de células NK humanas ou ADCC se as células-alvo expressarem de forma estável a fluorescência NIR (por exemplo, emiRFP670). Também pode ser adaptado para ensaios de matança baseados em citometria de fluxo, omitindo o revestimento de poli-D-lisina e utilizando placas de fundo plano ou arredondado de 96 poços.

Figura 1. Quantificação da cinética e potência da citotoxicidade celular mediada pelo receptor de antígeno quimérico (CAR) NK-92 usando imagens de células vivas em tempo real. (A) Visão geral esquemática do ensaio de imagem de células vivas IncuCyte para monitoramento da citotoxicidade mediada por células NK. As células-alvo de BCMA+ Ramos que expressam emiRFP670 (canal infravermelho próximo [NIR]) são co-cultivadas com células efetorais NK-92 que expressam ZsGreen (canal verde), e a morte celular é detectada usando SYTOX Orange (canal laranja). (B) Imagem representativa de fluorescência de um poço de co-cultura em uma relação efetor-alvo (E:T) de 1:1 em 12 horas. Células-alvo vivas (emiRFP670⁺) são mostradas em azul, células efetoras NK-92 (ZsGreen⁺) em verde e células mortas (SYTOX Laranja⁺) em vermelho. As imagens foram obtidas usando o módulo de análise Célula por Célula não aderente com ampliação de 20×. Barra de escala = 100 μm. (C) Quantificação do crescimento e sobrevivência da célula-alvo ao longo do tempo em diferentes proporções E:T para células NK-92 controle e que expressam CAR. (D) Quantificação da sobrevivência da célula-alvo em função da razão E:T em múltiplos pontos temporais (4, 8, 16 e 24 horas). As contagens de células-alvo foram normalizadas para poços apenas alvo (E:T = 0:1) em cada ponto de tempo. (E) Representação esquemática de métricas quantitativas usadas para avaliar citotoxicidade: KR₅₀, razão assassino-alvo necessária para atingir 50% de morte em 12 horas; KT₅₀, tempo necessário para atingir 50% de abate com uma relação E:T de 1:1; e IKI₅₀, índice integrado de assassinos definido como a área do mapa de calor abaixo da isoclina de sobrevivência de 50%. (F) Mapas de calor mostrando o crescimento e a sobrevivência da célula-alvo em função da razão E:T e do tempo para cada condição do efetor. Valores quantitativos para KR₅₀, KT₅₀ e IKI₅₀ são indicados para cada condição. As contagens brutas de células-alvo vivas foram obtidas a partir ^{da população} NIR⁺/SYTOX Orange– com portas usando análise de classificação célula por célula no software IncuCyte 2021C. Todas as condições foram realizadas em triplicado (n = 3). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise de regressão não linear foi usada para modelar tendências de citotoxicidade nos painéis D e F. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Quantificação da citotoxicidade celular dependente de anticorpos por citometria de fluxo

1. Prepare células NK humanas primárias
   NOTA: Células NK humanas primárias foram isoladas de sangue periférico enriquecido com leucócitos obtidos de doadores adultos saudáveis usando um método de enriquecimento de células NK seguido por centrifugação por gradiente de densidade, conforme descrito^{anteriormente 3}. Células NK purificadas foram criopreservadas a 5 × 10⁶ células/mL em solução congelante (90% FBS e 10% sulfóxido de dimetil [DMSO]) como alíquotas de 0,5 mL em crioviais e armazenadas a menos de −150°C até o^{uso 3}.
   1. Descongele um frasco contendo 5 ×^{10 6} células NK humanas primárias agitando suavemente o criovial em um banho-maria a 37°C por aproximadamente 1 minuto, até que reste apenas um pequeno cristal de gelo.
      ATENÇÃO: Manuseie todas as amostras de origem humana utilizando procedimentos de biossegurança apropriados e equipamentos de proteção individual, de acordo com as diretrizes institucionais.
      ATENÇÃO: O DMSO facilita a absorção de produtos químicos na pele. Use equipamentos de proteção adequados e evite contato direto.
   2. Transfira as células descongeladas para um tubo centrífugo cônico de fundo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio de cultura de células NK pré-aquecido (37°C) e misture por meio de um leve giro.
      NOTA: O meio de cultura de células NK consiste em RPMI-1640 Avançado suplementado com 10% de FBS, soro AB humano 10%, 2 mM de L-alanil-L-glutamina, 100 μg/mL de primocina e 50 U/mL de IL-2 humana.
   3. Células centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   4. Descarte o supernadante.
   5. Resuspenda o pellet em 5 mL de meio de cultura de células NK pré-aquecido (37°C).
   6. Células centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   7. Descarte o supernadante.
   8. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura de células NK pré-aquecido.
   9. Transfira a suspensão para um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços.
   10. Adicione 1 mL de PBS estéril aos poços ao redor para minimizar a evaporação.
   11. Incube a placa de 24 poços em um ângulo de 45° (usando um suporte ou suporte para placas para manter o ângulo) a 37°C com 5% de CO₂ por 16–24 horas para permitir a recuperação das células NK.
       NOTA: As células NK humanas primárias requerem contato próximo célula-célula para máxima sobrevivência e recuperação, o que pode ser alcançado inclinando a placa de 24 poços e permitindo o acúmulo na borda dos poços. Mantenha um tempo de incubação consistente entre os experimentos.
       NOTA: Após o período de recuperação, prossiga diretamente para a preparação da célula-alvo e a montagem da co-cultura.
2. Tinga células-alvo com éster succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE).
   1. Obtenha 5 × 10^{células-alvo de 5} e transfira para um tubo centrífugo de fundo cônico de 15 mL.
      NOTA: Uma linha celular de linfoma derivada do paciente com CD38⁺ foi usada como^{células-alvo 16}.
   2. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS.
   3. Células centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   4. Prepare uma solução de trabalho de CFSE de 0,5 μM em PBS usando uma solução de 5 mM de estoque, diluindo 1 μL de 5 mM de CFSE em 10 mL de PBS em um tubo de centrífuga cônico de fundo cônico de 15 mL.
      ATENÇÃO: O CFSE é um corante fluorescente reativo que liga aminas e pode representar riscos para exposição à pele ou aos olhos. Manuseie com equipamentos de proteção individual apropriados e descarte o reagente não utilizado conforme as diretrizes locais de biossegurança.
   5. Descarte o supernadante.
   6. Resuspenda o pellet aproximadamente a 1 × 10⁶ células/mL na solução CFSE.
   7. Incube por 15 minutos a 37°C com o tubo envolto em papel alumínio ou colocado dentro de um recipiente opaco para proteger da luz.
   8. Apague a reação adicionando de 5 a 10 volumes de meio de cultivo.
   9. Incube por 5 minutos a 37°C.
   10. Células centrífugas (5 min, 300 × g, RT, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   11. Descarte o supernadante.
   12. Resuspenda as células a 2,5 × 10⁵ células/mL para que 100 μL contenha 2,5 × 10⁴ células.
       NOTA: Prossiga diretamente para o revestimento para manter a intensidade consistente do sinal CFSE e a viabilidade da célula-alvo.
3. Células-alvo de placas
   1. Obtenha uma placa de fundo arredondado com 96 poços.
   2. Adicione 100 μL/poço de células-alvo (2,5 × 10⁵ células/mL) aos poços designados usando uma pipeta multicanal (ver Figura Suplementar 2). Cada condição é placada em triplicado.
      NOTA: Certifique-se de que a suspensão da célula esteja homogênea antes de colocar a placa.
4. Prepare e adicione anticorpos
   1. Prepare 200 μL de solução de anticorpos 4× (100 μg/mL) em meio de cultura de células NK para cada anticorpo de teste e controle isotípico correspondente.
      NOTA: Esta etapa é modular e pode ser adaptada a qualquer anticorpo que medie a ADCC contra a linha celular alvo escolhida. As concentrações e formulações de estoques de anticorpos podem variar; ajuste as diluições de acordo. Conservantes como azida podem afetar a sobrevivência das células-alvo e a funcionalidade das células NK. Embora uma variedade de concentrações de anticorpos possa ser testada, uma concentração final de 25 μg/mL é usada aqui.
   2. Transfira soluções de anticorpos para uma placa de poço profundo.
   3. Adicione 50 μL/poço de solução de anticorpos às células-alvo e misture cuidadosamente pipetando ≥5 vezes.
   4. Adicione 50 μL/poço de meio de cultura de células NK em poços de controle sem anticorpos e misture cuidadosamente pipetando ≥5 vezes.
   5. Incube por 25–30 minutos a 37°C com 5% de CO₂.
5. Prepare e adicione células NK
   1. Conte e obtenha 2 × 10 células^{de 5} NK usando um método de contagem de células baseado em exclusão de corante (por exemplo, azul de tripano) ou um método validado equivalente. O número é suficiente para três condições contendo células NK placadas em triplicada, com excesso para compensar a perda por pipeteamento (ver Figura Suplementar 2). Prossiga se a viabilidade for ≥75%, pois menor viabilidade pode impactar o desempenho do ensaio.
   2. Resuspenda as células para 2,5 × 10^{células de 5} mL em 800 μL de meio primário de cultivo de células NK humanas (concentração final = 1,25 × 10⁴ células/50 μL).
   3. Adicione 50 μL/poço de células NK aos poços correspondentes e misture cuidadosamente pipetando ≥5 vezes.
      NOTA: Certifique-se de que a suspensão da célula esteja homogênea antes de colocar a placa.
   4. Adicione 50 μL/poço de meio de cultivo para controlar os poços e misture cuidadosamente pipetando ≥5 vezes.
6. Estabelecer a co-cultura final
   1. Inspecione cuidadosamente a placa de fundo arredondado de 96 poços para confirmar que todos os poços contêm 200 μL com níveis uniformes de menisco e sem bolhas.
   2. Centrifuge a placa (2 min, 100 × g, aceleração = baixa [ex., 2]; desaceleração [freio] = baixa [ex., 2]).
      NOTA: Esse spin suave é importante para estabilizar rapidamente as células e aumentar o contato célula entre células. Usamos uma centrífuga de bancada Eppendorf 5810R compatível com rotor de balde oscilante, com as configurações de aceleração e desaceleração definidas para 2 (de 9).
   3. Incubar por 16–18 horas (durante a noite) a 37°C com 5% de CO₂.
      NOTA: Essa duração de incubação é otimizada para a leitura de citotoxicidade em vez da desgranulação, que é melhor avaliada medindo a expressão de CD107a em pontos de tempo mais antigos (2–6 horas). Assim, as respostas de pico de desgranulação podem ser subestimadas.
      NOTA: Não estenda a incubação além de 18 horas, pois a cocultura prolongada pode resultar em morte excessiva da célula-alvo em poços de controle e redução da faixa dinâmica entre condições experimentais.
7. Realizar citometria de fluxo
   1. Centrífuga (5 min, 300 × g, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   2. Descarte o supernadante.
   3. Lave todos os poços com 200 μL/poço de tampão FACS (2% FBS, 2 mM de EDTA em PBS).
   4. Prepare uma mistura mestre de anticorpos de superfície no buffer FACS adicionando CD56-BV421 na diluição 1:50, CD16-BV785 na diluição 1:50 e CD107a-PE-Cy7 na diluição 1:25.
      NOTA: Calcule o volume total da mistura mestra com base no projeto experimental da placa (número de poços × 50 μL/poço + 20% de excesso). Clones de anticorpos podem variar em intensidade de coloração e acessibilidade ao epítopo. Clones usados nos dados representativos estão listados na Tabela de Materiais, e clones alternativos podem exigir titulação. Anticorpos adicionais podem ser incluídos para fenotipagem de subconjuntos de células NK (por exemplo, KIRs, NKG2A/C/D e CD57) e marcadores de ativação (por exemplo, CD69 e HLA-DR).
   5. Resuspenda as células em 50 μL/poço de mistura master de anticorpos e misture cuidadosamente pipetando ≥5 vezes.
   6. Incube por 15 minutos a 4°C com o prato embrulhado em papel alumínio ou colocado dentro de um recipiente opaco para proteger da luz.
   7. Adicione 150 μL/poço de buffer FACS.
   8. Centrífuga (5 min, 300 × g, aceleração = máximo; desaceleração [freio] = máximo).
   9. Descarte o supernadante.
   10. Resuspenda as células em 100 μL/poço de 5 μM 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) no tampão FACS e prossiga imediatamente para a aquisição de citometria em fluxo. Não é necessária incubação pré-aquisição.
   11. Adquira dados por citometria de fluxo e registre canais de fluorescência para CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI e quaisquer fluoróforos adicionais.
       NOTA: Configurações de aquisição (por exemplo, tensões do detector, compensação e gating) podem exigir otimização. Use controles sem coragem e com uma única mancha para compensação e configuração de comportamento, com esferas de compensação ou células representativas conforme apropriado. Controles fluorescente menos um devem ser considerados para marcadores com expressão contínua ou fraca (por exemplo, CD107a). Mantenha configurações consistentes e estratégias de gates, incluindo gating vivo/morto e identificação de populações alvo e efetora, entre os experimentos.
       NOTA: Tanto o Passo 1 quanto o Passo 2 podem ser adaptados para células-alvo aderentes. As células-alvo de semente (com seus respectivos meios de cultivo) em uma placa de fundo plano de 96 poços um dia antes da co-cultura, com uma densidade que atinge aproximadamente 70% de confluência no dia do ensaio. Após confirmar a aderência, descarte o meio da célula-alvo e substitua por 100 μL de meio novo de célula NK, depois adicione células efetoras para iniciar a cocultura. Devido às diferenças no tamanho e morfologia da célula, os parâmetros de análise célula por célula do IncuCyte devem ser otimizados para cada linhagem celular aderente.
       NOTA: Para ensaios baseados em citometria de fluxo com células aderentes, após co-cultura, centrifuge a placa (300 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante. Adicione 100 μL/poço de TrypLE e incube a 37°C com 5% de CO₂ por aproximadamente 5 a 15 minutos (dependendo da linhagem celular) para descolar as células. Adicione 100 μL/poço de buffer FACS, misture pipetando para cima e para baixo em um movimento circular e transfira todas as células para uma placa de fundo arredondado de 96 poços. Inspecionar os poços microscopicamente para confirmar o descolamento completo antes de prosseguir com a coloração (Passo 2, Sub-passo 7). Otimize o tempo de incubação do TrypLE conforme necessário para alcançar uma suspensão de célula única.

Resultados

Para quantificar a citotoxicidade das células NK em tempo real, células efetoras NK-92 projetadas para expressar CARs anti-BCMA foram co-cultivadas com células-alvo Ramos ^BCMA+ em uma placa preta, transparente de fundo plano de 96 poços e monitoradas usando imagens de células vivas (Figura 1A e Figura Suplementar 1A). Células efetoras foram adicionadas em razões E:T de 0:1 (apenas alvo), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 e 2:1, com cada condição realizada em triplicado. Três diferentes construtos CAR NK-92 foram avaliados: CAR1 sem domínio coestimulatório, CAR2 com domínio coestimulatório 4-1BB (CD137) e CAR3 com domínio coestimulatório DAP10, juntamente com células controle NK-92 que expressam um vetor apenas ZsGreen. Todas as células efetoras foram geradas via transdução lentiviral, conforme descrito^{anteriormente, usando} cassetes transgene ZsGreen-P2A-CAR. As células-alvo de Ramos foram igualmente transduzidas com um vetor lentiviral codificante com emiRFP670. O crescimento e a sobrevivência da célula-alvo foram monitorados a cada hora ao longo de um período de 24 horas usando o instrumento de imagem de células vivas, medindo a fluorescência verde para células ZsGreen⁺ NK-92, a fluorescência laranja para células mortas SYTOX Orange⁺ e a fluorescência NIR para células-alvo emiRFP670⁺ (Figura 1A e Figuras Suplementares 1B e 1C).

Imagens microscópicas foram adquiridas em intervalos de tempo definidos para visualizar células efetoras, células-alvo vivas e células mortas durante a co-cultura (Figura 1B). A quantificação do crescimento e sobrevivência das células-alvo demonstrou que as células NK-92 CAR2 e CAR3 apresentaram cinética de morte mais rápida do que as células NK-92 CAR1, especialmente em momentos anteriores com uma razão E:T de 1:1. A morte da célula-alvo aumentou com as maiores razões E:T, inclusive em células NK-92 controle, que demonstraram citotoxicidade natural (Figura 1C). Essas medições destacam a capacidade da imagem de células vivas de capturar mudanças dinâmicas na atividade citotóxica. A sobrevivência da célula-alvo também foi analisada em função da razão E:T em pontos de tempo definidos para comparar a potência do CAR NK-92. As células CAR2 e CAR3 NK-92 apresentaram maior potência em razões E:T mais baixas em momentos posteriores (por exemplo, E:T = 0,25:1 em 24 horas) e em proporções intermediárias E:T em momentos anteriores (por exemplo, E:T = 1:1 em 4 horas) (Figura 1D). Não foram observadas diferenças significativas na morte entre as células efetorais NK-92 CAR2 e CAR3 em várias análises.

Um mapa de calor que integra a razão E:T, o tempo de co-incubação e a sobrevivência das células-alvo fornece uma visualização abrangente da citotoxicidade natural e mediada por CAR em todas as populações de efetores, além de possibilitar uma avaliação quantitativa. Três parâmetros foram definidos para quantificar potência e cinética: KR₅₀, a razão assassino-alvo que atinge 50% de abate (em 12 horas); KT₅₀, o tempo de co-incubação necessário para atingir 50% de abate (com uma razão E:T de 1:1); e IKI₅₀, o índice integrado de assassinos representando a área do mapa de calor abaixo de 50% de sobrevivência, definida pela isoclina de sobrevivência de 50% (Figura 1E). Essas métricas permitem a comparação da potência da célula CAR NK-92 (KR₅₀), cinética de matar (KT₅₀) e desempenho citotóxico integrado (IKI₅₀) (Figura 1F). Esta análise demonstra como o ensaio pode comparar quantitativamente plataformas de células NK engenheiradas em múltiplos parâmetros dentro de um único experimento.

Citometria de fluxo com contagem celular foi usada para medir o ADCC co-cultivando células-alvo marcadas fluorescentemente com células NK humanas primárias na presença ou ausência de anticorpos terapêuticos e quantificando a população viva residual de células-alvo após 16–18 horas de incubação (Figura 2A). Citometros de fluxo como Cytek Aurora, BD Symphony ou BD Fortessa com sampler de alta taxa podem ser utilizados. No conjunto representativo (Figura Suplementar 2), células-alvo do linfoma derivado do paciente CD38⁺ foram placadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços, e o daratumumabe (ou anticorpo isotípico) foi adicionado aos poços apropriados. As células NK foram então co-cultivadas em uma razão E:T de 0,5:1, uma proporção otimizada para essas células-alvo, minimizando a morte natural enquanto permite a detecção de ADCC. Após a incubação, foi realizada citometria de fluxo para resolver populações celulares por dispersão frontal e lateral, excluir eventos não viáveis usando DAPI e separar células-alvo ^CFSE+ das células CD56⁺CD16⁺ NK para análise paralela (Figura 2B). Esse projeto permite medição simultânea de citotoxicidade e caracterização fenotípica.

Figura 2. O ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) baseado em citometria de fluxo permite quantificar simultâneamente a sobrevivência da célula-alvo e a ativação das células NK. (A) Visão geral esquemática do ensaio do ADCC. Células-alvo de ^linfoma CD38+ marcadas com CFSE foram placadas em 2,5 × 10⁴ células por poço e cultivadas sob cinco condições: apenas células-alvo; células-alvo com daratumumabe (25 μg/mL); células-alvo com células NK (E:T = 0,5:1); células alvo com células NK e daratumumabe; e células-alvo com células NK e anticorpo controle de isotipo (25 μg/mL). (B) Estratégia representativa de rastreamento de citometria de fluxo. Os eventos foram inicialmente direcionados por dispersão direta e lateral, seguidos pela exclusão de células não viáveis usando DAPI. As células-alvo foram identificadas como eventos ^CFSE+, e as células NK foram identificadas como eventos CD56⁺ e CD16⁺. A desgranulação das células NK foi avaliada pela expressão do CD107a. (C) Quantificação da sobrevivência da célula-alvo, expressa como uma porcentagem em relação à condição de controle apenas alvo (definida para 100%). (D) Quantificação da desgranulação das células NK, mostrada como a porcentagem de células CD107a⁺ dentro da população de células NK. Barras representam a média ± desvio padrão, e os pontos sobrepostos representam poços replicados individuais (n = 3). A análise estatística foi realizada usando análise unidirecional da variância com o teste de comparação múltipla post hoc de Tukey. A significância estatística é indicada da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O endpoint primário é a sobrevivência da célula-alvo, calculada dentro do portão ^CFSE+ ao vivo e normalizada para a condição apenas alvo, que é definida para 100% de sobrevivência. Essa normalização controla a perda espontânea de célula-alvo e possibilita a comparação direta entre condições. Em dados representativos (Figura 2C), a adição isolada de daratumumabe não reduziu a sobrevivência das células-alvo, confirmando que o anticorpo não tem efeito direto sobre a viabilidade das células-alvo na ausência de células efetoras. A co-cultura com células NK reduziu a sobrevivência das células-alvo para aproximadamente 70%, indicando citotoxicidade natural basal. A adição de daratumumabe reduziu ainda mais a sobrevivência para aproximadamente 37%, consistente com um aumento da morte mediada por anticorpos, enquanto a condição controle isotipo mostrou sobrevivência de aproximadamente 62%, comparável à condição apenas NK. Experimentos bem-sucedidos mostram clara separação entre condições tratadas por anticorpos e condições de controle com alta reprodutibilidade entre réplicas.

A fenotipagem secundária das células NK fornece confirmação complementar da ligação entre a morte da célula alvo e a ativação do efetor. A desgranulação das células NK, medida como a porcentagem de células NK CD107a⁺ , foi mais baixa na cocultura célula-alvo NK sem anticorpos e maior na condição tratada com daratumumabe (aproximadamente 31%), com o controle isotipo mostrando desgranulação intermediária (aproximadamente 19%), apoiando ativação mediada por anticorpos (Figura 2D). Esses resultados demonstram que o ensaio pode distinguir a morte da célula alvo da ativação do efetor. Embora as tendências de desgranulação e sobrevivência geralmente estejam alinhadas, elas não se sobrepõem totalmente, indicando que representam processos biológicos relacionados, porém distintos.

Experimentos subótimos tipicamente mostram redução da separação entre condições, variabilidade na contagem celular entre poços, alta morte celular-alvo em poços de controle, coloração fraca de CFSE ou elevação da desgranulação de fundo. Esses desfechos podem resultar de baixa viabilidade da célula-alvo, recuperação inconsistente das células NK, mistura inadequada ou variabilidade na coloração e aquisição. Como o ensaio identifica independentemente os compartimentos-alvo e efetor, pode ser estendido para incluir fenotipagem adicional das células-alvo (por exemplo, densidade de antígenos ou expressão de ligantes) e uma caracterização mais ampla das células NK. A inclusão de uma condição "apenas NK" pode quantificar ainda mais a desgranulação de base e a viabilidade das células NK. Esse design multiparâmetro é uma vantagem chave, permitindo que a citotoxicidade funcional seja interpretada junto com fenótipos imunes mecanicistas.

Figura Suplementar 1. Disposição representativa de placas e fluxo de trabalho de análise para ensaio de citotoxicidade por imagem de células vivas. (A) Disposição representativa de placas de 96 poços para o ensaio de matança de células CAR NK. Quatro condições de células efetoras são organizadas em quadrantes, cada uma testada em razões E:T de 0:1 (controle apenas alvo), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 e 2:1, com cada condição realizada em triplicado (total de 60 poços de ensaio). (B) Configuração representativa da análise célula a célula não aderente no software IncuCyte 2021C, ilustrando parâmetros espectrais de desmistura, segmentação e mascaramento usados para identificar células efetoras e alvo individuais, excluindo detritos e agregados. (C) Estratégia representativa de classificação célula a célula usando fluorescência NIR versus SYTOX Orange para definir a população viva-célula-alvo. Poços apenas alvo e poços de cocultura em um ponto de tempo de exemplo (t = 4 h) são usados para confirmar a separação entre populações de células vivas e mortas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2. Disposição representativa de placas para ensaio ADCC baseado em citometria de fluxo. Disposição representativa de placas de 96 poços ilustrando cinco condições experimentais em triplicado nas linhas B–D e colunas 2–6 (poços de ensaio totais = 15): (1) controle apenas alvo, (2) células-alvo com daratumumabe, (3) células-alvo com células NK, (4) células-alvo com células NK e daratumumabe, e (5) células-alvo com células NK e anticorpo controle isotípico. As células-alvo foram placadas a 2,5 × 10⁴ células por poço, e as células NK foram adicionadas a 1,25 × 10⁴ células por poço para alcançar uma razão E:T de 0,5:1. Anticorpos foram usados em concentração final de 25 μg/mL. Poços ao redor foram preenchidos com PBS para minimizar a evaporação. A condição apenas alvo foi usada para normalizar a sobrevivência das células-alvo, e o controle isotipo levou em conta os efeitos da formulação de anticorpos independentemente da especificidade do antígeno. A otimização da razão E:T pode ser necessária dependendo da suscetibilidade da linhagem celular alvo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Esses protocolos fornecem duas abordagens complementares para quantificar a citotoxicidade das células NK em um formato padronizado de placas de 96 poços. O Passo 1 utiliza imagens em tempo real de células vivas para monitorar continuamente a perda de célula-alvo e é bem adequado para avaliar a cinética da morte natural e mediada por CAR em múltiplas razões E:T. A etapa 2 utiliza citometria de fluxo para quantificar a ADCC após um período definido de coincubação, enquanto simultaneamente separa os compartimentos alvo e efetores para análise^{fenotípica 17}. Esses métodos, apresentados como plataformas complementares de ensaio que podem ser usadas para modelar processos biológicos distintos, também são facilmente intercambiáveis. Células NK humanas primárias podem ser usadas para ensaios ADCC baseados em imagens de células vivas e também podem ser projetadas para matar mediada por CAR em ensaios de citometria de fluxo. Além disso, embora células NK-92 do tipo selvagem não possuam expressão^{CD16 18}, a introdução de CD16 (por exemplo, via transdução lentiviral) permite facilmente que células NK-92 mediem ADCC potente. Assim, ambos os ensaios podem ser adaptados às necessidades científicas e translacionais individuais.

Existem várias etapas que são particularmente importantes para a reprodutibilidade em ambos os ensaios. Pequenas mudanças no número de células efetoras-células e fenótipo podem alterar drasticamente a sobrevivência das células-alvo. A contagem precisa das células e a ressuspensão completa durante o revestimento são essenciais para minimizar desvios na contagem celular e a mistura incompleta. Da mesma forma, a preparação celular deve ser mantida consistente entre os experimentos, incluindo viabilidade, tempo de recuperação e exposição prévia a citocinas, para garantir uma funcionalidade uniforme dos efetores. A geometria das placas é outro fator chave para o desempenho do ensaio. No fluxo de trabalho de imagem de células vivas, placas revestidas de fundo plano suportam aquisição estável de imagem e análise consistente de campo, enquanto no fluxo de trabalho de citometria de fluxo, placas de fundo arredondado promovem o contato célula-célula e facilitam a recuperação de coculturas não aderentes no ponto final. Além disso, a qualidade da marcação fluorescente deve ser confirmada antes do ensaio, pois a má discriminação da célula-alvo por imagem ou a fraca separação do CFSE por citometria de fluxo comprometem a quantificação e a interpretação.

Esses dois fluxos de trabalho apresentam considerações técnicas distintas. No ensaio de imagem de células vivas, as causas comuns de baixa qualidade dos dados incluem placagem celular desigual, agrupamento ou agrupamento denso de células e limiares subótimos de análise de imagem, todos facilmente corrigíveis. Esses problemas podem distorcer a contagem de células e resultar em acompanhamento inconsistente ao longo do tempo. No ensaio baseado em citometria de fluxo, resultados subótimos são mais frequentemente causados por alta morte de células-alvo de fundo, fraca separação das populações alvo e efetor, coloração deficiente de anticorpos ou pipeteamento inconsistente entre poços replicados. Como esses ensaios são projetados para análise comparativa, a inclusão de controles internos apropriados é essencial para a interpretação, incluindo controles apenas alvo para normalização e controles negativos combinados para condições específicas de anticorpos ou CAR.

Várias limitações compartilhadas e específicas de ensaios devem ser consideradas com esses métodos. O ensaio de imagem de células vivas fornece resolução temporal, mas depende de marcação fluorescente precisa e parâmetros de análise de imagem, ambos influenciados por agrupamento celular, sobreposição espectral ou mudanças morfológicas durante a co-cultura¹⁵. Em alguns casos, especialmente quando os ensaios envolvem células efetoras primárias, alcançar uma marcação fluorescente adequada sem alterar a dinâmica de execução é difícil ou inviável. O ensaio baseado em citometria de fluxo oferece maior resolução fenotípica em um ponto final definido, mas não distingue independentemente o início do tardio da eliminação, a menos que múltiplos pontos de tempo correspondentes sejam coletados, o que pode ser custoso e^{demorado 17}. Além disso, as medições de endpoints podem refletir não apenas a morte da célula-alvo, mas também diferenças na proliferação da célula-alvo, atrito de efetores ou recuperação durante o manuseio da amostra. Leituras mecanicistas como CD107a são, portanto, melhor interpretadas como indicadores complementares de ativação da célula efetora, em vez de substitutos diretos da eliminação da^{célula-alvo 19}. De forma mais ampla, nenhuma das plataformas reproduz completamente a arquitetura espacial, as interações estromais dos estronos, os gradientes de citocinas ou as restrições de tráfego que moldam a função das células NK in vivo.

Vários fatores biológicos também devem ser considerados ao interpretar ensaios de morte de células NK. A variabilidade de doador para doador é intrínseca a experimentos com células NK humanas primárias, que diferem em potencial citotóxico e composição de subconjuntos devido à idade do doador, sexo, histórico de doenças infecciosas e polimorfismos dos^{receptores 20}. O uso de células NK-92 reduz muito a variabilidade, mas essas células ainda podem apresentar alterações relacionadas à fonte e à passagem¹⁸. Nosso protocolo mitiga diferenças técnicas ou experimentais por meio de parâmetros padronizados e comparações de placas comparativas para avaliar esses fatores biológicos com mais precisão. Quando possível, recomendamos o uso de faixas definidas de passagem NK-92 com limiares de viabilidade fixos. Para células NK primárias, os ensaios devem usar células NK de múltiplos doadores para cada condição, com análises estatísticas levando em conta a variabilidade de doador para doador (por exemplo, modelos pareados ou de efeitos mistos), dado que as diferenças relativas entre condições geralmente são preservadas entre doadores. Além disso, marcadores adicionais de células NK (por exemplo, KIRs, NKG2A/C/D e CD57) podem ser incorporados em painéis de anticorpos usados para citometria de fluxo, a fim de comparar frequências de subconjuntos entre doadores e avaliar a ativação específica de células NK de subconjunto (ou seja, expressão CD107a e CD69), facilitando ainda mais a interpretação dos resultados. Por fim, para todos os ensaios de morte de células NK, certos cenários adicionais devem ser considerados. A expressão de antígenos direcionados em células NK, seja por expressão endógena ou pela aquisição de antígenos de células-alvo via trogocitose, pode resultar em fratricida de células NK e confundir resultados. Por exemplo, o daratumumabe pode atingir CD38 expresso nas células NK e induzir fratricida²¹, limitando a magnitude do ADCC em relação aos alvos pretendidos. Felizmente, imagens de células vivas e ensaios de citometria de fluxo permitem quantificar células NK para avaliar fratricídios.

Apesar dessas limitações, o uso combinado de imagens de células vivas e citometria de fluxo fornece uma estrutura prática para testes funcionais reprodutíveis de células NK em uma variedade de aplicações básicas e pré-clínicas. O fluxo de trabalho de imagem é vantajoso quando o comportamento temporal é importante, como distinguir respostas citotóxicas rápidas de retardadas ou comparar cinéticas de morte entre projetos^{CAR 22}. O fluxo de trabalho baseado em citometria de fluxo é vantajoso quando as leituras funcionais devem ser interpretadas junto com fenótipos de células efetoras e células-alvo dentro da mesma amostra. Juntas, essas abordagens permitem a avaliação quantitativa da morte natural, citotoxicidade mediada por CAR e ADCC usando plataformas experimentais amplamente acessíveis. Ao estabelecer uma estrutura padronizada e escalável, esse sistema facilita rigorosos benchmarkings e interrogatórios mecanicistas entre modalidades baseadas em células NK, acelerando o desenvolvimento e a tradução clínica de imunoterapias de próxima geração.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Meio basal para cultura de células NK-92 e células NK humanas primárias (ver protocolo para formulação completa)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marcador de degranulação para citometria de fluxo
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Citometria de fluxo
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Citometria de fluxo
Centrífuga de bancada com rotor de balde oscilante compatível com tubos de 15 mL e placas de 96 poços (Centrífuga Eppendorf 5810R)	Eppendorf	5811000015	Usado para peletagem de células e centrifugação de placas (100–300 × g)
Carboxiflurescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Corante de proliferação celular para marcação de células-alvo
Citômetro de fluxo espectral Cytek Aurora (ou equivalente)	Cytek Biosciences	N7-00003	Usado para aquisição e análise por citometria de fluxo
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindo)	BioLegend	422801	Corante nuclear para discriminação de células vivas/mortas
Placa de poço profundo de 96 poços	USA Scientific	1896-2110	Usado para preparação de anticorpos
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Reagente de criopreservação
Soro fetal bovino (FBS)	Avantor	76419-584	Suplemento de meio basal; usado no tampão FACS (2% FBS)
Water Bath de propósito geral, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Para descongelamento de células
GlutaMAX (suplemento de L-alanil-L-glutamina)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Fonte estável de glutamina
Soro humano AB	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Suplemento para meio de cultura de células NK humanas primárias
Sistema de imagem de células vivas IncuCyte SX5	Sartorius	4816	Imagem de células vivas em tempo real e análise célula por célula
Contador de células de fluorescência dupla LUNA-FL (ou equivalente)	Logos Biosystems	L20001	Contagem automatizada de células
Parafilm M (rolo de 4 pol x 250 pés)	Genesee	16-101	Selagem e armazenamento de placas
Phosphate-buffered saline (PBS), estéril (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Usado para lavagens e preparação de tampão FACS
Poly-D-lysine (0,1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Reagente de revestimento de placas
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiótico
Interleucina-2 recombinante humana (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Citokine
Kit de enriquecimento de células NK humanas RosetteSep	STEMCELL Technologies	15065	Cocktail de enriquecimento de células NK humanas
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Corante de viabilidade para imagem de células vivas
Trypan Blue 0,4%	Gibco	15250-061	Corante de viabilidade para contagem de células
TrypLE Express Enzyme (1X), sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	12604039	Para dissociação de células aderentes
UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Usado para preparação de tampão FACS
Tubos de centrífuga de fundo cônico de 15 mL	Corning	352097	Estéreis
Placa de cultura de tecido de 24 poços (tratada com cultura de tecido)	Corning	3524	Usada para recuperação de células NK
Placa de 96 poços de fundo redondo transparente (tratada com cultura de tecido)	Corning	3799	Usada para ensaios de co-cultura e citometria de fluxo
Placa de poliestireno preto de fundo plano transparente de 96 poços (tratada com cultura de tecido)	Corning	3603	Compatível com sistemas de imagem de células vivas