Um estudo de farmacologia em rede e acoplamento molecular da fórmula TongBi para osteoartrite

Resumo

Este protocolo prevê potenciais alvos terapêuticos e mecanismos moleculares da Fórmula TongBi contra osteoartrite usando farmacologia em rede e acoplamento molecular.

Resumo

Este estudo aplicou farmacologia em redes combinada com acoplamento molecular para prever os potenciais alvos terapêuticos e mecanismos moleculares da Fórmula TongBi (TBF) na osteoartrite (OA). Componentes ativos e alvos correspondentes do TBF foram recuperados do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Chinesa Tradicional, enquanto alvos relacionados à AA foram coletados do Online Mendelian Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank e Banco de Dados de Alvos Terapêuticos. Um software de visualização e análise de redes foi utilizado para construir redes composto–alvo e interação proteína–proteína (PPI). A anotação funcional da Gene Ontology e as análises de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes foram realizadas utilizando a plataforma Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. A análise de acoplamento molecular foi realizada utilizando um software de acoplamento molecular para avaliar a afinidade prevista de ligação entre compostos ativos chave e proteínas alvo centrais. Um total de 47 alvos sobrepostos entre TBF e OA foram identificados. A análise da rede PPI destacou JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 como potenciais alvos centrais. A análise de enriquecimento sugeriu que a TBF pode regular inflamação, metabolismo lipídico e múltiplas vias de sinalização intracelular associadas à progressão da OA. Os resultados do acoplamento molecular demonstraram afinidades favoráveis previstas de ligação entre compostos ativos centrais e alvos proteicos relacionados à OA chave. Esses achados fornecem uma estrutura computacional para entender os potenciais mecanismos da TBF contra a OA e apoiam validações experimentais adicionais.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença inflamatória degenerativa da cartilagem^{articular 1}. Atualmente, aproximadamente 58 milhões de adultos são afetados pela OA, e prevê-se que esse número aumente para 78,4 milhões até 2040^. A OA é uma causa comum de dor nas articulações e comprometimento funcional em todo^{o mundo 3}. Devido à dor intensa associada à artrosi, os pacientes frequentemente apresentam deficiências significativas em suas vidas^{diárias 4}. Idade, sexo feminino, obesidade e danos nas articulações são os principais fatores de risco para a^{AO 5}. Embora a prevalência da AO seja extremamente alta e tenha um impacto significativo nos sistemas de saúde, as opções de tratamento disponíveis continuam^limitadas. A medicina moderna adota comumente tratamentos sintomáticos, como anti-inflamatórios não esteroides e protetores da cartilagem. No entanto, a administração prolongada frequentemente causa reações adversas, incluindo danos gastrointestinais e função hepática e renal^{anormal 7}. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novos métodos de tratamento ou terapias alternativas para a OA.

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) acumulou ampla experiência no tratamento da artrite oestável, enfatizando a diferenciação de síndromes e a regulação holística. A Fórmula TongBi (TBF) é uma receita clássica composta principalmente por Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu. Do ponto de vista da MTC, a natureza patológica da Artostria se origina principalmente da invasão do vento-frio-umidade e da estagnação do qi e^{do sangue 8}. A compatibilidade herbal da TBF foi projetada para se adequar a esse mecanismo patológico central, com todos os componentes medicinais atuando sinergicamente para dissipar vento e umidade, dragar meridianos e promover a circulação sanguínea, correspondendo assim às características típicas da síndrome da MTC da OA. Pesquisas clínicas crescentes sugerem que a TBF modificada pode aliviar a dor nas articulações e melhorar a função motora dos membros em pacientes com^{OA 9}. Observações clínicas adicionais também demonstraram seu potencial para regular respostas inflamatórias em casos de artrite^{arrogante 10}, enquanto uma meta-análise recente reforçou ainda mais sua aplicabilidade clínica para a intervenção em artrite^{ardomia 11}.

Tradicionalmente, o TBF é usado para dissipar o vento, desobstruir canais, dispersar o frio, eliminar a umidade e promover a circulação sanguínea e a nutrição. No entanto, os mecanismos específicos pelos quais a TBF exerce potenciais efeitos terapêuticos contra a OA permanecem incertos, e seus componentes ativos e alvos-chave ainda não foram determinados. Para investigar esses mecanismos de forma mais sistemática e abrangente, empregamos uma abordagem de farmacologia de redes para construir um mapa de redes ilustrando as relações entre medicamentos, alvos e^{doenças 12}. Além disso, foram realizadas análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) para explorar os potenciais mecanismos moleculares e vias de sinalização envolvidos na ação farmacológica do^{TBF 13}. Para investigar sistematicamente os mecanismos farmacológicos das prescrições de MTC, este estudo estabeleceu um fluxo de trabalho analítico completo abrangendo triagem de ingredientes ativos, predição de alvos, construção de rede, análise de enriquecimento funcional e acoplamento molecular. Tal estrutura de pesquisa foi reconhecida como um paradigma padronizado e reprodutível para explorar os mecanismos moleculares das fórmulas da MTC contra a^{OA 14}. Estudos metodológicos existentes também apoiaram a racionalidade científica e a aplicabilidade prática desta estratégia^{de pesquisa 15}. Além da padronização metodológica, o presente estudo ajuda a definir a base material e os principais objetivos regulatórios do TBF na OA. Além disso, fornece referências teóricas para a aplicação clínica e futura validação experimental da TBF, além de oferecer uma estrutura metodológica viável para a exploração mecanicista de outras prescrições da MTC.

Neste estudo, utilizamos uma abordagem de farmacologia em rede para triar componentes ativos e construir uma rede composto–alvo combinada com genes-alvo relacionados à OA. Posteriormente, foram realizados análises de enriquecimento funcional e acoplamento molecular para exploração mecanicista. A farmacologia de redes integra informações biológicas e farmacológicas para investigar as relações medicamento–alvo–doença a partir de uma perspectiva abrangente e^{multifacetada 16}. Acreditamos que essa abordagem pode ajudar a esclarecer os potenciais mecanismos farmacológicos da TBF e fornecer uma base teórica para pesquisas experimentais subsequentes. O fluxo de trabalho do estudo é apresentado na Figura 1.

Figura 1. Fluxo de trabalho da farmacologia em rede e do projeto do estudo de acoplamento molecular. Visão esquemática do fluxo de trabalho analítico utilizado para investigar os potenciais mecanismos da Fórmula TongBi (TBF) contra osteoartrite (OA). O fluxo de trabalho incluiu triagem ativa de compostos, predição de alvos, coleta de alvos relacionada à OA, análise de interseção, construção de redes, análise de interação proteína-proteína (PPI), análises de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), além da validação de acoplamento molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Nenhum participante humano, animal vertebrado ou amostras de tecido estiveram envolvidos neste estudo. Todas as análises foram realizadas usando bancos de dados de bioinformática acessíveis ao público e abordagens de acoplamento molecular; portanto, não era necessária aprovação ética.

Triagem de Componentes e Alvos Correspondentes de TBF
Todos os ingredientes herbais do TBF, incluindo Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu, foram pesquisados no Banco de Dados e Plataforma de Análise de Farmacologia de Sistemas da MTC (TCMSP) (acessado em janeiro de 2026). Os termos exatos de busca correspondiam aos nomes latinos padronizados de cada remédio herbal: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) e Cyperi Rhizoma (Xiangfu). Os componentes químicos foram avaliados de acordo com os limiares fixos de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e similaridade com o medicamento (DL) ≥ 0,18. Esses valores de corte são amplamente utilizados em estudos farmacológicos de redes MTC para identificar compostos ativos biodisponíveis e semelhantes a fármacos com potencial atividade in vivo. Compostos que não possuíam valores explícitos de OB ou DL no banco de dados foram excluídos para manter a confiabilidade e consistência da triagem ativa de compostos.

Os alvos proteicos correspondentes dos compostos ativos triados foram posteriormente recuperados do banco de dados farmacológico da MTC. A padronização do gene alvo foi realizada usando o banco de dados de anotação de proteínas Universal Protein Resource (UniProt), com a espécie restrita ao Homo sapiens (acessado em janeiro de 2026). Os nomes originais das proteínas foram convertidos em símbolos oficiais de genes humanos, enquanto entradas redundantes e não humanas foram excluídas manualmente. Alvos duplicados foram removidos por meio de comparação manual e colação para gerar o conjunto de dados final de alvos TBF.

Identificação de Alvos Relacionados à AO e Potenciais Alvos Terapêuticos da TBF para a AO
Alvos relacionados à OA foram recuperados usando o termo de busca exato "Osteoartrite" nos bancos de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank e Therapeutic Target Database (TTD) (acessados em janeiro de 2026). Alvos duplicados obtidos de diferentes bancos de dados foram removidos manualmente por meio de coleta e comparação de dados para gerar o conjunto de dados alvo relacionado à OA. Para os GeneCards, apenas alvos com pontuação de relevância ≥ 3 foram mantidos. Alvos recuperados do OMIM, DrugBank e TTD usando a palavra-chave "Osteoartrite" não foram submetidos a critérios adicionais de filtragem. Os alvos sobrepostos entre alvos ativos relacionados a compostos e alvos relacionados à OA foram identificados usando a ferramenta de análise online Venn 2.1.0. A análise de interseção foi realizada para determinar os potenciais alvos terapêuticos da TBF contra a OA.

Construção da Rede TBF–Componente–Alvo
Os dados de interação componente–alvo foram importados para o software de visualização e análise de rede Cytoscape 3.10.2 para construir a rede TBF–Componente–Alvo (acessado em janeiro de 2026). Na rede construída, nós representavam compostos herbais e genes-alvo, enquanto as arestas representavam as interações entre compostos ativos e alvos correspondentes. Para evitar análises redundantes, compostos duplicados compartilhados entre múltiplas ervas foram fundidos em um único nó. A análise topológica de rede foi posteriormente realizada usando o valor de grau como parâmetro primário de avaliação. Compostos ativos centrais foram identificados de acordo com a classificação de grau e selecionados como candidatos a ligantes para análise subsequente de acoplamento molecular.

Construção da Rede PPI
Potenciais alvos terapêuticos foram importados para o banco de dados STRING de PPI para análise de IBP (acessado em janeiro de 2026). O parâmetro da espécie foi restrito ao Homo sapiens, e a pontuação mínima de confiança de interação exigida foi definida para 0,9, enquanto todos os parâmetros restantes foram mantidos nas configurações padrão. Os dados gerados de interação foram exportados e posteriormente visualizados usando o software de visualização e análise de rede. A análise topológica da rede PPI foi realizada usando o plugin de análise de topologia de rede CytoHubba. Grau, centralidade entre os dois e proximidade foram calculados para avaliar a importância dos nós dentro da rede de interação. As proteínas alvo centrais foram identificadas com base em características topológicas integradas e selecionadas para análise subsequente de acoplamento molecular. O algoritmo de Centralidade Máxima da Clique foi adotado para selecionar alvos do hub. Nós sem parceiros interagentes foram excluídos, o que resultou em um número menor de nós na rede final do que no conjunto de dados alvo importado originalmente.

GO e KEGG
Análises de enriquecimento funcional GO e análises de enriquecimento por via KEGG foram realizadas para investigar as funções biológicas potenciais e vias de sinalização associadas aos alvos terapêuticos identificados da TBF contra OA. A análise GO incluiu as três categorias padrão de ontologias: processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF), com processo biológico designado como foco principal de interpretação.

A análise de enriquecimento funcional foi realizada usando o Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada (DAVID) em combinação com o software de análise estatística R (versão 4.3.1; acessada em janeiro de 2026). Os resultados de enriquecimento foram processados e visualizados usando o pacote clusterProfer, com as funções dotplot e barplot usadas para gerar diagramas de enriquecimento. Todos os genes-alvo foram anotados com base no Homo sapiens . O método de Benjamini–Hochberg foi aplicado para correção de múltiplos testes, e um valor P ajustado < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

A visualização dos resultados de enriquecimento GO e KEGG foi realizada usando a plataforma online de análise MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet (acessado em janeiro de 2026). Gráficos de barras e gráficos de bolhas foram gerados para exibir os termos GO mais significativamente enriquecidos e os caminhos KEGG.

Acoplamento molecular
Os nomes oficiais dos genes e os correspondentes identificadores do Banco de Dados de Proteínas (PDB) dos principais alvos centrais foram recuperados do banco de dados de anotação de proteínas17, e suas estruturas cristalinas tridimensionais foram baixadas do PDB do RCSB (acessado em fevereiro de 2026). Para cada proteína-alvo, a Cadeia A foi mantida como estrutura do receptor, enquanto cadeias proteicas redundantes, heteroátomos e fragmentos estruturais não relacionados foram removidos durante a preparação do receptor. As estruturas tridimensionais dos compostos ativos centrais foram recuperadas do banco de dados PubChem (acessado em fevereiro de 2026). Neste estudo, a quercetina foi selecionada como o ligante de acoplamento representativo porque apresentava a maior centralidade topológica na rede componente–alvo e é um flavonoide bem caracterizado com efeitos protetores relatados contra patogênese da OA.

O pré-processamento de receptores e ligantes foi realizado usando software de preparação de acoplamento molecular, incluindo remoção de moléculas de água, adição de átomos de hidrogênio, tratamento por protonação e atribuição de carga de Gasteiger. A análise de acoplamento molecular foi posteriormente realizada usando o software de acoplamento molecular versão 1.5.7. As dimensões das caixas da grade foram ajustadas para abranger as regiões de ligação previstas de cada proteína-alvo. A caixa da grade estava centrada no bolso nativo de ligação ao ligante de cada proteína-alvo, com tamanho uniforme de 40 Å × 40 Å × 40 Å e espaçamento da grade de 0,375 Å. Os cálculos de acoplamento foram realizados com um parâmetro de exaustividade de 8, e nove conformações de ligação candidata foram geradas para cada par ligante–alvo. A conformação de acoplamento com a menor energia de ligação prevista foi selecionada como a pose representativa de ligação para interpretação estrutural subsequente. A validação do reacoplamento e a comparação de ligantes positivo-controle não foram realizadas neste estudo. Todos os procedimentos de acoplamento e configurações de parâmetros seguiram protocolos padrão comumente adotados em pesquisas de farmacologia de redes para apoiar a confiabilidade dos modos de ligação previstos. As conformações de acoplamento foram visualizadas usando o software de visualização molecular versão 2.5.4. Uma energia de ligação de ≤−5,0 kcal/mol foi considerada indicativa de ligação estável entre ligantes e receptores.

Resultados

Composição Química e Triagem de Alvos do TBF
Um total de 2 componentes ativos de Danggui, 65 de Danshen, 24 de Jixueteng, 21 de Haifengteng, 6 de Tougucao, 9 de Duhuo, 7 de Weilingxian e 18 de Xiangfu foram identificados após a triagem. Informações detalhadas sobre os compostos ativos avaliados são fornecidas na Tabela Suplementar 1. Um total de 2672 alvos potenciais foram inicialmente recuperados, incluindo 266 alvos para Danggui, 689 para Danshen, 236 para Duhuo, 188 para Haifengteng, 545 para Jixueteng, 192 para Tougucao, 102 para Weilingxian e 454 para Xiangfu. Informações detalhadas sobre alvos são apresentadas na Tabela Suplementar 2. Após a remoção de entradas duplicadas, 258 alvos não redundantes associados ao TBF foram obtidos.

A rede TBF–Componente–Alvo
A rede TBF–Component–Target foi construída usando dados recuperados do banco de dados farmacológico da MTC, incluindo 152 compostos ativos, 258 alvos não redundantes e 8 nós de medicina herbal. Esses dados eram organizados em dois arquivos, designados como "rede" e "Tipo" (Tabela Suplementar 3). Após importar os arquivos para o software de visualização e análise da rede, foi estabelecida uma rede abrangente contendo 578 nós e 3022 arestas (Figura 2). Na rede construída, os nós representavam remédios fitoterápicos, compostos bioativos e proteínas alvo correspondentes, enquanto as arestas representavam as interações previstas entre compostos e alvos. O tamanho maior dos nós e a intensidade de cor mais escura indicavam valores de grau mais altos e maior conectividade de rede. Com base na classificação de grau obtida por análise topológica de rede, os cinco compostos ativos mais ativos foram identificados como quercetina (A7-MOL000098), beta-sitosterol (B8-MOL000358), luteolina (A1-MOL000006), kaempferol (C1-MOL000422) e estigmasterol (C2-MOL000449).

Figura 2. TBF–Rede de interação Componente–Alvo. Visualização em rede das interações entre TBF, compostos ativos e genes-alvo previstos. Os nós representam remédios fitoterápicos, compostos ativos ou proteínas-alvo, enquanto as arestas representam interações previstas entre compostos e alvos. Tamanho maior dos nós e intensidade de cor mais escura indicam valores de grau mais altos e maior conectividade de rede. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Informações sobre alvos relacionadas à OA e potenciais alvos terapêuticos da TBF
A palavra-chave "Osteoartrite" foi pesquisada em quatro bancos de dados, resultando em 428 alvos potenciais relacionados à doença, incluindo 9 do OMIM, 349 do GeneCards, 32 do DrugBank e 38 do TTD. Um diagrama de Venn ilustrando a distribuição alvo entre os quatro bancos de dados é apresentado na Figura 3. Após a fusão e remoção de entradas duplicadas, 398 alvos únicos relacionados à OA foram obtidos. A análise de interseção entre alvos relacionados à AAO e alvos relacionados a compostos ativos com TBF identificou 47 alvos sobrepostos, que foram considerados potenciais alvos terapêuticos da TBF contra OA. O diagrama de Venn correspondente gerado usando a ferramenta online de análise de Venn é mostrado na Figura 4.

Figura 3. Diagrama de Venn de alvos relacionados à OA recuperados de múltiplos bancos de dados. Diagrama de Venn mostrando a sobreposição entre alvos relacionados à AA identificados nos bancos de dados OMIM, GeneCards, DrugBank e Therapeutic Target Database (TTD). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Identificação de alvos sobrepostos entre TBF e OA. Diagrama de Venn mostrando a interseção entre alvos ativos relacionados a compostos de TBF e alvos relacionados à OA. Os alvos sobrepostos foram considerados potenciais alvos terapêuticos da TBF contra a OA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Construção e Análise da Rede PPI
A análise de redes PPI dos 47 alvos sobrepostos foi realizada usando o banco de dados PPI (Figura 5) e posteriormente visualizada usando software de visualização e análise de rede. Durante a construção da rede, nós desconectados que representavam alvos isolados sem interações proteína-proteína (PPIs) foram removidos de acordo com procedimentos padrão de topologia da rede, resultando em uma rede refinada contendo 39 nós e 108 arestas (Figura 6). O tamanho do nó e a intensidade da cor refletiam valores de grau, indicando a importância relativa dos alvos dentro da rede.

Figura 5. Rede de PPI STRING de alvos sobrepostos. Rede PPI gerada usando o banco de dados STRING para os alvos sobrepostos entre TBF e OA. Nós representam proteínas-alvo e arestas representam IBPs previstos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6. Análise de redes centrais de PPI. Rede PPI refinada após a remoção de nós desconectados. O tamanho do nó e a intensidade da cor representam valores de grau e indicam a importância relativa dos alvos dentro da rede. Alvos centrais, incluindo JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10, demonstraram alta conectividade de rede. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A análise topológica da rede PPI foi realizada usando o plugin de análise de topologia de rede com o algoritmo Degree para calcular características topológicas dos nós. Os 10 melhores alvos classificados por valor de grau são apresentados na Tabela 1. Os cinco alvos mais bem classificados, incluindo JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10, foram selecionados como alvos centrais para análises subsequentes de acoplamento molecular, baseadas no valor de grau, centralidade de proximidade e centralidade entre os dados.

Função Biológica do GO e Análise da Via KEGG da TBF na OA
A análise de enriquecimento GO identificou várias funções biológicas relacionadas à OA, incluindo atividade de citocinas, ligação de fatores de transcrição e atividade de fatores de crescimento, sugerindo o possível envolvimento da TBF na regulação da inflamação, atividade transcricional e homeostase da cartilagem. Os 20 melhores termos GO enriquecidos foram classificados de acordo com valores de contagem e visualizados usando um gráfico de barras (Figura 7). A análise de enriquecimento da via KEGG focou nas vias de sinalização relacionadas à OA, incluindo os produtos finais avançados de glicação – via de sinalização dos receptores para produtos finais avançados de glicação, via de sinalização da interleucina-17 (IL-17), via de sinalização do fator de necrose tumoral (TNF) e via de sinalização dos receptores de células T, que estão associadas à regulação inflamatória, catabolismo de condrócitos e respostas imunes na OA. Vias relacionadas a doenças infecciosas identificadas durante a análise de enriquecimento não foram interpretadas como mecanismos diretos de OA no presente estudo. A análise de caminhos KEGG foi realizada usando o software de análise estatística para gerar uma visualização de gráfico de bolhas (Figura 8). Um total de 20 vias de sinalização significativamente enriquecidas foram identificadas. Esses resultados sugeriram que a TBF pode regular processos biológicos e vias de sinalização relacionados à OA por meio de um mecanismo farmacológico multi-alvo.

Figura 7. Análise de enriquecimento GO de potenciais alvos terapêuticos. Gráfico de barras mostrando os 20 principais termos de GO enriquecidos associados aos potenciais alvos terapêuticos da TBF contra a OA. Os termos enriquecidos incluem processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares relacionados à inflamação, regulação transcricional e homeostase da cartilagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8. Análise de enriquecimento de vias KEGG de potenciais alvos terapêuticos. Visualização do gráfico de bolhas das vias de sinalização KEGG enriquecidas no topo associadas aos potenciais alvos terapêuticos da TBF contra a OA. O tamanho da bolha representa o número de genes enriquecidos, enquanto a intensidade da cor reflete o nível de significância do enriquecimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Verificação por Acoplamento Molecular
Para investigar mais a fundo as potenciais interações de ligação entre o principal composto ativo do TBF e os alvos centrais identificados na rede PPI, foi realizada uma análise de acoplamento molecular entre a quercetina, o composto ativo mais bem classificado na rede componente–alvo, e os cinco alvos principais JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 (Tabela 2). A quercetina demonstrou a maior importância topológica na rede componente–alvo e tem sido amplamente relatada como um composto bioativo representativo associado à atividade anti-inflamatória e à regulação do metabolismo da cartilagem^18,19. As energias de ligação previstas foram −8,4 kcal/mol para JUN, −7,6 kcal/mol para RELA, −6,9 kcal/mol para IL6 e −6,7 kcal/mol para MAPK1 e IL10, indicando afinidades favoráveis de ligação previstas entre a quercetina e os alvos centrais selecionados. A visualização das conformações de ligação ligante-receptor facilitou a interpretação de potenciais interações moleculares. A versão 2.5.4 do software de visualização molecular foi usada para visualizar as conformações ótimas de acoplamento entre a quercetina e os cinco alvos centrais (Figuras 9–13).

Figura 9. Modelo de acoplamento molecular da quercetina com jun (id pdb: 1JNM). Conformação de acoplamento molecular tridimensional da quercetina ligada ao JUN. Prevê-se que a quercetina se ligasse ao domínio bZIP do JUN e se encaixasse na cavidade hidrofóbica de ligação com complementaridade estrutural. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10. Modelo molecular de acoplamento da quercetina com RELA (ID PDB: 7LEU). Conformação de acoplamento molecular tridimensional da quercetina ligada ao RELA. Prevê-se que a quercetina interaja com a região ativa do domínio de homologia de Rel RELA por meio de interações não covalentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 11. Modelo de acoplamento molecular da quercetina com IL6 (PDB ID: 1ALU). Conformação de acoplamento molecular tridimensional da quercetina ligada a IL6. Prevê-se que a quercetina ocuparia o sulco conservado de ligação ao receptor de IL6. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 12. Modelo molecular de acoplamento da quercetina com MAPK1 (ID PDB: 6D5Y). Conformação de acoplamento molecular tridimensional da quercetina ligada a MAPK1. Prevê-se que a quercetina ocupasse o bolsão de ligação ao ATP do MAPK1, sugerindo possíveis interações relacionadas à quinase. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 13. Modelo molecular de acoplamento da quercetina com IL10 (ID PDB: 1ILK). Conformação de acoplamento molecular tridimensional da quercetina ligada a IL10. Prevê-se que a quercetina interaja próxima à região de interface dímera da IL10 e pode contribuir para a estabilização do complexo proteico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Disponibilidade de Dados:
Todos os dados que apoiam os achados deste estudo estão incluídos no manuscrito, tabelas, figuras e materiais suplementares. A Tabela Suplementar 1 contém os compostos ativos triados da Fórmula TongBi (TBF), a Tabela Suplementar 2 fornece as informações correspondentes de alvo previsto, e a Tabela Suplementar 3 contém os dados de codificação e interação de redes usados para construção de redes e análise topológica.

Gene	Nome da proteína	Diploma	Centralidade da Proximidade	Centralidade entre as Partes
JUN	Fator de transcrição AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Fator de transcrição p65	15	0.56	0.15
IL6	Interleucina 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Proteína quinase 1 ativada por mitogênio	13	0.54	0.16
IL10	Interleucina 10	10	0.47	0.12
ESR1	Receptor de estrogênio	10	0.44	0.03
IL2	Interleucina 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-alfa serina/treonina-proteína quinase	9	0.44	0.04
MMP1	Matrix metalopeptidase 1	8	0.44	0.03
MMP2	Matrix metalopeptidase 2	8	0.44	0.03

Tabela 1: Parâmetros topológicos dos alvos centrais na rede PPI. Parâmetros topológicos dos principais alvos identificados na análise da rede PPI. Grau, centralidade de proximidade e centralidade entre os linfonos foram calculados para avaliar a importância dos nós e identificar alvos terapêuticos centrais associados à TBF contra a OA. Alvos com valores de grau e centralidade mais altos foram considerados mais importantes dentro da rede de interação.

Alvo	PDB ID	Coordenadas do Local Ativo (X, Y, Z)	Ligando	Afinidade de Ligação (kcal/mol)
JUN	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Quercetina	−8,4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23,889; Z = −0,778		−7,6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8,749		−6,9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12.800; Z = 20,749		−6,7
IL10	1ILK	X = 17.836; Y = 46,443; Z = 38,685		−6,7

Tabela 2: Parâmetros de acoplamento molecular e afinidades de ligação entre quercetina e proteínas alvo centrais. O acoplamento molecular resulta entre a quercetina e as proteínas alvo centrais selecionadas JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. A tabela apresenta identificadores do Banco de Dados de Proteínas (PDB), coordenadas do centro de grade do local ativo usadas para cálculos de acoplamento e valores previstos de afinidade de ligação obtidos por análise molecular de acoplamento. Valores mais baixos de energia de ligação indicam uma afinidade prevista de ligação ligante-receptor mais forte.

Tabela suplementar 1: Compostos ativos identificados a partir do TBF. Informações detalhadas sobre os compostos ativos triados a partir do TBF, incluindo nomes de compostos, identificadores moleculares, valores de OB, valores DL e fontes herbais correspondentes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Alvos previstos correspondentes a compostos ativos de TBF. Lista abrangente de alvos proteicos previstos correspondentes aos compostos ativos triados do TBF, incluindo símbolos padronizados de genes humanos obtidos após a normalização e deduplicação do alvo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Informações de codificação de rede para a rede TBF–Componente–Alvo. Informações detalhadas de codificação usadas para a construção da rede de interação componente TBF–alvo, incluindo identificadores moleculares, informações de alvo, relações de rede e dados de classificação de nós usados para análise de topologia de rede. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo utilizou farmacologia em rede e abordagens de acoplamento molecular para investigar os potenciais mecanismos da TBF contra a OA. Os principais remédios herbais analisados incluíam Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu. Estudos anteriores demonstraram que Danggui (Angelica sinensis Radix) pode aliviar alterações patológicas relacionadas à OA, incluindo degeneração da cartilagem, esclerose óssea subcondral, marcha anormal e inchaço do joelho na desestabilização dos modelos do menisco^{medial 20}. Em modelos de células OA induzidas por IL-1β, o Danggui reduziu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e aumentou a atividade de enzimas antioxidantes, incluindo superóxido dismutase e^{glutationa 21}. A danshenindiona IIA, um constituinte ativo da Salvia miltiorrhiza, foi relatada como aliviando a degeneração da cartilagem, restaurando a homeostase da remodelação óssea subcondral e suprimindo angiogênese anormais em modelos camundongos de^{OA 22}. Além disso, componentes derivados de S. miltiorrhiza podem regular o estresse oxidativo e o metabolismo^{ósseo 23,24}. Spatholobus suberectus Dunn foi relatado como regulador das vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR e Ras/^{Raf/MAPK 25}, que estão associadas ao metabolismo da cartilagem e à progressão da OA. Extratos de S. suberectus Dunn também inibem a produção de quimiocinas pró-inflamatórias²⁶. Além disso, atividades anti-inflamatórias e antioxidantes relatadas para a Impatiens balsamina podem ser relevantes para a patogênese da OA porque a inflamação crônica e o estresse oxidativo contribuem para a degeneração^{da cartilagem 27}. Radix Angelicae Biseratae também tem sido associada à melhora da circulação sanguínea e ao alívio dos sintomas relacionados à artrite ^28,29. Estudos limitados investigaram os potenciais efeitos terapêuticos de Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) e Xiangfu (Ciperi Rhizoma) na OA.

A predição computacional baseada na rede de IBP sugeriu que a TBF pode exercer efeitos terapêuticos contra a OA por meio da regulação das respostas inflamatórias e proteção da cartilagem articular, embora essas previsões exijam validação experimental adicional. Os alvos centrais com valores de grau relativamente altos na rede PPI incluíam JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. Estudos anteriores demonstraram que o JUN está associado ao envelhecimento dos condrócitos e à progressão da OA. Camundongos dupla mutantes JunB/Jun apresentam infiltração inflamatória nos tecidos articulares acompanhada de destruição óssea e^{periostitite 30}. Análises transcriptômicas da cartilagem osteoartrítica e da sinóvia também mostraram redução da expressão^{JUN 31}. Além disso, a diminuição da expressão da proteína JUN foi observada em modelos de ratos OA induzidos por transecção do ligamento cruzado anterior e em condrócitos^{senescentes 32}. Estudos anteriores sugeriram ainda que a sinalização relacionada ao JUN pode regular a degeneração da cartilagem, apoptose, autofagia e metabolismo da matriz extracelular nos condrócitos^{OA 33}. Estudos anteriores também demonstraram que fragmentos derivados de RNA de transferência regulam a proliferação e sobrevivência dos condrócitos articulares por meio das vias de sinalização associadas a^{RELA 34}. Além disso, a regulação para cima do gene Sox9, combinada com a inibição da expressão de RELA em células estromais mesenquimatosas, aumentou as capacidades condrogênicas e imunomoduladoras e desacelerou a progressão da OA em modelos^{experimentais 35}. Esses achados apoiam a possível relevância das vias de sinalização relacionadas a JUN e RELA identificadas na presente análise computacional.

O IL6 é um mediador inflamatório chave na OA e desempenha um papel importante no metabolismo da cartilagem ao influenciar tanto a degradação quanto o processo de reparo. Em condições inflamatórias crônicas de baixo grau, níveis elevados de IL6 contribuem para a senescência dos condrócitos, redução da síntese da matriz cartilaginosa e perturbação da homeostase^{da cartilagem 36}. Estudos anteriores demonstraram que a sinalização do receptor IL6/JAK2 participa da regulação da apoptose celular senescente, e a remoção direcionada das células senescentes pode atenuar a progressão da^{OA 37}. Além disso, Li Q e colegas relataram que a regulação para alta do miR-186-5p regulou as respostas inflamatórias em condrócitos estimulados por IL-1β, enquanto a inibição de miR-186-5p aliviou a progressão da OA por meio do aumento da expressão de^{MAPK1 38}. Esses achados apoiam o possível envolvimento das vias de sinalização relacionadas a IL6 e MAPK1 identificadas na presente análise computacional.

O IL10 desempenha um papel protetor na homeostase da cartilagem e pode contribuir para a manutenção do microambiente da cartilagem. Estudos anteriores demonstraram que a IL10 inibe a apoptose dos condrócitos por meio da regulação das vias apoptóticas mitocondriais, redução da atividade das caspases e modulação da razão Bax/^{Bcl-2 39}. Além disso, a IL10 tem sido associada à redução da degradação da matriz extracelular e à diminuição da expressão de fatores relacionados à degradação da matriz, incluindo MMP3, MMP13, ADAMTS4 e a síntese induzível de óxido nítrico, em modelos⁴⁰ de cartilagem articular comprimida. A análise de enriquecimento da via KEGG no presente estudo sugeriu que as vias de sinalização IL-17, TNF e fator induzível por hipóxia 1 (HIF-1) podem estar associadas aos efeitos terapêuticos previstos da TBF contra a OA, embora essas previsões computacionais exijam confirmação experimental. Estudos anteriores demonstraram que a IL-17 contribui para a progressão da OA por meio da regulação das respostas inflamatórias e da atividade das células^{sinoviais 41,42}. O aumento da expressão de IL-17 também foi positivamente correlacionado com a gravidade da doença na^{OA 43} do joelho. O TNF-α é outro mediador inflamatório importante associado à inflamação, dor e degeneração da cartilagem relacionadas à OA, e a inibição da sinalização do TNF-α pode aliviar a progressão da^{doença 44}. Além disso, o HIF-1α desempenha um papel importante no metabolismo hipóxico dos condrócitos, regulação da matriz extracelular, inflamação sinovial e remodelação óssea subcondral na^{OA 45}. Estudos anteriores também sugeriram que a inibição da sinalização relacionada ao HIF-1α pode proteger a função dos condrócitos e reduzir a degeneração^{da cartilagem 46}. Esses achados são consistentes com as vias de sinalização identificadas pela presente análise de enriquecimento computacional.

Esse estudo in silico apresenta várias limitações importantes. Primeiro, a análise baseou-se em bancos de dados públicos disponíveis, que podem conter informações incompletas ou tendenciosas sobre compostos herbais e anotações de alvo. Além disso, métodos computacionais de predição de alvos envolvem incerteza inerente, e as interações previstas identificadas neste estudo exigem verificação experimental. A análise de acoplamento molecular reflete potencial teórico de ligação, em vez de atividade fisiológica ou farmacológica direta. Além disso, nenhum experimento in vitro ou in vivo foi realizado para validar as previsões computacionais. Fatores como dosagem de ervas, farmacocinética e a biodisponibilidade geral da fórmula combinada também não foram avaliados. Portanto, todas as conclusões derivadas do presente estudo devem ser consideradas preditivas e requerem confirmação experimental adicional.

O presente estudo, baseado em farmacologia de redes e análises de acoplamento molecular, fornece uma estrutura preditiva para investigar os potenciais mecanismos da TBF contra a OA. Os resultados sugeriram que a TBF pode regular múltiplos alvos relacionados à OA por meio de interações entre compostos ativos derivados de suas oito ervas constituintes. Os alvos identificados foram enriquecidos em processos biológicos e vias de sinalização associados à regulação inflamatória, metabolismo lipídico e sinalização relacionada à hipóxia, incluindo as vias IL-17, TNF e HIF-1. A análise de acoplamento molecular demonstrou ainda afinidades favoráveis previstas de ligação entre a quercetina e os alvos centrais JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. Coletivamente, esses achados sugerem que a TBF pode exercer efeitos regulatórios multicomponentes e multi-alvo contra a OA. Este estudo também fornece uma estratégia teórica e uma estrutura metodológica para futuros estudos mecanicistas e validação experimental das fórmulas da MTC na pesquisa em A.O.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AutoDockTools	Software	Versão 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Software	Versão 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot function	Função de visualização R	Pacote clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	Pacote R	Pacote Bioconductor para análise de enriquecimento	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Plugin	Compatível com Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Software	Versão 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Banco de Dados	Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot function	Função de visualização R	Pacote clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Banco de Dados	Universidade de Alberta	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Banco de Dados	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Plataforma Online	Plataforma online de visualização de enriquecimento	https://microbiomenet.com/
OMIM	Banco de Dados	Herança Mendeliana Online no Homem	https://www.omim.org/
PDB	Banco de Dados	Banco de Dados de Dados de Proteínas RCSB	https://www.rcsb.org/
PubChem	Banco de Dados	Centro Nacional de Informações de Biotecnologia	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Software	Versão 2.5.4	https://pymol.org/
R	Software	Versão 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Banco de Dados	Ferramenta de Busca para Recuperação de Genes/Proteínas Interagentes	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Banco de Dados	Banco de Dados e Plataforma de Análise de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Banco de Dados	Banco de Dados de Alvo Terapêutico	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Banco de Dados	Recurso Universal de Proteína	https://www.uniprot.org/
Venny	Software	Versão 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html