Esse protocolo fornece um método padronizado e de alto rendimento de triagem de compostos, utilizando peixe-zebra in vivo para quantificar a perda de neurônios dopaminérgicos e déficits comportamentais locomotores, possibilitando uma triagem eficiente de compostos neuroprotetores.
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Artigo de método
Fenotipagem In Vivo da Neurodegeneração Dopaminérgica em Larvas de Peixe-Zebra Usando Análise Comportamental e Imagem de Alto Conteúdo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa em descoberta de fármacos em neurodegeneração é limitada pelo alto custo e baixa capacidade de produção dos modelos tradicionais de mamíferos. Esse gargalo é particularmente observado em pesquisas sobre a doença de Parkinson, onde estudos rigorosos e escaláveis sobre neurodegeneração dopaminérgica (DA) continuam lentos e consomem muitos recursos. Para suprir essa lacuna, apresentamos um pipeline padronizado de fenotipagem de alto rendimento usando um modelo transgênico de peixe-zebra expressando nitroredutase em neurônios DA para estudar a perda de neurônios DA dentro de cinco dias após a fertilização. O peixe-zebra oferece vantagens fundamentais para a neurociência translacional, incluindo rápido desenvolvimento larvar, transparência óptica que possibilita a imagem cerebral inteira in vivo , forte conservação de genes e vias relevantes para a doença de Parkinson e circuitos neurais intactos inacessíveis em modelos de cultura celular. Nosso protocolo integra ablação quimiogenética e imagens de alto conteúdo para gerar conjuntos de dados rápidos para triagem. Os neurônios DA são ablacionados seletivamente usando metronidazol (MTZ), produzindo neurodegeneração específica e ajustável. O tratamento com MTZ produz reduções dependentes de dose na locomoção, consistentes com fenótipos semelhantes aos de bradicinésia, fornecendo um correlacionado comportamental robusto à perda de células DA. Como a doença de Parkinson é fundamentalmente um distúrbio motor, combinamos medições anatômicas com leituras comportamentais funcionais. A atividade locomotora é registrada diretamente em uma placa e quantificada usando rastreamento automatizado, extraindo métricas incluindo distância total percorrida, frequência de nado e início de explosão. Os peixes-zebra fornecem um sistema modelo eficiente e escalável no qual centenas de larvas podem ser analisadas simultaneamente com manuseio mínimo. Otimizamos um protocolo de triagem de drogas baseado em placas de alto rendimento, projetado para minimizar a variância experimental na pesquisa de graduação. Esse formato padronizado, baseado em placas, para triagem de compostos candidatos para neuroproteção ou resgate funcional garante que os dados coletados por diferentes pesquisadores permaneçam estatisticamente comparáveis e eficazes para identificar candidatos neuroprotetores, melhorando a reprodutibilidade. Juntas, essa metodologia fornece uma estrutura robusta e escalável para pesquisas em neurodegeneração.
Introdução
A pesquisa em descoberta de fármacos em neurodegeneração enfrenta um gargalo significativo de eficiência devido ao alto custo e baixo fluxo dos modelos tradicionais demamíferos 1,2, exigindo planejamento experimental cuidadoso e o uso de uma grande força de trabalho. O objetivo geral desse método é fornecer uma abordagem padronizada e de alta taxa usando o Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) modelo transgênico de peixe-zebra, no qual a nitroredutase-mCherry é expressa especificamente em neurônios dopaminérgicos (DA) para estudar a perda e déficits de locomoção dos neurônios DA. A raz....
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Protocolo
Todos os métodos envolvendo o uso de vertebrados foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (aprovação IACUC AUP-25-098).
1. Criação de peixes-zebra
- Manter as condições do sistema aquático
- Manter o sistema aquático recirculante em 28,5°C (faixa aceitável: 26°C–30°C), pH 7,1–7,8 e condutividade 600–700 μS/cm. Mantenha peixes-zebra adultos com uma densidade de repovoamento de aproximadamente 5 peixes/L em aquários domésticos.
- Monitore diariamente os níveis de amônia, nitrito e nitrato usando um kit de....
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Resultados
O tratamento com MTZ causa perda de neurônios dopaminérgicos dependentes de dose e comprometimento locomotor
Para determinar os parâmetros ideais para a ablação mediada por MTZ de neurônios DA, a intensidade de fluorescência, usada como proxy para a sobrevivência dos neurônios DA, e a distância locomotora foram avaliadas em concentrações MTZ de 3, 4,5 e 9 mM após tratamento de 24 horas. Cada grupo de tratamento consistia em n = 10 indivíduos T.......
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Discussão
Esse protocolo oferece uma pipeline escalável e in vivo para quantificar a perda neuronal da DA e rastrear compostos neuroprotetores usando o sistema quimiogenético NTR–MTZ em peixes-zebra transgênicos. O fluxo de trabalho padronizado baseado em placas foi desenvolvido especificamente para equipes de pesquisa de graduação, onde a rotatividade de operadores é alta e a experiência dos pesquisadores varia entre os períodos acadêmicos. Cada etapa do fluxo de trabalho foi estruturada para pri.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos financeiros de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Su Guo (Universidade da Califórnia, São Francisco) por fornecer o peixe-zebra transgênico, e ao Dr. Daeseok Eom, Dr. Michael Parsons e Eddie Hallo (Universidade da Califórnia, Irvine) por fornecer embriões do tipo selvagem e orientação sobre a criação de peixes-zebra e manutenção de instalações para peixes. Também agradecemos aos membros da equipe do Robert A. Mah Molecular Innovation Center e do Falling Leaves Innovation Building (Universidade da Califórnia, Irvine) por fornecerem infraestrutura para a instalação aquática.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dieta de peixe-zebra adulto, pellets de 0,5 mm | Zeigler | AH271 | Usado para alimentar peixes-zebra adultos durante o manejo rotineiro |
| Agarósio, baixo ponto de fusão (LMA) | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Usado para incorporar larvas em poços para posicionamento estável durante a imagem |
| Folha de alumínio | ULINE | S-20197 | Usada para proteger reagentes sensíveis à luz, como MTZ, durante a preparação e incubação |
| CellProfiler | Broad Institute | RRID: SCR_007358 | Usado para análise de imagem de fluorescência automatizada opcional |
| Tubo cônico, 15 mL | Corning | 352097 | Usado para preparação de reagentes e manuseio de amostras |
| Tubo cônico, 50 mL | Corning | 352070 | Usado para preparação de reagentes e armazenamento de solução |
| Tanques de cruzamento (1,0 L) | Aquaneering | ZHCT100 | Usados para reprodução controlada de peixe-zebra e coleta de embriões |
| Danio rerio (AB tipo selvagem) | — | — | Linha de controle não transgênica usada para validar a especificidade dos efeitos dependentes da nitrorredutase |
| Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)) | — | — | Linha de peixe-zebra transgênica expressando nitrorredutase-mCherry em neurônios dopaminérgicos para ablação quimiogênica direcionada |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anidro (≥99,9%) | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | Solvente para PTU, MTZ e compostos de triagem |
| EthoVision XT | Noldus | RRID: SCR_000441 | Software de rastreamento comportamental usado para quantificar a locomoção larval |
| Fiji (ImageJ) | NIH | RRID: SCR_003070 | Software de análise de imagem usado para quantificação de fluorescência |
| Pinças de ponta fina ou sonda de 0,25 mm | World Precision Instruments | WPI0118 | Usado para orientar larvas durante a incorporação em agarósio |
| Microscópio de fluorescência | Zeiss | 11845460 | Usado para imagem de neurônios dopaminérgicos via fluorescência mCherry |
| Gemma Micro 150 ZF (dieta juvenil, 100–200 μm) | Skretting | 10818945 | Usado para alimentar peixes-zebra juvenis |
| Gemma Micro 75 ZF (dieta larval, 50–100 μm) | Skretting | 10818935 | Usado para alimentar larvas de peixe-zebra |
| GraphPad Prism | GraphPad | RRID: SCR_002798 | Software de análise estatística usado para análise e plotagem de dados |
| Bloco de aquecimento (capaz de 42°C e 70°C) | Thermo Fisher | 88870001 | Usado para derreter e manter agarósio em temperaturas controladas |
| Câmera de alta resolução (montagem superior compatível) | Basler | 88-327 | Usada para registrar a atividade locomotora larval |
| Ácido clorídrico (HCl), 0,1 M | Fisher Scientific | SA48-500 | Usado para ajustar o pH durante a preparação de tricaine |
| Incubadora (28,5°C, fotoperíodo de 14 h luz:10 h escuridão) | Millipore | Z763314 | Mantém condições ambientais controladas para o desenvolvimento do peixe-zebra |
| Sal marinho Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | Usado para preparar água de ovo azul (BEW) |
| Folha difusora de luz (ou equivalente) | Edmund Optics | 27-103 | Usada para fornecer iluminação uniforme e minimizar o brilho durante a gravação comportamental |
| Lâmpada de luz | Lightcraft | LC2004LED | Fornece iluminação inferior durante o rastreamento locomotor |
| Metronidazol (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761-100G | Usado para ablação quimiogênica de neurônios dopaminérgicos |
| Azul de metileno, solução aquosa a 1% | Sigma-Aldrich | M9140 | Adicionado ao BEW para prevenir o crescimento microbiano em embriões |
| Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL | Eppendorf | 22363204 | Usado para alíquota de reagentes e armazenamento |
| Micropipeta, P200 | Gilson | FP10005S | Usado para manusear larvas e preparar soluções |
| Pratos de Petri, 100 mm | Corning | CLS430167 | Usado para coleta e incubação de embriões |
| Pontas de pipeta, 200 μL | RAININ | 30389188 | Usado com micropipetas para manuseio de líquidos e transferência de larvas |
| Cloreto de sódio (NaCl), ≥99,0% | Sigma-Aldrich | S9888-500G | Usado para preparar tampão e soluções aquosas |
| Hidróxido de sódio (NaOH), 0,1 M | Fisher Scientific | SS256-500 | Usado para ajustar o pH durante a preparação de tricaine |
| Estereomicroscópio | Nikon | SMZ-745 | Usado para manipulação e orientação de larvas durante a incorporação |
| Tapete térmico controlado por temperatura (25°C–28°C) | Vivosun | V-SHMDT | Mantém temperatura estável durante a gravação comportamental |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521-10G | Usado como anestésico para larvas de peixe-zebra |
| Base de tris | Fisher Scientific | BP152-1 | Usado na preparação da solução tamponada de tricaine |
| Sistema de purificação de água | Millipore | ZIQ7003T0 | Usado para gerar água desionizada para preparação de soluções |
| Tanques de manutenção de peixe-zebra | Aquaneering | ZS560 | Usado para manter populações de peixes-zebra adultos |
| 1-Fenil-2-tioureia (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Usado para inibir a melanogênese e manter a transparência óptica |
| Placa de 6 poços, fundo plano | Corning | 07-200-83 | Usada para ensaios comportamentais locomotores |
| Placa de 96 poços, fundo plano | Greiner Bio-One | 655096 | Usada para |
Referências
- Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
- Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J.
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Reimpressões e permissões
