Mecanismos da Fórmula 3 de Qu para Melhorar a Receptividade Endometrial na SOP: Uma Combinação de Farmacologia de Rede e Simulação de Dinâmica Molecular

Resumo

Este protocolo visa explorar o mecanismo pelo qual o QUF3 melhora a receptividade endometrial na SOP usando farmacologia em rede, docking e simulação de MD.

Resumo

A receptividade endometrial comprometida é uma das principais causas de infertilidade na síndrome do ovário policístico (SOP). A Fórmula 3 de Qu (QUF3) é uma fórmula chinesa de fitoterapia utilizada clinicamente para melhorar a receptividade endometrial em pacientes com SOP. Este estudo utilizou farmacologia em rede, acoplamento molecular e simulações de dinâmica molecular (MD) para investigar os mecanismos subjacentes. Constituintes ativos do QUF3 foram identificados usando o banco de dados TCMSP, e potenciais alvos relacionados à receptividade endometrial e SOP foram recuperados do DrugBank e de outros recursos. Uma rede de interação composto-alvo e uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foram construídas via Cytoscape para identificar alvos-chave. Os alvos centrais foram submetidos a análises de enriquecimento GO e KEGG. Acoplamento molecular, simulações MD, análise de componentes principais (PCA), paisagem de energia livre (FEL) e matriz dinâmica de correlação cruzada (DCCM) foram usados para avaliar interações de ligação. A partir de 91 princípios ativos e 294 potenciais alvos medicamentosos, foram identificados 60 alvos relacionados à doença. Luteolina e sesamina estavam entre os principais componentes farmacodinâmicos. Dez alvos principais foram identificados: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 e MMP9. O enriquecimento KEGG revelou 132 vias de sinalização, e a análise GO identificou 678 entradas. Simulações MD indicaram que a ligação entre os cinco principais constituintes ativos e seus respectivos alvos era estável. PCA, FEL e DCCM também demonstraram alta estabilidade termodinâmica e rigidez estrutural desses complexos. Em conclusão, o QUF3 melhora a receptividade endometrial na SOP por meio de interações multicomponentes, multialvo e multivias. Este estudo fornece uma base teórica, sob a perspectiva da simulação computacional, para o desenvolvimento de terapias direcionadas de medicina herbal chinesa para infertilidade relacionada à SOP, e pode ter implicações positivas para melhorar os resultados da gravidez em mulheres com SOP no futuro.

Introdução

A síndrome do ovário policístico (SOP) é um dos distúrbios endócrinos mais comuns em^{mulheres 1}. Suas principais características incluem disfunção ovulatória crônica persistente, hiperandrogenemia clínica ou bioquímica e morfologia ovariana policística, com manifestações clínicas como amenorreia, infertilidade, hirsutismo, acne e obesidade. Nos últimos anos, avanços na indução da ovulação e na tecnologia de reprodução assistida (TAR) melhoraram significativamente as taxas de gravidez em pacientes com SOP; No entanto, os desfechos na gravidez continuam sendo piores do que em mulheres^{saudáveis 2,3}. A receptividade endometrial é um fator chave que influencia os desfechos da^{TAR 4}. Receptividade endometrial refere-se à capacidade do endométrio de aceitar um embrião em um estágio fisiológico específico, o que desempenha um papel decisivo na implantação e desenvolvimento subsequente^{do embrião 5,6}. Condições patológicas comumente observadas na SOP, como obesidade, resistência à insulina e inflamação crônica, podem prejudicar a receptividade endometrial, dificultar a implantação de óvulos fertilizados e o desenvolvimento do embrião, e, por fim, levar à infertilidade e aborto^{espontâneo 7,8}. No entanto, os mecanismos regulatórios subjacentes à receptividade endometrial na SOP permanecem em grande parte incertos, e a rede de interação entre os diversos fatores influenciadores ainda precisa ser esclarecida. A Fórmula 3 de Qu (QUF3), uma fórmula chinesa de fitoterapia utilizada clinicamente para melhorar a receptividade endometrial em pacientes com SOP, é apoiada por sólidas teorias clássicas da medicina tradicional chinesa (MTC) na ginecologia. A fórmula consiste em Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) e Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Shanzhuyu) na proporção de 2:4:3:4:3:3:2:2, preparado por extração de etanol. O QUF3 exerce efeitos sinérgicos de múltiplas ervas, tonificando o rim, enriquecendo a essência, nutrindo o sangue e promovendo a circulação^{sanguínea 9}. Sua eficácia clínica na melhoria da receptividade endometrial em pacientes com SOP foi bem validada, mas seus principais mecanismos farmacológicos ainda precisam de investigação adicional.

A farmacologia de redes é uma abordagem analítica baseada em biologia de sistemas que constrói redes multinível "componente herbal-doença-alvo" para revelar, a partir de uma perspectiva holística, os efeitos da intervenção de medicamentos nas redes de doenças. Diferentemente do modelo tradicional "fármaco único-alvo único", a farmacologia em redes pode capturar de forma abrangente as características sinérgicas das ações "multicomponente, múltiplos alvos e múltiplas vias" das fórmulas da MTC, tornando-a particularmente adequada para investigar os complexos mecanismos da MTC. A simulação de dinâmica molecular (MD), por outro lado, é uma técnica computacional baseada na mecânica newtoniana que simula, em nível atômico, as mudanças conformacionais e o comportamento dinâmico dos complexos proteína-ligante ao longo do tempo. Comparada ao acoplamento molecular estático, a simulação MD pode avaliar parâmetros dinâmicos, como estabilidade de ligação, paisagens de energia livre e rigidez estrutural, proporcionando assim uma avaliação mais realista das interações entre moléculas de fármacos e proteínas alvo. A farmacologia de redes é adequada para a triagem global de potenciais alvos e caminhos das fórmulas da MTC, enquanto a simulação de MD pode avaliar dinamicamente a estabilidade de ligação entre componentes-chave e proteínas alvo. Combinar essas duas abordagens permite uma análise mais confiável dos mecanismos sinérgicos multi-componentes e multi-alvo das fórmulas da MTC. Com base nessa lógica, este estudo utilizou uma abordagem combinada de farmacologia em redes e simulação de MD para explorar sistematicamente os potenciais mecanismos farmacológicos subjacentes à melhoria da receptividade endometrial do QUF3 em pacientes com SOP.

Esse fluxo de trabalho computacional combinado é mais adequado para a exploração inicial dos mecanismos multicomponentes e multi-alvo das fórmulas herbais chinesas ou produtos naturais, especialmente para sistemas complexos nos quais os ingredientes ativos e alvos são amplamente desconhecidos. Os usuários devem ter conhecimentos básicos de bioinformática, incluindo busca em bancos de dados e análise de redes, bem como a capacidade de realizar análises fundamentais de biologia computacional, como acoplamento molecular e simulações de dinâmica molecular, utilizando pacotes de software comuns. Recomenda-se um ambiente computacional baseado em Linux com pelo menos 16 GB de RAM, juntamente com acesso a bancos de dados públicos relevantes, como o Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP), PubChem e UniProt. Todo software utilizado nesse fluxo de trabalho (por exemplo, Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS) é de código aberto ou gratuito para uso acadêmico, e os leitores podem obtê-lo a partir das informações fornecidas na Tabela de Materiais.

Protocolo

Triagem de constituintes ativos e potenciais alvos do QUF3
Os componentes químicos ativos de Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjisheng, Danshen e Shanzhuyu no medicamento QUF3 foram identificados pelo TCMSP em 1º de abril de^{2025 10}. Os ingredientes ativos foram preliminarmente avaliados com base nas condições de biodisponibilidade oral (OB) ≥30% e semelhança com fármacos (DL) ≥ 0,18¹¹. Esses limiares foram escolhidos como critérios empíricos padrão para garantir absorção suficiente e propriedades semelhantes às de medicamentos. A sequência canônica SMILES de cada composto foi pesquisada no banco de dados PubChem, e a sequência resultante foi usada para prever os alvos dos compostos no banco de dados online Swiss Target Prediction, seguida pela coleta dos nomes dos genes de proteínas alvo e IDs UniProt do banco de dados^UniProt 12,13,14. Como checkpoint intermediário, o número de alvos únicos obtidos após a deduplicação foi registrado.

Identificação de alvos de ação para receptividade endometrial na SOP
As palavras-chave "síndrome do ovário policístico" e "receptividade endometrial" foram usadas como termos de busca nos bancos de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) e GeneCards para identificar potenciais alvos 15,16,17,18. Para os GeneCards, apenas alvos com pontuação de relevância >5 foram mantidos; para os outros bancos de dados, todos os alvos recuperados foram incluídos. Após a fusão e remoção de entradas duplicadas, o número de alvos únicos associados à doença foi registrado como um resultado intermediário.

Construção de componentes e alvos em rede
Os alvos de interseção foram gerados inserindo os possíveis alvos para QUF3, SOP e receptividade endometrial em uma ferramenta online de diagrama de Venn. Esses alvos de interseção foram considerados os principais alvos através dos quais o QUF3 exerce sua eficácia na melhoria da receptividade endometrial na SOP. Subsequentemente, uma rede "herb-constituent-target" (H-C-T) foi criada ao combinar esses alvos de interseção com os dados ativos de constituinte-alvo do QUF3 usando o Cytoscape¹⁹. A rede foi visualizada usando a ferramenta "Network Analyzer".

Construção de redes de interação proteína-proteína (PPI)
Genes alvo potenciais do QUF3 para melhorar a receptividade endometrial na SOP foram enviados como entrada para a plataforma de dados^{STRING 20}. A espécie foi definida para "Homo sapiens" e o limiar de confiança foi definido para "confiança média (0,4)", gerando um arquivo TSV com dados de interação proteína-proteína. Esse arquivo foi então importado para um software de análise de rede para construir e analisar a rede^{PPI 21}. A importância do nó na rede é indicada pelo valor "Grau": um valor de Grau maior indica um nó mais significativo. Posteriormente, os principais ingredientes ativos foram organizados por Grau, e os 10 principais alvos principais foram selecionados com base no ranking do Grau.

Ontologia genética (GO) e análise da Enciclopédia de Enriquecimento de Vias de Genes e Genômas de Kyoto (KEGG)
Análises de enriquecimento das vias GO e KEGG foram realizadas utilizando o banco de dados DAVID para explorar as vias biológicas e mecanismos pelos quais o QUF3 melhora a receptividade endometrial na^{SOP 22}. A espécie foi definida para "Homo sapiens", e o limite de significância foi fixado em P < 0,05. A análise GO abrangeu processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e função molecular (MF)²³. Os resultados foram ordenados pelo número de alvos enriquecidos. Vias relacionadas ao metabolismo humano e doenças foram então excluídas, e as 20 melhores vias KEGG foram selecionadas para visualização. Uma rede multidimensional "via componente-doença-KEGG" foi posteriormente construída usando software de análise de rede.

Análise de acoplamento molecular
Os 10 principais constituintes ativos e os 10 principais alvos centrais foram selecionados para análise de acoplamento molecular usando AutoDockTools e o software^{PyMOL 24,25}. Arquivos PDB dos principais alvos foram baixados de um banco de dados de estruturas de proteínas²⁶, e arquivos SDF dos principais componentes ativos foram obtidos de um banco de dados^{químico 27}. As moléculas de proteína foram então pré-processadas usando software de acoplamento molecular, que incluiu dessalinização, hidrogenação e cálculo de carga. O acoplamento semi-flexível foi realizado usando uma grade box que cobre todo o sítio de ligação à proteína. O processo de acoplamento foi considerado bem-sucedido quando a energia de ligação era negativa, e o desvio quadrático médio (RMSD) da pose superior era ≤ 2,0 Å. Após o acoplamento, os resultados dos principais componentes ativos do QUF3 com os alvos centrais foram visualizados usando software de visualização molecular.

Simulações de dinâmica molecular (MD)
Simulações de MD do complexo proteína–ligante foram realizadas usando o software GROMACS para explorar a interação entre receptores e ligantes^28,29. O campo de força âmber99sb-ildn e o campo de força âmbar geral (GAFF) foram usados para gerar os parâmetros e topologias de proteínas e ligantes, respectivamente. O tamanho da caixa de simulação foi definido de modo que a distância entre cada átomo de proteína e a borda da caixa fosse maior que 1,0 nm. A caixa foi preenchida com um solvente explícito usando o modelo simples de carga pontual (moléculas de água SPC216), e as moléculas de água foram substituídas por contraíons Na⁺ e Cl⁻ para tornar o sistema de simulação eletricamente neutro. Todo o sistema foi otimizado pelo método de descida mais íngreme para reduzir contatos irrazoáveis ou sobreposições de atômicos. A pré-equilíbrio suficiente do sistema de simulação foi alcançada ao executar conjuntos NVT e NPT para 100 ps cada a 300 K e 1 bar, respectivamente. Posteriormente, uma simulação MD de 100 ns foi realizada sob condições de contorno periódicas, com temperatura (300 K) e pressão (1 bar) controladas pelos métodos V-rescale e Parrinello-Rahman, respectivamente,³⁰. As equações newtonianas de movimento foram resolvidas usando o integrador leapfrog com um intervalo de tempo de 2 fs. Interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas usando o método Particle Mesh Ewald (PME) com espaçamento de Fourier de 0,16 nm, e todos os comprimentos de ligação foram restritos usando o método LINÇ. O software VMD era usado para exibir, analisar e animar trajetórias³¹. A energia livre de ligação de cada composto foi calculada usando um script de cálculo de energia livre de ligação.

Análise de componentes principais (PCA), paisagem de energia livre (FEL) e análise dinâmica de matriz de correlação cruzada (DCCM)
A PCA foi realizada usando software de simulação MD para analisar os movimentos conformacionais dominantes dos complexos apo e ligando. Foram geradas matrizes de covariância das flutuações atômicas de Cα, das quais foram obtidos autovetores (movimentos coletivos) e autovalores (magnitude do movimento)³². Regiões dinâmicas chave e flexibilidade estrutural associadas à ligação de ligantes foram identificadas por meio desta análise. Trajetórias moleculares foram projetadas nos dois primeiros componentes principais (PC1 e PC2) usando a ferramenta aneig GMX, capturando assim os movimentos^{essenciais 33}. Apenas os 100 ns finais equilibrados (fase RMSD-estável) foram usados para os cálculos de PCA e FEL. A FEL foi derivada dos dados da PCA usando o fã gmx para calcular a energia livre^{de Gibbs 34}, revelando conformações estáveis e mínimos de energia que refletem diversidade conformacional e transições de estado. A análise dinâmica de matriz de correlação cruzada (DCCM) dos átomos de Cα foi realizada para avaliar a dinâmica estrutural e o acoplamento de movimento entre^{resíduos 35}. Essa análise elucidou a estabilidade, as interações intermoleculares e os movimentos coletivos dos complexos proteína-ligante. O coeficiente de correlação cruzada Cij entre os resíduos i e j foi calculado como:

Na fórmula, as letras i e j representam os átomos de Cα de dois resíduos. Quando o valor de Cij é positivo e maior que zero; os dois átomos que se movem na mesma direção são considerados em movimento correlacionado. Quando o valor de Cij é negativo e menor que zero, os dois átomos que se movem em direções opostas são considerados em movimento anticorrelacionado. Um valor Cij de zero indica que não há relação entre os movimentos dos dois átomos. Além disso, valores de Cij maiores que 0,7 foram interpretados como movimentos fortemente correlacionados (positivos) ou fortemente anticorrelacionados (negativos). Para verificar a convergência, os perfis RMSD e Rg foram examinados. Os perfis estáveis confirmaram que os últimos 100 ns eram suficientes para a análise DCCM. Esses padrões de movimento revelaram como a ligação de ligantes modula a comunicação intramolecular e os rearranjos de domínios. Para garantir estabilidade dinâmica e convergência, apenas os últimos 100 ns de trajetórias equilibradas foram analisados, e mapas de correlação foram visualizados para destacar regiões com interação dinâmica significativa.

Para explicar melhor a energia de interação entre proteínas e ligantes, um script de cálculo de energia livre de ligação foi usado para calcular a energia de ligação de todos os complexos proteína-ligante em equilíbrio. Na aplicação do método de cálculo de energia livre de ligação³⁶, a energia total de ligação foi decomposta em quatro partes independentes: interação eletrostática, interação de van der Waals, solvatação polar e interação de solvatação não polar. O termo de solvatação não polar geralmente é chamado de SASA.

Conclusão do endpoint procedural para seleção de alvos e caminhos
Ao final do fluxo de trabalho, os alvos e caminhos validados finais foram selecionados com base nos seguintes critérios: alvos centrais com os 10 primeiros valores de grau na rede PPI, e constituintes ativos chave com os 10 primeiros valores de grau na rede H-C-T. Para as vias KEGG, após excluir aquelas relacionadas ao metabolismo humano e doenças, as 20 vias principais foram classificadas e selecionadas com base no número de alvos enriquecidos. Os resultados da simulação de MD foram usados para confirmar a ligação estável entre os constituintes superiores e os alvos centrais. Essas etapas definiam coletivamente a saída final do protocolo.

Resultados

Triagem de constituintes ativos e potenciais alvos do QUF3
Usando OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18 como critérios de triagem, após pesquisar no banco de dados TCMSP, o QUF3 identificou 126 componentes químicos. Entre eles, Paeoniae Radix Alba (Baishao) continha 13 constituintes ativos, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) continha 2, Cuscutae Semen (Tusizi) continha 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) continha 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) continha 2, Radix Salviae (Danshen) continha 65, Cornus Officinal...

Discussão

Há evidências crescentes de que o endométrio de pacientes com SOP apresenta função comprometida, o que pode correlacionar-se com taxas mais altas de falha implantal e desfechos adversos na^gravidez. As diferenças endometriais em mulheres com SOP são caracterizadas principalmente pela diminuição da expressão de pinópodes, sistemas de canais nucleolares, receptores de estrogênio e receptores de progesterona durante a janela de implantação (WOI)⁴¹

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Versão 2.3)	Lab of Systems Pharmacology	https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43	Banco de dados para triagem de componentes ativos
Swiss Target Prediction online database (versão 2019)	Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swisstargetprediction.ch/	Banco de dados de previsão de alvos online
Banco de dados PubChem	National Library of Medicine, NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Banco de dados químico para recuperação de SMILES/SDF de compostos
Banco de dados UniProt	NIH	https://www.uniprot.org/uniprotkb	Banco de dados de proteínas para IDs UniProt e nomes de genes
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)	Johns Hopkins University	https://www.omim.org/	Banco de dados de alvos de doenças
DrugBank	University of Alberta	https://www.drugbank.ca/	Banco de dados de alvos de doenças
Therapeutic Target Database (TTD)	Zhejiang University	https://ttd.idrblab.cn/	Banco de dados de alvos de doenças
GeneCards (Versão 5.26)	Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences	https://www.genecards.org/	Banco de dados de alvos de doenças (pontuação de relevância >5)
Plataforma de visualização Venny (Versão 2.1.0)	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/	Ferramenta de diagrama de Venn online para visualização de interseção de alvos
Cytoscape (Versão 3.10.3)	National Resource for Network Biology, NHGRI	https://cytoscape.org/	Software de análise e visualização de rede para H-C-T, PPI e redes de vias
Banco de dados STRING (Versão 12.0)	STRING Consortium	https://string-db.org/	Banco de dados de interação proteína-proteína para construção de redes PPI
Banco de dados DAVID (Versão v2025-2)	U.S. Department of Health & Human Services, NIH	https://davidbioinformatics.nih.gov/	Banco de dados de análise de enriquecimento gênico para GO e KEGG
AutoDockTools (Versão 1.5.7)	The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/	Software de docking molecular para pré-processamento e cálculo
Software PyMOL (Versão 3.0.3)	Schrödinger	https://pymol.org/	Software de visualização molecular para visualização de docking
Protein Data Bank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Banco de dados de estruturas de proteínas para download de arquivos PDB de alvos
GROMACS (Versão 2023.2)	GROMACS development team	https://www.gromacs.org/	Software de simulação de dinâmica molecular
VMD (Versão 1.9.3)	University of Illinois	https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/	Software de visualização molecular e análise de trajetória
gmx_MMPBSA	Open-source (GitHub)	https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA	Ferramenta de cálculo de energia livre de ligação a partir de trajetórias MD
Science Data Bank	Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center	https://www.scidb.cn/	Repositório de dados científicos para disponibilidade e depósito de dados