Ensaio de Unidade Formadora de Colônias Adaptado para Medula Óssea Derivada de Pacientes e Células Mononucleares do Sangue Periférico

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento para induzir a diferenciação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas derivadas da medula óssea do paciente e de células mononucleares do sangue periférico. O ensaio utiliza um meio de cultura semisólido que apoia o compromisso de linhagem eritróide e mieloide e incorpora métricas padronizadas para classificação de colônias reprodutíveis para caracterização pré-clínica de medicamentos.

Resumo

O ensaio da unidade formadora de colônias (UFC) é uma técnica fundamental para o estudo de doenças hematológicas, incluindo síndromes mielodisplásicas (MDS) e leucemia mieloide aguda (LMA). Este ensaio utiliza meios semisólidos suplementados com combinações definidas de citocinas para apoiar o crescimento tridimensional e a diferenciação específica de linhagem das células progenitoras eritroides e mieloides. No entanto, amostras de sangue periférico e medula óssea derivadas do paciente apresentam desafios técnicos devido à redução da viabilidade, aumento da sensibilidade ao manuseio e variabilidade no crescimento das colônias. Além disso, as diretrizes existentes para identificar e contar colônias mostram variabilidade substancial na definição do tamanho das colônias e tipos de linhagem, limitando a reprodutibilidade entre estudos. O protocolo descrito aqui é otimizado para o crescimento e diferenciação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas isoladas de amostras de pacientes com MDS e LMA. O protocolo enfatiza o manuseio suave das células, processamento estéril de amostras de pacientes, condições otimizadas de cultura e durações de crescimento adaptadas a células derivadas do paciente. Esse protocolo fornece uma estrutura prática para ensaios de CFU utilizando amostras derivadas do paciente e estabelece uma métrica padrão para contagem e análise consistente de colônias em pesquisas de malignidades hematológicas.

Introdução

A hematopoiese é um processo rigidamente regulado no qual células-tronco hematopoiéticas (HSCs) que residem em nichos da medula óssea dão origem a todas as linhagens celulares maduras do sangue. Por meio de uma série hierárquica de eventos de diferenciação, os HSCs geram progenitores multipotentes que se comprometem progressivamente com linhagens eritroides, mieloides e linfoides antes de passarem pela maturação terminal em células sanguíneas funcionais circulantes. Esse processo é governado por sinalização coordenada dentro do microambiente da medula óssea e por mecanismos intrínsecos de transcrição e epigenética. Perturbações nessas vias regulatórias, especialmente pelo acúmulo de mutações genéticas ou somáticas em HSCs, podem prejudicar a diferenciação normal e levar à expansão clonal de progenitores anormais. Tais alterações podem, em última instância, resultar em distúrbios hematológicos caracterizados por hematopoiese e citopenias ineficazes, incluindo síndromes mielodisplásicas (MDS) e leucemia mieloide aguda (^LMA)1,2,3,4,5.

O ensaio da unidade formadora de colônias (UFC) é uma técnica in vitro bem estabelecida para avaliar o potencial de diferenciação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs). Originalmente desenvolvido como um ensaio de curto prazo para medir a capacidade proliferativa e de diferenciação dos progenitores hematopoiéticos ^6,7,8, o ensaio CFU tornou-se desde então uma ferramenta amplamente utilizada tanto na hematologia clínica quanto^{experimental 9}. Em ambientes pré-clínicos laboratoriais, o ensaio é frequentemente utilizado para avaliar o impacto de perturbações genéticas ou terapêuticas candidatas na diferenciação hematopoética. No contexto da pesquisa em MDS e LMA, os ensaios CFU fornecem uma leitura funcional para entender como alterações moleculares e genéticas influenciam a capacidade de diferenciação da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas derivadas do paciente.

O ensaio de CFU envolve o cultivo de HSPCs em um meio semisólido à base de metilcelulose, complementado com fatores de crescimento definidos que suportam a expansão e diferenciação específicas da linhagem. Nessas condições, células progenitoras proliferam e dão origem a colônias discretas, que podem ser classificadas morfologicamente de acordo com a identidade da linhagem. Um meio semisólido à base de metilcelulose, comercialmente disponível, otimizado para diferenciação eritróide e mieloide, é utilizado neste protocolo. O meio contém uma combinação de citocinas, incluindo interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), fator de células-tronco (SCF), eritropoietina (EPO), fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) e fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). Juntos, esses fatores apoiam o crescimento de progenitores eritróides, como os progenitores unitários-eritróides formadores de colônias (CFU-E) e os eritróides unitários formadores de estouros (BFU-E), progenitores granulocitos-macrófagos mieloides (CFU-GM) e progenitores multipotentes como granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos progenitores (CFU-GEMM^)10,11.

Apesar de sua ampla utilidade, o meio semisólido mencionado acima é limitado em sua capacidade de diferenciação, pois não suporta adequadamente a diferenciação de megacariócitos e plaquetas. Para essas aplicações, formulações mais especializadas contendo fatores de crescimento plaquetário são mais apropriadas; No entanto, eles estão fora do escopo do protocolo descrito. No geral, por meio da seleção cuidadosa da formulação do meio combinada com avaliação morfológica e análises a jusante como citometria de fluxo, os pesquisadores podem avaliar efetivamente a sensibilidade dos medicamentos por meio da análise do compromisso de linhagem e do potencial^{de diferenciação 12}.

Neste estudo, o ensaio CFU é utilizado para investigar o potencial terapêutico das terapias combinadas para o tratamento da MDS de alto risco recaída/refratária. A pirimetamina é um antifolato clinicamente aprovado usado para tratar toxoplasmose e malária parasitária, e recentemente foi estudada como agente anticâncer 13,14,15. Estudos recentes demonstraram que o tratamento com pirimetamina pode agir por meio da inibição de vias chave que regulam a síntese de novo de^{pirimidina 16}. Neste protocolo, ensaios CFU são utilizados para investigar a eficácia clínica da pirimetamina como terapia de agente único e como terapia combinada com Venetoclax, que é uma terapia de linha de frente atual para o tratamento de MDS e^{LMA 17,18}.

Apesar de sua utilidade ampla, o ensaio CFU apresenta várias limitações técnicas. A identificação e classificação das colônias dependem fortemente de critérios morfológicos, que podem introduzir variabilidade entre observadores e entre centros^{de pesquisa} 6,19,20,21. Além disso, amostras derivadas de pacientes de indivíduos com MDS ou LMA frequentemente apresentam viabilidade celular reduzida, aumento da fragilidade e heterogeneidade, o que pode complicar a formação de colônias e as análises^{posteriores 9}. A preparação das colônias para caracterização adicional, incluindo citometria de fluxo, pode, portanto, exigir manuseio cuidadoso para preservar a integridade celular. A ausência de procedimentos padronizados para identificação de colônias, contagem e análise a jusante contribui ainda mais para a variabilidade entre os estudos. Essas considerações técnicas destacam a necessidade de procedimentos padronizados otimizados especificamente para amostras hematopoiéticas derivadas do paciente.

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho otimizado para realizar ensaios de UFC utilizando células mononucleares derivadas de amostras primárias de medula óssea ou amostras de sangue periférico de pacientes com malignidades hematológicas. A abordagem foca em estratégias práticas para manusear células sensíveis derivadas de pacientes, estabelecer condições de cultivo confiáveis e implementar critérios consistentes para identificação e quantificação de colônias. Ao fornecer orientações metodológicas detalhadas e enfatizar práticas de análise reprodutível, esse protocolo visa facilitar uma avaliação mais confiável da diferenciação hematopoiética e da resposta terapêutica em estudos pré-clínicos de MDS e LMA.

Protocolo

Este estudo utiliza bioamostras humanas desidentificadas obtidas de um biobanco sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional, "Biologia Molecular de Distúrbios Hematológicos Benignos e Malignos" (Protocolo IRB #200536), no Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes de ética institucional. Todos os reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de células mononucleares de medula óssea ou sangue periférico derivadas do paciente

NOTA: De acordo com as diretrizes comuns de manuseio de amostras de pacientes, recomenda-se usar jaleco longo e luvas descartáveis resistentes a rasgos, além de trabalhar sob um capuz de cultivo celular de laboratório para proteção pessoal contra a exposição a patógenos transmitidos pelo sangue. Todas as pontas de pipeta e pipetas sorológicas que entram em contato com células do paciente devem ser deixadas de molho em uma solução de alvejante a 10% por pelo menos 30 minutos antes do descarte em resíduos de risco biológico.

1. Preparação experimental
   1. Meios IMDM quentes, soro bovino fetal (FBS) e antibióticos penicilina-estreptocomina (Pen-streptococ) a 37 °C por pelo menos 30 minutos.
   2. Descongelar o meio semisólido a 4 °C durante a noite. No dia do emprato, aqueça a garrafa até a temperatura ambiente (RT) por pelo menos 30 minutos.
   3. Esterilize o exaustor de cultura celular com esterilização UV por 15 minutos, depois borrife as superfícies do capuz, pipetas e prateleiras de tubos com etanol a 70% (EtOH).
   4. Prepare um béquer de resíduos contendo solução de água sanitária a 10%, grande o suficiente para coletar pontas de pipetas e pipetas sorológicas contaminadas.
   5. Obtenha células mononucleares de medula óssea ou sangue periférico isoladas por métodos de centrifugação com gradiente de densidade. As células podem ser usadas no mesmo dia da coleta ou a partir de amostras congeladas em biobancos.
2. Se as amostras forem congeladas, descongele-as rapidamente em um banho-maria a 37 °C até que a maior parte do gelo derreta e reste apenas um pequeno cristal de gelo. Coloque as amostras imediatamente no gelo após o descongelamento.
   NOTA: As amostras dos pacientes são muito sensíveis ao descongelamento. É importante descongelar as amostras o mais rápido possível e em lotes para minimizar a morte celular.
3. Suspenda células em meio de crescimento completo aquecido de 5 mL (meio IMDM suplementado com 4% FBS e 1% Pen-Streptocócico).
4. Determine a concentração e viabilidade celular usando corante AO/PI e um contador automático de células.
5. Centrifuge as células a 350 x g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar as células. Descarte o supernadante.
6. Ressuspender células em soro salino fosfatado de fosfato (DPBS) estéril de 5 mL. Repita a centrifugação para células de pellet e descarte o sobrenadante.
7. Suspenda as células em meio de crescimento completo até uma concentração de 2 milhões de células vivas/mL. Prepare células suficientes para 100K células/poço de uma placa de 6 poços.

2. Preparação e administração de tratamentos de medicamentos.

NOTA: A pirimetamina é obtida como pó liofilizado e é reconstituída internamente em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração de 100 mM; as alíquotas são armazenadas em −80 °C. Venetoclax é comprado pré-dissolvido em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenado em -20 °C. Para este experimento, venetoclax e pirimetamina são administrados em dose única via absorção livre em paralelo com uma condição de tratamento DMSO com controle veicular.
ATENÇÃO: Pirimetamina, venetoclax e DMSO são agentes bioperigosos. Manuse-se apenas por baixo do capuz, use EPI e use com cuidado extra.

1. No dia do placar, descongele a aliquota do medicamento no gelo, vórtice e desça na velocidade máxima em uma mini centrífuga de mesa por 30 segundos.
2. Vortex e misture vigorosamente um frasco de meio semisólido até que todos os componentes estejam homogeneizados. Deixe intocado no exaustor em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir que as bolhas subam à superfície.
3. Prepare 3 mL de alíquotas de meio semisólido em tubos cônicos estéreis de 15 mL. Deixe os tubos permanecerem intocados por 30 minutos para permitir que as bolhas subam à superfície. Aliquotas de mídia semi-sólida extra podem ser recongeladas e armazenadas a -20 °C para uso posterior.
4. Não adicione mais que 10 μL de volume de medicamento ao meio semisólido. Para este experimento, as concentrações de venetoclax e pirimetamina são ajustadas de acordo com condições sinérgicas empiricamente determinadas. A um grupo de controle de veículo, adicione volumes equivalentes de DMSO. Prepare aliquotas duplicadas de 3 mL para cada condição.
   NOTA: É importante manter o volume de medicamento adicionado desprezível para que não afete a concentração final do medicamento no meio semisólido.
5. Mídia de vórtice em rajadas curtas de 4 a 5 para incorporar totalmente a droga ao meio.
   NOTA: Não mantenha a mistura celular no vórtix por longos períodos, pois isso pode causar morte celular.
6. Adicione 100 μL de células ou um volume equivalente de 200.000 células aos 3 mL alíquotas de mídia semisólida. Mistura de vórtice em rajadas curtas até estar totalmente incorporada/homogeneizada.
7. Prenda uma agulha de 16 G com ponta romba em uma seringa de 3 mL e coloque a agulha e a seringa na mistura celular. Deixe intocado por 30 minutos para permitir que as bolhas subam à superfície.

3. Revestimento da suspensão celular tratada com medicamentos.

1. Usando uma agulha submersa e uma seringa, absorva a mistura de células e medicamentos, tomando cuidado para não aspirar bolhas de ar. Espere de 3 a 5 minutos, depois retire a mistura restante que se acumulou nas laterais do tubo cônico de 15 mL.
2. Em uma placa estéril de 6 poços, adicione a mistura da célula gota, alternando grandes gotas entre 2 poços de uma coluna externa da placa. Espalhe a mistura inclinando suavemente a placa em movimentos circulares para cobrir uniformemente todo o fundo dos poços. Esses dois poços constituem réplicas técnicas.
   NOTA: Se bolhas se formarem ou forem acidentalmente adicionadas aos poços, use uma ponta de filtro de pipeta para estourar ou mover suavemente as bolhas até a borda da placa. Quaisquer bolhas grandes deixadas na placa podem afetar o crescimento das colônias.
3. Adicione a mistura de ensaio de colônia apenas às colunas externas da placa de 6 poços. Na coluna central, adicione 5 mL de água estéril a cada poço. Adicionar água aos poços garantirá que haja umidade suficiente para evitar que o meio semisólido seque.
4. Incube a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de_CO2. Monitore o crescimento celular e os níveis de água 2 vezes por semana. As células devem formar colônias visíveis a olho nulo por volta de 7 dias após o banhamento, e as placas devem atingir 75%–80% de confluência entre 14 e 21 dias após o banhamento.

4. Imagem e contagem de colônias

NOTA: Este protocolo descreve parâmetros validados para uso no sistema de imagem EVOS M7000. Essas configurações podem precisar ser otimizadas ou adaptadas para compatibilidade com outros sistemas de imagem de placas.

1. Remova a tampa do filtro de luz protetor da plataforma do microscópio. Ligue o microscópio e abra o programa de software associado.
2. Insira um difusor de luz na lente superior do aparelho do microscópio.
3. Insira a posição da placa na plataforma de modo que o poço A1 fique no canto superior esquerdo.
4. No software de imagem, insira as seguintes configurações de foco:
   1. Selecione o recipiente a ser fotografado. Neste protocolo, é usada uma placa de 6 poços.
   2. Defina o objetivo para 4X.
   3. Selecione a fonte de luz como Trans ou mude o microscópio para o modo campo claro.
   4. Ligue a luz do microscópio e ajuste manualmente a intensidade da luz usando o controle deslizante grosseiro. Para o instrumento usado neste protocolo, a faixa ótima para colônias de imagem é cerca de 0,03.
   5. Se houver um recurso de autofoco no instrumento, use-o para ajustar o foco. Se necessário, ajuste ainda mais o foco usando as configurações manuais de foco fino.
5. Insira as seguintes configurações automatizadas de captura de imagem:
   1. Selecione toda a área do poço a ser fotografada em cada poço.
   2. Selecione a captura automática de imagem para começar pelo centro do poço e espiralar para fora em direção às bordas do poço.
   3. Selecione as configurações de autofoco para que o instrumento volte a focar em cada poço.
   4. Selecione para que as imagens raw de cada poço sejam tiladas/mescladas.
   5. Selecione para que as imagens sejam invertidas horizontal e verticalmente.
   6. Selecione as configurações de salvamento de dados para coletar "imagem em mosaico" e "imagem mesclada"
   7. Faça a varredura automática da placa. O instrumento usado neste protocolo funcionará a uma velocidade de 1,5 min/poço.
   8. Remova a placa, coloque a tampa protetora do filtro sobre a plataforma do microscópio, desligue o microscópio e feche o software.
   9. Após a imagem, conte manualmente o total de colônias individuais, bem como os subtipos mieloides e eritróides em cada poço, usando as imagens de poços mesclados em mosaico.
6. Defina colônias de acordo com a seguinte caracterização morfologica:
   1. Considere uma colônia individual ou um agrupamento de colônias distinto quando está suficientemente distante de outra população celular, uma distância igual ao seu próprio comprimento. Populações dentro desse limite de distância são agrupadas em uma contagem de colônias.
   2. Certifique-se de que as colônias eritróides sejam profundamente pigmentadas e com aparência de cor avermelhada escura. Essas colônias aparecem como populações ou agrupamentos únicos densamente crescentes com bordas claramente definidas. Colônias eritróides menores compostas por populações celulares imaturas de crescimento lento são classificadas como CFU-E. Colônias maiores com populações mais maduras são classificadas como BFU-E.
   3. Verifique se as colônias mieloides contêm células que parecem mais translúcidas e são de cor mais clara. Colônias mieloides são mais dispersas e não possuem bordas claramente definidas. Colônias mieloides tendem a crescer com mais frequência como populações individuais do que como aglomerados, embora ocasionalmente possam ser vistos aglomerados. Em ambos os casos, as colônias mieloides são classificadas como CFU-GM.
   4. Classifique as colônias mistas que contêm subtipos eritróides e mieloides como CFU-GEMM.

5. Colheita e congelamento celular para análise a jusante via citometria de fluxo

1. Execute os passos abaixo antes de começar:
   1. a. Prepare e aqueça o tampão de separação de células ativado por fluorescência (tampão FACS, composto por DPBS/4% FBS) e o meio congelante (FBS/10% DMSO) em um banho-maria a 37 °C por pelo menos 30 minutos.
2. Adicione 5 mL de buffer FACS aquecido à superfície de cada poço. Incube as placas por pelo menos 30 minutos em uma incubadora a 37 °C para dissolver o meio semisólido.
3. Resuspenda completamente as células usando uma pipeta de 5 mL e transfira para um tubo cônico estéril de 50 mL.
4. Usando 5 mL de tampão FACS aquecido, lave cada poço 3 vezes e transfira todo o volume para o tubo cônico de 50 mL.
5. Resuspenda bem as células por meio de vórtice em 4–5 rajadas curtas, depois centrifuge a 400 x g por 10 minutos em RT para as células de pellet. Se o pellet não for visível após a centrifugação, as células permanecem suspensas em meio semisólido. Sem aspirar, adicione 10–15 mL DPBS extra ao tubo para diluir ainda mais o meio semisólido e resuspender bem. Se necessário, incube a 37 °C por 10–15 minutos para dissolver completamente o meio, depois faça novamente as células em pellet.
6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em um buffer FACS de 10 mL. Centrifuge a 400 x g por 10 minutos em RT para as células de pellet.
7. Resuspenda células em meio congelante e aliquota 3 milhões de células/criovial. Congele frascos em um recipiente de congelamento de taxa controlada a -80 °C por 24 horas para alcançar uma taxa de resfriamento de 1 °C / min.
8. Transfira os crioviais para o armazenamento de nitrogênio líquido o mais rápido possível.
   NOTA: Amostras mantidas a -20 °C por longos períodos terão viabilidade reduzida. É importante transferir as células para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

Resultados

A Figura 1 ilustra o pipeline de ensaio de colônia desde o isolamento da amostra do paciente até a análise da contagem e morfologia das colônias. A Figura 2 mostra configurações principais para imagens de colônias em um microscópio de campo claro. As Figuras 3 e 4 mostram imagens representativas da formação da colônia a partir de uma única amost...

Discussão

O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho otimizado para realizar ensaios de CFU utilizando amostras primárias de medula óssea e sangue periférico dos pacientes, com atenção especial à manutenção da viabilidade celular e à garantia do crescimento reprodutível das colônias. Várias etapas do protocolo são críticas para alcançar a formação confiável de colônias ao trabalhar com amostras derivadas do paciente. O descongelamento rápido das células mononucleares criopreservadas, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	para distribuição e colocação em placas de MethoCult media
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	contador de células
CHT4 Counting Chambers (slides para contador de células)	Revvity	CHT4-SD100-002	slides para contador de células
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	usado para reconstituição de medicamentos e meios de congelamento de células
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	para cultura de células
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	para esterilização de superfícies de cultura celular
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	para imagem de colônias e placas
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	suplemento de meio para cultura celular e congelamento
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	meio de cultura enriquecido adequado para manipulação de amostras de pacientes
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	para distribuição e colocação em placas de MethoCult media
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	meio semissólido à base de metilcelulose para ensaio de colônia
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	para colocação em placas de ensaio de colônia
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	Para imagem e caracterização da morfologia da colônia
Pen Strep	Gibco	15140-122	suplemento antibiótico para cultura celular
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	antifolato aprovado pela FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	para colocação em placas de ensaio de colônia
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	quimioterapia aprovada pela FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	corante de viabilidade para contagem de células vivas