Análise de Bioinformática Pan-Câncer Combinada com Validação Experimental do Câncer de Cólon: Um Estudo sobre o TMED3 como Biomarcador Diagnóstico e Prognóstico

Resumo

Este protocolo combina análise bioinformática pan-cancerígena com validação imunohistoquímica em câncer de cólon para avaliar a expressão do Domínio 3 do Transporte de Proteínas Transmembranar Emp24, significância prognóstica, associações imunes e vias biológicas relacionadas usando bancos de dados públicos de multiômica e amostras clínicas de tecido.

Resumo

O Domínio de Transporte de Proteínas Transmembrana Emp24 3 (TMED3), membro da família das proteínas p24, tem sido implicado na proliferação, invasão e migração tumoral. Este estudo teve como objetivo avaliar os padrões de expressão, a importância prognóstica, as associações imunes e as potenciais funções biológicas do TMED3 em múltiplos tipos de câncer, utilizando análise bioinformática pan-cancerígena combinada com validação imuno-histoquímica (IHC) no câncer de cólon. Conjuntos de dados multiômicos do Atlas do Genoma do Câncer, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas e cBioPortal foram analisados para investigar a expressão do TMED3 e alterações genéticas em pancâncer. A imunohistoquímica foi realizada para avaliar a expressão da proteína TMED3 em tecidos de câncer de cólon. A análise de sobrevivência de Kaplan–Meier e a análise de regressão de Cox foram usadas para avaliar o valor prognóstico do TMED3. A análise de correlação de Spearman foi conduzida para avaliar as associações do TMED3 com a carga mutacional tumoral, instabilidade de microssatélites (MSI), infiltração de células imunes e pontos de controle imunológico. A Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos foi realizada para investigar possíveis vias biológicas associadas ao TMED3 no câncer de cólon. A expressão de TMED3 foi elevada na maioria dos tipos de tumor e esteve associada à sobrevida geral desfavorável e à sobrevivência específica da doença em carcinoma adrenocortical, adenocarcinoma do cólon e melanoma uveal. A maior frequência de alterações genéticas do TMED3 foi identificada no mesotelioma, com amplificação representando o tipo predominante de alteração. Além disso, a expressão do TMED3 mostrou correlações significativas com a carga mutacional tumoral e a instabilidade dos microssatélites no carcinoma de células claras renais do rin, adenocarcinoma estomacal e carcinoma endometrial do corpo uterino. A expressão de TMED3 também esteve associada à infiltração imune e à expressão em pontos de controle imunes em vários tumores. A análise do IHC demonstrou aumento da expressão de TMED3 em tecidos de câncer de cólon em comparação com tecidos normais do cólon e mostrou associação com o estágio T. A análise de enriquecimento funcional identificou vias relacionadas ao ribossomo, processamento e apresentação de antígenos, fosforilação oxidativa e fosfato de pentose. Esses achados indicam que o TMED3 pode representar um biomarcador promissor para o diagnóstico e avaliação prognóstica do câncer de cólon, bem como de outros tipos tumorais.

Introdução

A família de proteínas Transmembrane Emp24 Domain (TMED) é composta por quatro subfamílias (α, β, γ e δ) que comumente existem como monômeros, dímeros ou complexos oligoméricos em células eucarióticas. Membros da família TMED estão envolvidos no tráfico intracelular de vesículas e têm sido implicados em diversas doenças humanas, incluindo câncer, distúrbios imunológicos, diabetes, doenças neurodegenerativas, doença hepática gordurosa não alcoólica, cardiomiopatia dilatada, doença renal da mucina 1 (MKD) e síndrome de Sjögren (SS⁾¹. A proteína transmembrana contendo domínio EMP24 3 (TMED3), membro da família das proteínas p24, é uma proteína transmembranar de passagem única altamente conservada, codificada no cromossomo 15q25.1 em humanos ^2,3. Evidências acumuladas demonstraram que o TMED3 é expresso de forma aberrante em várias malignidades e está envolvido na iniciação, proliferação, invasão, metástase e progressão do tumor. A expressão elevada de TMED3 foi relatada no osteosarcoma⁴, carcinoma escamoso^{pulmonar 5}, câncer^{de mama 6}, carcinoma^{endometrial 7} e câncer^{colorretal 8}. Estudos experimentais mostraram que a supressão da expressão de TMED3 inibe a proliferação de células tumorais, a capacidade metastática e a atividade antiapoptótica, restringindo assim a progressão tumoral. No glioma, a superexpressão do TMED3 tem sido associada a um grau tumoral mais elevado e prognóstico mais baixo, e o TMED3 foi relatado como promovendo a progressão do glioblastoma por meio da regulação do ZBTB7A9. Embora investigações anteriores tenham explorado o papel biológico do TMED3 em tipos específicos de tumores, seus padrões de expressão, significado prognóstico e funções moleculares em pan-câncer ainda não foram sistematicamente caracterizados.

Avanços recentes em bancos de dados multiômicos e análise bioinformática permitiram a avaliação sistemática da expressão gênica, prognóstico, características imunes e alterações moleculares entre diferentes tipos de tumores. Comparado a estudos de coorte única, a análise integrada pan-câncer usando bancos de dados públicos oferece uma abordagem mais ampla para identificar potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos entre os cânceres. No presente estudo, análises abrangentes de bioinformática foram conduzidas para explorar o papel do TMED3 em múltiplos tipos de câncer, utilizando bancos de dados multiômicos públicos disponíveis, incluindo The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas e cBioPortal. O estudo avaliou sistematicamente os padrões de expressão do TMED3, características clinicopatológicas, significância prognóstica, associações relacionadas ao sistema imunológico e possíveis funções biológicas no câncer pan-câncer. Além disso, uma análise imuno-histoquímica (IHC) foi realizada em tecidos de câncer de cólon para validar a expressão da proteína TMED3 e sua associação com características clinicopatológicas. Nossa análise pan-câncer serve como uma estratégia de triagem para identificar biomarcadores candidatos. Em seguida, realizamos validação experimental especificamente no câncer colorretal (CCR). Os resultados demonstram que o TMED3 é um biomarcador prognóstico promissor na CRC, embora sua relevância para outros tipos de câncer exija investigação adicional.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo tecidos humanos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e éticas e dentro de um gabinete certificado de segurança biológica. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Central de Tangshan (Nº TZYL/K/2023-16), e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra.

Coleta de dados
Dados do perfil de expressão do TMED3 de diferentes tecidos tumorais e normais não pareados foram obtidos dos bancos de dados TCGA e^{GTEx 10,11} (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; acessado em 1º de julho de 2025). Testes de soma de ranks de Wilcoxon foram realizados para analisar a expressão diferencial de TMED3 entre o tumor e tecidos normais não pareados. Matrizes de expressão de sequenciamento de RNA normalizadas por transcrito por milhão (TPM) baixadas do UCSC Xena foram usadas para análises posteriores. Os valores de expressão foram harmonizados usando a transformação log₂(TPM + 1) antes da análise estatística. Os dados de expressão do TMED3 para 33 tipos de tumores e tecidos normais correspondentes foram posteriormente baixados do banco de dados TCGA. Testes de Wilcoxon com ordem gestual foram empregados para avaliar a expressão diferencial de TMED3 entre tumores e tecidos normais correspondentes. A expressão diferencial da proteína TMED3 entre os tecidos tumorais e normais foi obtida no banco de dados^{UALCAN 12} (http://ualcan.path.uab.edu; acessado em 1º de julho de 2025). O módulo de análise proteômica foi acessado, e a opção "Pan-Cancer View" foi selecionada para análise. As análises de expressão proteica foram realizadas usando os conjuntos de dados CPTAC disponíveis no módulo "Pan-cancer View" do UALCAN com configurações padrão da plataforma e sem filtragem adicional de amostras.

Análise das características clinicopatológicas
Informações clinicopatológicas de 33 tipos de tumores no banco de dados da TCGA foram coletadas para investigar a relação entre a expressão do TMED3 e o estágio patológico. Os estágios tumorais foram categorizados em grupos de estágio inicial (estágio I a II) e estágio avançado (estágio III–IV). As diferenças na expressão de TMED3 entre os grupos em estágio foram avaliadas usando testes de soma de ranks de Wilcoxon em múltiplos tipos de câncer.

Análise prognóstica
Foram obtidos dados de tempo de sobrevivência e status de sobrevivência de 33 tipos de tumores para análise prognóstica. Casos normais e casos sem informação clínica foram excluídos. Os valores ausentes eram tratados de acordo com a ausência de cada variável. A expressão do TMED3 foi dividida em grupos de alta e baixa expressão de acordo com o valor mediano da expressão. O pacote de sobrevivência (Versão 3.2-7) no software de análise estatística R (versão 4.2.1) foi usado para realizar a análise de regressão de riscos proporcionais de Cox. Os resultados foram visualizados usando os pacotes survminer e ggplot2. A sobrevivência geral (SO) foi definida como o intervalo entre o diagnóstico e a morte por qualquer causa, enquanto a sobrevivência específica da doença (DSS) foi definida como o intervalo entre o diagnóstico e a morte atribuível ao câncer específico, com mortes não relacionadas à malignidade tratadas como eventos censurados. Análises de sobrevivência de Kaplan–Meier foram posteriormente realizadas para avaliar as relações entre a expressão do TMED3 e tanto OS quanto DSS no adenocarcinoma do cólon (COAD).

Análise de mutações
O banco de dados cBioPortal (www.cbioportal.org; acessado em 5 de julho de 2025) foi usado para analisar a frequência das alterações genéticas do TMED3 em 33 tipos de câncer¹³. O site do cBioPortal foi acessado, e "TMED3" foi inserido na barra de busca rápida para analisar o perfil de mutação do TMED3 em vários tipos de câncer. As alterações genéticas do TMED3 incluíram principalmente mutação, amplificação, deleção profunda e múltiplas alterações. Estudos pan-câncer padrão e configurações de consulta disponíveis no cBioPortal foram usados para análise de mutações sem filtragem adicional.

Análise de correlação da metilação do DNA
A análise de metilação do DNA foi realizada para avaliar o status de metilação do promotor TMED3 em tecidos tumorais e normais usando o banco de dados UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/; acessado em 5 de julho de 2025). O status de metilação do DNA da região promotora TMED3 foi analisado usando dados de metilação de Nível 3 gerados pela plataforma Illumina Infinium HumanMethylation450K na TCGA. Os níveis de metilação foram expressos como β valores, calculados como β = intensidade da sonda metilada / (intensidade da sonda metilada + intensidade da sonda não metilada), com valores variando de 0 (não metilado) a 1 (totalmente metilado). Sondas CpG localizadas a menos de 1500 pb a montante do local de início da transcrição (TSS), incluindo as regiões TSS200 e TSS1500 definidas pelo UALCAN, foram analisadas para avaliar o status de metilação do promotor. A UALCAN extraía automaticamente todas as sondas CpG disponíveis dentro da região promotora do gene alvo sem filtragem adicional. Foram obtidos valores de β de metilação em tecidos pan-cancerosos e normais, e foram realizados testes de T com duas amostras não pareadas para comparar as diferenças entre os grupos. Foi usado um limiar de significância de α = 0,05, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Análise da inter-relação entre TMED3, carga mutacional tumoral e instabilidade de microssatélites
A carga mutacional tumoral (TMB) e a instabilidade de microssatélites (MSI) foram analisadas para investigar suas associações com a expressão de TMED3 em múltiplos tipos de câncer. Conjuntos de dados pan-câncer processados uniformemente foram baixados do banco de dados Xena da UCSC (https://xenabrowser.net/; acessado em 5 de julho de 2025), e perfis de expressão TMED3 foram extraídos para análises subsequentes. Os dados de Variação Simples de Nucleotídeos de Nível 4 para amostras TCGA geradas usando MuTect2 foram obtidos do banco de dados Genomic Data Commons (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴. Os dados de expressão do TMED3 foram integrados aos conjuntos de dados do TMB, e os valores de expressão foram normalizados usando transformação log₂(x + 1) antes da análise estatística. Os escores MSI para tipos individuais de tumores foram coletados em estudos^{previamente publicados 15} e posteriormente fundidos com dados de expressão de TMED3 seguindo o mesmo procedimento de normalização. As associações entre expressão de TMED3 e TMB/MSI foram avaliadas usando análise de correlação de Spearman nos conjuntos de dados pan-câncer^16,17.

Análise das características imunes do TMED3
O algoritmo ESTIMATE foi aplicado para calcular escores estromais, escores imunes e escores ESTIMATE para múltiplos tipos de tumor. As pontuações de infiltração estromala e imune em conjuntos de dados pan-câncer foram geradas usando o pacote de estimativas (Versão 1.0.13) no software de análise estatística. As diferenças na pontuação estromal, no escore imune e na pontuação ESTIMATE entre grupos de alta e baixa expressão TMED3 foram avaliadas usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. Além disso, foram realizadas análises relacionadas a checkpoints imunológicos para investigar as relações entre a expressão do TMED3 e as moléculas de checkpoint imunológico, incluindo a proteína de morte celular programada 1 (PD-1), o ligando de morte programado 1 (PD-L1) e a proteína citotóxica associada a linfócitos T (CTLA4), entre diferentes tipos de câncer. Os dados de expressão da contagem de STARS e as informações clínicas correspondentes para COAD foram baixados do banco de dados TCGA. Matrizes de expressão formatadas em TPM foram extraídas e normalizadas usando a transformação log₂(TPM + 1). Perfis de expressão de oito genes relacionados a checkpoints imunes foram posteriormente obtidos a partir de amostras de COAD, e as correlações entre a expressão de TMED3 e os marcadores de checkpoint imune foram analisadas usando análise de correlação de Spearman.

Análise de sensibilidade a medicamentos
A análise de sensibilidade a medicamentos foi realizada utilizando a plataforma GSCALite para investigar a relação entre a expressão de TMED3 e a resposta a medicamentos anticâncer em vários tipos de^{câncer 18}. Os dados de sequenciamento de RNA de Nível 3 e as informações clínicas correspondentes para amostras de COAD foram obtidos a partir do conjunto de dados TCGA. As respostas previstas à quimioterapia para cada amostra foram geradas usando dados do banco de dados Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/). A previsão da resposta a medicamentos foi realizada usando o pacote pRRophetic no software de análise estatística. Os valores estimados de concentração inibitória metade máxima (IC₅₀) foram calculados usando regressão de crista com configurações padrão, incluindo correção de efeito lote através do algoritmo de combate e análises de ajuste específicas de tecido. As medições de expressão gênica replicada foram médias antes da análise posterior.

Expressão e prognóstico do TMED3 no câncer de cólon
Perfis de expressão TMED3 e dados clinicopatológicos correspondentes para adenocarcinoma de cólon foram obtidos a partir do banco de dados TCGA. A expressão diferencial de TMED3 entre tecidos de câncer de cólon e tecidos normais não pareados foi avaliada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon, enquanto associações entre expressão de TMED3 e características clinicopatológicas foram analisadas usando testes de qui-quadrado. Os pacientes foram estratificados em grupos de alta e baixa expressão de acordo com o nível mediano de expressão de TMED3. Posteriormente, a análise de sobrevivência de Kaplan–Meier foi realizada para comparar diferenças prognósticas entre os dois grupos. Análises de regressão de riscos proporcionais de Cox univariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar a significância prognóstica da expressão de TMED3 no câncer de cólon. Além disso, foi realizada uma análise da curva de características operacionais do receptor (ROC) dependente do tempo para avaliar o desempenho preditivo da expressão TMED3 para sistemas operacionais de 1, 3 e 5 anos. Análises ROC foram realizadas usando o pacote timeROC no software de análise estatística, e a visualização gráfica foi gerada usando o pacote ggplot2.

Análise imunohistoquímica
Um total de 60 amostras de tecido de câncer de cólon e 20 tecidos não cancerígenos foram selecionados aleatoriamente do Hospital Central de Tangshan. O estudo foi aprovado pelo conselho local de revisão institucional (Nº TZYL/K/2023-16), e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia. Todas as amostras de tecido foram obtidas de pacientes que passaram por resseção cirúrgica sem quimioterapia ou imunoterapia prévias. A coorte incluiu 39 pacientes do sexo masculino e 21 do sexo feminino com idades entre 20 e 87 anos. De acordo com os critérios de estadiamento de Duke, 33 pacientes foram classificados como estágio I+II e 27 pacientes como estágio III+IV. A distribuição dos estágios da coorte pode introduzir um viés de seleção potencial para estágios avançados da doença; portanto, os achados relacionados à sobrevivência devem ser interpretados com cautela.

Amostras de tecido embutidas em parafina foram seccionadas em fatias de 4 μm, seguidas por desparafinização e reidratação. A atividade endógena da peroxidase foi extinta usando 4% de_H2O2, e a ligação inespecífica foi posteriormente bloqueada com soro de cabra. As seções foram então incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo primário TMED3 em diluição de 1:100. No dia seguinte, foi aplicado polímero anti-coelho IgG para ovelhas (PV-6000) por 30 minutos em temperatura ambiente. A imunorreatividade foi visualizada usando coloração com diaminobenzidina, e as seções foram montadas com resina neutra. A coloração histológica foi examinada sob um microscópio óptico de alta ampliação. A intensidade da imunocoloração foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada) e 3 (forte), enquanto a proporção de células tumorais positivas foi classificada como 1 (1%–25%), 2 (26%–50%), 3 (51%–75%) ou 4 (76%–100%). As pontuações finais de imunohistoquímica foram calculadas multiplicando a intensidade da coloração pelo percentual de células tumorais positivas. Os níveis de expressão do TMED3 foram classificados como negativos/baixos (escore ≤ 6) ou superexpressão (score > 6)¹⁹.

Análise de enriquecimento gênico do TMED3 no câncer de cólon
A análise de enriquecimento gênico foi realizada para avaliar as funções biológicas potenciais e vias de sinalização associadas à expressão de TMED3 no câncer de cólon. Genes diferencialmente expressos entre grupos de alta e baixa expressão TMED3 foram triados usando o pacote DESeq2 no software de análise estatística. Os dados brutos de contagem obtidos do TCGA foram normalizados usando o método de normalização da razão mediana implementado no DESeq2. Genes de baixa expressão com contagens <10 em mais de 50% das amostras foram excluídos antes da análise. Genes diferencialmente expressos foram identificados usando limiares de |_{log 2} (FC)| ≥ 1 e ajustou P < 0,05 após a correção de testes múltiplos de Benjamini–Hochberg (BH). Todos os parâmetros analíticos foram fixados para garantir a reprodutibilidade da análise.

Posteriormente, a Análise de Enriquecimento de Conjuntos Genéticos (GSEA) foi realizada usando o pacote clusterProfiler em R, baseado nos conjuntos de genes da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (versão 7.5.1) obtidos do Molecular Signatures Database (MSigDB). Uma lista genética pré-classificada foi gerada de acordo com os valores de variação de dobra log2 entre grupos de alta e baixa expressão TMED3. A análise de enriquecimento foi realizada usando 1000 permutações de fenótipos, e conjuntos de genes contendo 15–500 genes foram incluídos na análise. Vias com valores absolutos de escore de enriquecimento normalizado (NES) de >1, P ajustado < 0,05 e taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,25 foram consideradas significativamente enriquecidas. O enriquecimento da via da doença de Parkinson foi mantido porque essa via está intimamente associada à disfunção mitocondrial e aos processos biológicos relacionados à fosforilação oxidativa, que também estão envolvidos na reprogramação metabólica tumoral e na progressão do câncer.

Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software de análise estatística. A expressão diferencial entre os grupos foi avaliada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon de dois lados para amostras não pareadas e testes de rank de Wilcoxon para amostras pareadas. As associações entre a expressão do TMED3 e as variáveis clinicopatológicas foram avaliadas por meio de testes de qui-quadrado. Análises de sobrevivência foram realizadas usando o pacote de sobrevivência (versão 3.3-1), e curvas de sobrevivência de Kaplan–Meier foram geradas com o pacote survminer. As diferenças nos desfechos de sobrevivência entre os grupos foram comparadas usando o teste log-rank. Modelos de regressão de riscos proporcionais de Cox foram aplicados para identificar fatores prognósticos associados ao SO. Os pacientes foram categorizados em grupos de alta e baixa expressão de acordo com o nível mediano de expressão de TMED3. Análises ROC dependentes do tempo foram realizadas usando o pacote timeROC, e as figuras foram geradas usando o pacote ggplot2. Salvo indicação em contrário, significância estatística foi definida como um valor P bilateral de < 0,05.

A análise de correlação de Spearman foi realizada para avaliar as correlações entre expressão e características imunológicas de TMED3, TMB e MSI. Dados de expressão quantitativa normalizados obtidos dos bancos de dados públicos correspondentes foram usados para todas as análises de correlação. Para os dados de sequenciamento de RNA TCGA, os valores de expressão formatados em TPM foram transformados usando normalização log₂(TPM + 1) antes da análise, quando aplicável. Amostras com dados clínicos ou moleculares ausentes foram excluídas antes da análise estatística. As análises de correlação Spearman foram conduzidas como testes não paramétricos de duas caudas. Valores brutos de P foram usados para análises envolvendo comparações limitadas, incluindo testes de Wilcoxon, análises de correlação de Spearman e análises de sobrevivência. Para análises bioinformáticas de alta escala em larga escala, incluindo análise diferencial de expressão gênica, análise de enriquecimento KEGG e GSEA, a correção por múltiplos testes foi realizada usando o método BH FDR. Valores ajustados de FDR de <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Análise de expressão de TMED3 em câncer pan-câncer
A análise dos conjuntos de dados TCGA e GTEx demonstrou que a expressão do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) TMED3 foi significativamente elevada na maioria dos tecidos tumorais em comparação com os tecidos normais correspondentes, incluindo carcinoma adrenocortical (ACC), carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma invasivo de mama (BRCA), carcinoma escamoso cervical e adenocarcinoma endocervical (CESC), colangiocarcinoma (CHOL), adenocarcinoma do cólon (COAD), linfoma difuso de grandes células B (DLBC), carcinoma esofágico (ESCA), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma de células claras renais (KIRC), carcinoma papilar renal renal (KIRP), glioma cerebral de grau inferior (LGG), carcinoma hepatocelular do fígado (LIHC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), cistadenocarcinoma seroso ovariano (OV), adenocarcinoma pancreático (PAAD), feocromocitoma e paraganglioma (PCPG), adenocarcinoma prostático (PRAD), adenocarcinoma retal (READ), melanoma cutâneo cutâneo (CMS), adenocarcinoma estomacal (STAD), tumores de células germinativas testiculares (TGCT), carcinoma da tireoide (THCA), timoma (THYM), carcinoma endometrial do corpo uterino (UCEC) e carcinossarcoma uterino (UCS), enquanto redução da expressão foi observada no carcinoma escamoso de células da cabeça e pescoço (HNSC) e na leucemia mieloide aguda (LAML) (Figura 1A). Tecidos normais adjacentes correspondentes serviram como controles para análises de expressão pareada. A análise TCGA pareada confirmou ainda um aumento significativo da expressão de TMED3 em tecidos BLCA, BRCA, CHOL, COAD, cromofóbico renal (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD e UCEC em comparação com tecidos normais pareados (Figura 1B). Além disso, a análise de expressão proteica usando o banco de dados UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) demonstrou aumento dos níveis de proteína TMED3 em tecidos tumorais BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV e UCEC, enquanto a redução da expressão proteica foi observada em PAAD em comparação com tecidos normais (Figura 1C). No entanto, a expressão da proteína TMED3 foi menor em PAAD do que nos tecidos normais. Essa discrepância entre os padrões de expressão de mRNA e proteínas pode refletir mecanismos regulatórios pós-transcricionais ou pós-traducionais. Esses achados sugerem que o TMED3 é aberrantemente aumentado em múltiplos tipos de câncer e pode estar associado a características diagnósticas e prognósticas em vários tipos de câncer.

Figura 1. Perfis de expressão TMED3 em cânceres humanos. (A) Expressão diferencial de mRNA TMED3 entre tecidos tumorais e normais em múltiplos tipos de câncer, com base nos conjuntos de dados TCGA e GTEx. Os níveis de expressão são apresentados como log₂(TPM + 1). (B) Análise pareada da expressão de mRNA do TMED3 entre tecidos tumorais e tecidos normais adjacentes comparados de conjuntos de dados TCGA. (C) Expressão diferencial da proteína TMED3 entre tecidos normais e tumores primários em conjuntos de dados CPTAC/UALCAN, incluindo carcinoma invasivo de mama (BRCA), adenocarcinoma do cólon (COAD), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma de células claras renais (KIRC), carcinoma hepatocelular hepático (LIHC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), cistadenocarcinoma seroso ovariano (OV), adenocarcinoma pancreático (PAAD) e carcinoma endometrial do corpo uterino (UCEC). Os dados são apresentados como plots de caixa. A significância estatística foi analisada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon ou testes de rank sinalizados de Wilcoxon, conforme apropriado. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; NS, não significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de características clinicopatológicas
A análise em estádio clínico demonstrou que a expressão de TMED3 foi significativamente maior em tumores em estágio avançado (Estágio III–IV) em comparação com tumores em estágio inicial (Estágio I–II) em ACC, KIRC, KIRP e LUAD (Figura 2). Em contraste, a expressão de TMED3 foi significativamente reduzida em tecidos UCEC em estágio avançado. Esses achados sugerem que a expressão elevada de TMED3 pode estar associada à progressão tumoral em vários tipos de câncer.

Figura 2. Associação entre a expressão do TMED3 e o estágio patológico em múltiplos tipos de câncer. Gráficos de violino mostrando níveis de expressão de mRNA TMED3 em tumores em estágio inicial (Estágio I–II) e em estágios avançados (Estágios III–IV) em carcinoma adrenocortical (ACC), carcinoma de células claras renais (KIRC), carcinoma papilar renal renal (KIRP), adenocarcinoma pulmonar (LUAD) e carcinoma endometrial do corpo uterino (UCEC). Os níveis de expressão são apresentados como log₂(TPM + 1). A significância estatística foi avaliada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. *P < 0,05, ***P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise prognóstica
As análises de regressão de Cox e sobrevivência demonstraram que alta expressão de TMED3 estava associada a um SO mais fraco em ACC, COAD, LUAD e UVM (Figura 3A). A análise DSS revelou ainda que a expressão elevada de TMED3 estava significativamente associada a DSS desfavorável em ACC, COAD, GBM, KIRP e UVM (Figura 3B). Notavelmente, ACC, COAD e UVM apresentaram consistentemente prognóstico ruim tanto para OS quanto para DSS em pacientes com alta expressão de TMED3. Associações prognósticas em nível de tendência também foram observadas em tipos tumorais selecionados, incluindo LUAD, KIRC e LGG. Esses achados sugerem que a expressão do TMED3 pode ter relevância prognóstica em múltiplas malignidades.

Figura 3. Significado prognóstico da expressão do TMED3 na análise pan-câncer. (A) Gráfico de floresta mostrando a associação entre expressão de TMED3 e sobrevivência geral (SO) em vários tipos de câncer. (B) Gráfico de floresta mostrando a associação entre a expressão do TMED3 e a sobrevivência específica da doença (DSS) em múltiplos tipos de câncer. Razões de risco (HRs) e intervalos de confiança de 95% (ICs 95%) foram calculados usando análise de regressão de hazards proporcionais de Cox. HR > 1 indica prognóstico ruim associado à alta expressão de TMED3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de mutações
A análise de alterações genéticas usando o banco de dados cBioPortal demonstrou que as alterações TMED3 em cânceres consistiam principalmente em mutações, amplificações, deleções profundas e múltiplas alterações (Figura 4). A maior frequência de alterações do TMED3 foi observada no mesotelioma (MESO), principalmente impulsionado pela amplificação gênica (2,3%). A ESCA mostrou tipos de alteração mistos, incluindo mutação (0,55%), amplificação (1,1%) e deleção profunda (0,55%). Em contraste, nenhuma alteração genética detectável de TMED3 foi identificada nos conjuntos de dados LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT e GBM. Esses achados indicam que alterações genômicas do TMED3 ocorrem de maneira específica para o tumor e podem contribuir para a heterogeneidade do câncer.

Figura 4. Cenário de alterações genéticas do TMED3 em cânceres. Frequência e tipos de alterações genéticas TMED3 em conjuntos de dados pan-câncer obtidos do banco de dados cBioPortal. As categorias de alteração incluíram mutação, amplificação, deleção profunda e múltiplas alterações. O eixo y indica a frequência de alteração (%) entre os tipos de câncer. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de metilação de DNA
A análise do banco de dados UALCAN demonstrou que os níveis de metilação do promotor TMED3 foram significativamente aumentados nos tecidos tumorais BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD e PRAD em comparação com os tecidos normais correspondentes (Figura 5). Em contraste, níveis reduzidos de metilação do promotor TMED3 foram observados nos tecidos BLCA, TGCT e UCEC em relação aos controles normais. Esses achados sugerem que a metilação aberrante do promotor TMED3 pode contribuir para a regulação específica do tumor na expressão do TMED3.

Figura 5. Níveis de metilação do promotor TMED3 em diferentes tipos de câncer. Comparação dos níveis de metilação do promotor TMED3 entre tecidos tumorais e tecidos normais correspondentes no carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma invasivo da mama (BRCA), adenocarcinoma do cólon (COAD), carcinoma esofágico (ESCA), carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (HNSC), carcinoma de células claras renais (KIRC), carcinoma papilar renal renal (KIRP), carcinoma hepatocelular hepático (LIHC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), adenocarcinoma pancreático (PAAD), conjuntos de dados de adenocarcinoma de próstata (PRAD), tumores de células germinativas testiculares (TGCT) e carcinoma endometrial do corpo uterino (UCEC) obtidos do UALCAN. Os dados são apresentados como valores β em gráficos de caixa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise das correlações TMED3, TMB e MSI
A análise de correlação de Spearman demonstrou que a expressão de TMED3 foi positivamente correlacionada com TMB em ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM e UCEC, enquanto correlações negativas foram observadas em CESC, LUAD e TGCT (Figura 6A). Além disso, a expressão de TMED3 foi positivamente associada à MSI em DLBC, KIRC, SKCM, STAD e UCEC (Figura 6B). Notavelmente, a expressão de TMED3 mostrou correlações positivas tanto com TMB quanto com MSI em KIRC, STAD e UCEC, o que pode indicar possíveis associações com imunogenicidade tumoral nesses cânceres.

Figura 6. Correlação da expressão de TMED3 com a carga mutacional tumoral e a instabilidade de microssatélites na análise pan-câncer. (A) Gráfico de radar mostrando a correlação entre a expressão de TMED3 e a carga mutacional tumoral (TMB) entre os cânceres. (B) Gráfico de radar mostrando a correlação entre a expressão do TMED3 e a instabilidade de microssatélites (MSI) entre os cânceres. Os coeficientes de correlação foram calculados usando análise de correlação de Spearman. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de características imunes
A análise ESTIMATE demonstrou que a expressão do TMED3 foi negativamente correlacionada com a pontuação estromal, a pontuação imune e a pontuação ESTIMATE em BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA e UCEC (Figura 7A). Em contraste, correlações positivas entre a expressão do TMED3 e essas pontuações relacionadas ao sistema imunológico foram observadas em LGG, LIHC e PCPG. Não foram identificadas correlações significativas em ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV e UCS. Esses achados sugerem que o TMED3 pode influenciar o microambiente tumoral e a infiltração de células imunológicas de maneira dependente do tipo de câncer. A análise de correlação por checkpoints imunes demonstrou ainda que a expressão de TMED3 esteve negativamente associada aos genes relacionados a checkpoints imunes CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4 em BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM e THCA (Figura 7B). Correlações positivas entre a expressão de TMED3 e os genes de checkpoint imunológico foram identificadas no LIHC e UVM, enquanto não foram observadas associações significativas em GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ e TGCT. Esses resultados indicam que o TMED3 pode estar associado à regulação imunal tumoral e à sinalização de pontos de verificação imunológica em cânceres selecionados.

Figura 7. Associações entre a expressão do TMED3 e as características imunes ao tumor. (A) Mapa de calor mostrando correlações entre expressão de TMED3 e escore estromal, escore imune e escore ESTIMATE entre cânceres calculados usando o algoritmo ESTIMAT. (B) Mapa de calor mostrando correlações entre a expressão de TMED3 e genes relacionados a checkpoints imunológicos, incluindo CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4. Os coeficientes de correlação foram determinados por meio da análise de correlação de Spearman. A escala de cores indica força de correlação. *P < 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de sensibilidade a medicamentos
A análise de sensibilidade a medicamentos usando a plataforma GSCALite, baseada nos conjuntos de dados do GDSC, demonstrou que a expressão do TMED3 estava negativamente correlacionada com os valores de concentração inibitória metade máxima (IC₅₀) de 17-AAG, lapatibe, PD-0325901, RDEA119 e trametinibe (Figura 8). Esses achados sugerem que tumores com expressão elevada de TMED3 podem apresentar sensibilidade aumentada a esses agentes anticâncer, sugerindo possíveis associações entre a expressão de TMED3 e a sensibilidade terapêutica.

Figura 8. Correlação entre expressão de TMED3 e sensibilidade a medicamentos anticâncer. Gráfico de bolhas mostrando correlações entre a expressão do mRNA TMED3 e a sensibilidade a medicamentos anticâncer obtidas a partir de conjuntos de dados da Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) pela plataforma GSCALite. O tamanho da bolha representa significância estatística baseada na taxa de falsas descobertas (FDR), e a cor indica valores de coeficientes de correlação. Correlações negativas indicam aumento da sensibilidade ao medicamento associada à alta expressão de TMED3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Expressão e prognóstico do TMED3 no câncer de cólon
A análise de expressão do TMED3 demonstrou níveis significativamente aumentados de TMED3 em tecidos de câncer de cólon em comparação com tecidos normais do cólon nos conjuntos de dados TCGA (Figura 9A). A análise pareada usando tecidos normais adjacentes correspondentes como controles confirmou ainda mais a expressão elevada de TMED3 em tecidos de câncer de cólon (Figura 9B). De acordo com os achados transcriptômicos, a análise da expressão proteica usando conjuntos de dados UALCAN/CPTAC e coloração imunohistoquímica demonstrou aumento na expressão da proteína TMED3 em tecidos de câncer de cólon em comparação com tecidos normais de cólon (Figuras 9C–9E). A análise da curva ROC mostrou uma área abaixo do valor da curva (AUC) de 0,869, indicando desempenho diagnóstico favorável do TMED3 para distinguir tecidos de câncer de cólon de tecidos normais (Figura 9F). A análise clinicopatológica demonstrou ainda que a expressão de TMED3 estava significativamente associada ao estágio T, enquanto nenhuma associação significativa foi observada com idade, gênero, estágio N ou estágio TNM (Tabela 1). Esses achados apoiam a possível significância diagnóstica do TMED3 no câncer de cólon.

Figura 9. Expressão, valor diagnóstico e validação imuno-histoquímica do TMED3 no câncer de cólon. (A) Expressão diferencial de mRNA TMED3 entre tecidos de câncer de cólon e tecidos normais do cólon a partir de conjuntos de dados TCGA. (B) Análise pareada da expressão do mRNA TMED3 em tecidos de câncer de cólon e em tecidos normais adjacentes. (C) Expressão da proteína TMED3 em câncer de cólon e tecidos normais obtidos a partir de conjuntos de dados CPTAC/UALCAN. (D) Coloração imunohistoquímica representativa de TMED3 no tecido normal do cólon. (E) Coloração imunohistoquímica representativa de TMED3 em tecido de câncer de cólon mostrando aumento da expressão de TMED3. (F) Curva da característica operacional do receptor (ROC) avaliando o valor diagnóstico de TMED3 no câncer de cólon. Barras de escala = 100 μm. A área sob a curva (AUC) foi de 0,869 com um intervalo de confiança (IC) de 95% de 0,813–0,924. A significância estatística foi analisada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon ou testes de rank sinalizados de Wilcoxon, conforme apropriado. P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tipo		TMED3		Valor P	χ2
		Baixa expressão	Expressão alta
Idade
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Gênero
Feminino	21	10	11	0.94	0.007
Masculino	39	19	20
Estágio T
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
Estágio N
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
Estágio TNM
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Tabela 1: Associação entre a expressão do TMED3 e as características clinicopatológicas no câncer de cólon. As características clinicopatológicas de pacientes com câncer de cólon foram comparadas entre grupos de expressão TMED3 baixa e alta. As associações entre a expressão do TMED3 e as variáveis clinicopatológicas, incluindo idade, sexo, estágio T, estágio N e estágio TNM, foram analisadas usando testes de qui-quadrado (χ²). Os dados são apresentados como o número de pacientes em cada subgrupo. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

A análise de sobrevivência por KM demonstrou que pacientes com alta expressão de TMED3 apresentaram SO significativamente piores (P = 0,031) e DSS (P = 0,020) em comparação com pacientes com baixa expressão de TMED3 (Figuras 10A e 10B). A análise ROC dependente do tempo demonstrou que o desempenho preditivo da expressão do TMED3 para OS gerou valores de AUC de 0,620, 0,564 e 0,575 em 1, 3 e 5 anos, respectivamente (Figura 10C). Além disso, análises de regressão de Cox univariadas e multivariadas identificaram o estágio T, estágio M, estágio patológico e expressão de TMED3 como fatores prognósticos associados à sobrevivência geral no câncer de cólon (Tabela 2). Esses resultados sugerem que a expressão elevada de TMED3 está associada a um prognóstico ruim no câncer de cólon, embora a análise ROC dependente do tempo tenha demonstrado apenas desempenho preditivo modesto.

Figura 10. Significado prognóstico da expressão de TMED3 no câncer de cólon. (A) Curvas de sobrevivência geral (OS) de Kaplan–Meier (KM) comparando pacientes com expressão alta e baixa de TMED3 no câncer de cólon. (B) Curvas de sobrevivência específica da doença (DSS) de Kaplan–Meier comparando pacientes com alta e baixa expressão de TMED3. (C) Curvas de características operacionais do receptor dependentes do tempo (ROC) avaliando o desempenho preditivo da expressão do TMED3 para OS de 1, 3 e 5 anos. As diferenças de sobrevivência foram analisadas usando o teste log-rank. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Características	Análise univariada		Análise multivariada
	Razão de risco (IC 95%)	Valor P	Razão de risco (IC 95%)	Valor P
Gênero	1.101(0.746–1.625)	0.627
Estágio T	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
Estágio N	2.592(1.743–3.855)	<0,001	0.587(0.223–1.584)	0.28
Estágio M	4.193(2.683–6.554)	<0,001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Estágio patológico	2.947(1.942–4.471)	<0,001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Tabela 2: Análises de regressão de riscos proporcionais de Cox univariadas e multivariadas de fatores prognósticos associados à sobrevivência geral no câncer de cólon. Análises de regressão de riscos proporcionais de Cox univariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar a significância prognóstica das características clinicopatológicas e da expressão de TMED3 em pacientes com câncer de cólon. Razões de risco (HRs) são apresentadas com intervalos de confiança de 95% (IC 95%). As variáveis incluíram sexo, estágio T, estágio N, estágio M, estágio patológico e expressão TMED3. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

A análise de sensibilidade a medicamentos demonstrou que pacientes do grupo de alta expressão de TMED3 apresentaram valores estimados mais baixos de IC₅₀ para 5-fluorouracil, lapatibe e trametinibe em comparação com o grupo de baixa expressão de TMED3 (Figura 11). Esses achados sugerem que pacientes com câncer de cólon com expressão elevada de TMED3 podem apresentar sensibilidade aumentada a esses agentes quimioterapêuticos e terapêuticos direcionados, sugerindo possíveis associações entre expressão de TMED3 e resposta terapêutica.

Figura 11. Correlação entre expressão de TMED3 e sensibilidade a medicamentos quimioterapêuticos no câncer de cólon. Gráficos de caixa mostrando valores estimados de concentração inibitória metade máxima (IC₅₀) para 5-fluorouracil, lapatinibo e trametinibe entre os grupos de baixa expressão de TMED3 (G1) e alta expressão de TMED3 (G2). Valores mais baixos de IC₅₀ indicam maior sensibilidade ao medicamento. A significância estatística foi analisada usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Análise de enriquecimento gênico
O GSEA, utilizando conjuntos de dados KEGG do banco de dados MSigDB, demonstrou que genes relacionados a TMED3 no câncer de cólon foram significativamente enriquecidos em vias associadas a ribossomos, processamento e apresentação de antígenos, fosforilação oxidativa e via do fosfato de pentose (Figura 12). Esses achados sugerem que o TMED3 pode participar da progressão tumoral por meio das vias acima no câncer de cólon.

Figura 12. Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) de genes relacionados a TMED3 em câncer de cólon. Gráficos GSEA mostrando o enriquecimento de genes relacionados à TMED3 em vias associadas ao processamento e apresentação de antígenos, ribossomo, fosforilação oxidativa e via do fosfato de pentose no câncer de cólon. Valores de pontuação de enriquecimento normalizado (NES), valor nominal P e taxa de falsa descoberta (FDR) são indicados em cada painel. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Este estudo demonstrou que o TMED3 foi expresso de forma aberrante em múltiplos cânceres e esteve associado à progressão tumoral, prognóstico, características imunológicas, TMB, MSI e sensibilidade a medicamentos. No câncer de cólon, a superexpressão do TMED3 esteve associada a desfechos de sobrevivência desfavoráveis e aumento do valor diagnóstico. A análise de enriquecimento funcional sugeriu ainda que o TMED3 pode participar das vias metabólicas e de sinalização relacionadas ao câncer. Coletivamente, esses achados apoiam investigações adicionais do TMED3 como um potencial biomarcador diagnóstico e prognóstico no câncer pan-câncer, especialmente no câncer de cólon.

Disponibilidade de Dados:
Os conjuntos de dados analisados neste estudo foram obtidos a partir de bancos de dados públicos, incluindo The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; acessado em 1º de julho de 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; acessado em 1º de julho de 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; acessado em 5 de julho de 2025) e a plataforma Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) por meio da GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; acessado em 5 de julho de 2025). Todos os dados processados gerados durante este estudo estão incluídos no artigo.

Discussão

As proteínas TMED são altamente conservadas que contêm o domínio EMP24 e existem como monômeros ou dímeros dentro das células^{eucarióticas 20}. Os membros da família TMED são proteínas transmembranar do tipo I que participam do tráfego proteico mediado por vesículas e do transporte^{intracelular 20}. A família de proteínas p24 compreende 10 membros TMED, incluindo TMED3. Evidências crescentes mostraram que TMED3 é expresso de forma anormal em várias malignidades, como carcinoma endometrial, osteossarcoma, carcinoma de células claras, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata e câncer^de mama 4,6,21,22,23. A expressão elevada de TMED3 também foi associada a prognóstico desfavorável em múltiplos tipos^{de tumor} 3,5,17,18,19. No carcinoma de células escamosas pulmonares, o TMED3 demonstrou facilitar a progressão tumoral por meio da regulação da ezrin, enquanto o TMED3 silenciando suprimiu a proliferação celular, formação de colônias, migração e desregulação proteica relacionada à^apoptose. Coletivamente, esses estudos indicam que o TMED3 está intimamente envolvido no desenvolvimento e progressão do câncer; No entanto, suas funções biológicas e mecanismos moleculares no câncer pan-câncer ainda precisam ser totalmente esclarecidos.

No presente estudo, múltiplos bancos de dados públicos foram integrados para avaliar de forma abrangente os padrões de expressão, a importância prognóstica, as características imunes e as potenciais funções biológicas do TMED3 em diferentes tipos de câncer. A expressão de TMED3 aumentou significativamente em 26 tipos de tumores, e esses achados foram ainda confirmados por meio de análises de tumor pareado e tecido normal adjacente em vários tipos de câncer. De forma consistente, dados do CPTAC revelaram expressão elevada da proteína TMED3 em BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV e UCEC. Curiosamente, embora a expressão do mRNA TMED3 tenha sido elevada nos tecidos PAAD, a redução da expressão proteica foi observada no banco de dados UALCAN, sugerindo que a regulação pós-transcricional, a degradação de proteínas ou modificações pós-traducionais podem contribuir para essa discrepância. Estudos anteriores demonstraram que a superexpressão do TMED3 em células de câncer de mama promove o acúmulo de β-catenina e Axina-2 tanto no citoplasma quanto no núcleo das células MCF-7 e potencializa a expressão de alvos Wnt/β-catenina a jusante, incluindo c-myc, MMP7 e TCF4, facilitando assim a proliferação, migração e invasão das células^{tumorais 24}. Da mesma forma, foi relatado que o TMED3 é regulado para cima em câncer de pulmão não de pequenas células, e o silenciamento do TMED3 suprime a proliferação de células tumorais e a capacidade^{invasiva 25}. No estudo atual, análises clinicopatológicas mostraram que a expressão do TMED3 estava elevada em ACC, KIRC, KIRP e LUAD em estágio avançado, enquanto menor expressão foi observada no UCEC em estágio avançado, indicando possíveis papéis biológicos específicos do tumor do TMED3 durante a progressão do câncer. Análises de sobrevivência também demonstraram associações significativas entre alta expressão de TMED3 e OS e DSS desfavoráveis em ACC, COAD e UVM, apoiando o valor prognóstico potencial de TMED3 em múltiplas malignidades. Além disso, a análise de metilação do promotor revelou níveis aumentados de metilação de TMED3 em BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD e PRAD, enquanto níveis reduzidos de metilação foram identificados em BLCA, TGCT e UCEC. Esses achados indicam que a metilação aberrante do promotor pode contribuir para a desregulação da expressão de TMED3 de forma dependente do tumor e pode participar do desenvolvimento do câncer.

A MSI representa um subtipo molecular distinto de câncer que frequentemente está associado a uma melhor resposta à imunoterapia, pois esses tumores apresentam carga mutacional elevada e aumento da expressão^{de PD-L1 26,27}. Tumores com alta TMB podem gerar numerosos neoantígenos derivados de mutações somáticas, aumentando assim a atividade imune antitumoral mediada por células T e potencialmente aumentando a sensibilidade ao bloqueio dos pontos de controle^{imunológicos 28,29}. No presente estudo, a expressão do TMED3 mostrou correlações positivas tanto com o TMB quanto com o MSI no KIRC, STAD e UCEC, indicando que o TMED3 pode estar ligado à imunogenicidade tumoral e à resposta imunoterapêutica nesses tipos de câncer. Evidências crescentes demonstraram que o microambiente tumoral, especialmente os componentes imunes e estromais, desempenha um papel fundamental na progressão do câncer, resposta terapêutica, recidiva e prognóstico do paciente. O algoritmo ESTIMATE calcula as pontuações estromal, imune e ESTIMATE de acordo com padrões de expressão gênica relacionados ao sistema imunológico, e investigações anteriores relataram relações significativas entre essas pontuações e os desfechos clínicos em câncer de próstata, glioblastoma e câncer de^cólon 30,31,32. Nossas análises demonstraram que a expressão do TMED3 esteve variadamente associada ao escore estromal, ao escore imune e ao escore ESTIMATE em diferentes tipos de tumor, sugerindo que o TMED3 pode contribuir para a progressão tumoral por meio da modulação do microambiente tumoral. Além disso, a expressão de TMED3 foi correlacionada com múltiplos genes relacionados a checkpoints imunológicos, incluindo CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4, embora a direção e a magnitude dessas associações diferissem entre os tipos tumorais. Correlações positivas significativas entre TMED3 e marcadores de checkpoint imunológico foram identificadas em ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM e UVM, sugerindo que tumores com expressão elevada de TMED3 nesses cânceres podem apresentar sensibilidade aumentada à imunoterapia. Análises de sensibilidade a medicamentos também revelaram associações entre a expressão do TMED3 e a resposta ao 17-AAG, lapatinibe, PD-0325901, RDEA119 e trametinibe, indicando uma possível relação entre expressão do TMED3 e eficácia terapêutica.

O câncer de cólon foi selecionado para validação imunohistoquímica, e os resultados confirmaram que a expressão de TMED3 foi marcadamente elevada nos tecidos do câncer de cólon em comparação com os tecidos normais do cólon, consistente com achados^anteriores7. Análises clinicopatológicas também revelaram uma associação significativa entre a expressão de TMED3 e o estágio T no câncer de cólon. Além disso, o TMED3 demonstrou potencial de valor diagnóstico, enquanto o aumento da expressão do TMED3 esteve associado a um prognóstico mais ruim para o paciente. No entanto, análises ROC dependentes do tempo mostraram que os valores de AUC para prever OS de 1, 3 e 5 anos estavam apenas marginalmente acima de 0,5, indicando precisão preditiva limitada apesar da significância estatística. Esses achados sugerem que o TMED3 atualmente tem maior valor como biomarcador prognóstico exploratório do que como um preditor robusto para aplicações clínicas rotineiras. Análises de regressão de Cox univariadas e multivariadas identificaram ainda mais a expressão do estádio T, estágio M, estágio patológico e TMED3 como fatores prognósticos independentes associados ao SO no câncer de cólon. Análises de sensibilidade a medicamentos indicaram que pacientes com expressão elevada de TMED3 podem ser mais responsivos a agentes terapêuticos comumente usados, incluindo 5-fluorouracil, lapatinibe e trametinibe. Além disso, análises de enriquecimento funcional revelaram que genes relacionados a TMED3 no câncer de cólon foram principalmente enriquecidos em vias associadas ao ribossomo, processamento e apresentação de antígenos, fosforilação oxidativa e via do fosfato de pentose.

Este estudo avaliou sistematicamente os perfis de expressão, o valor prognóstico e as características imunológicas do TMED3 em vários tipos de câncer. No entanto, várias limitações devem ser consideradas. A maioria dos achados foi derivada de análises de bioinformática e multiômica baseadas em conjuntos de dados públicos, e a validação experimental foi limitada à análise imunohistoquímica em tecidos de câncer de cólon. Além disso, não foram realizados experimentos funcionais para investigar os mecanismos moleculares precisos subjacentes ao papel do TMED3 na progressão tumoral. Portanto, são necessários estudos adicionais in vitro e in vivo para esclarecer ainda mais as funções biológicas e o potencial significado terapêutico da TMED3 em diferentes malignidades.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.5% Ammonia Solution	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Acid Alcohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Neutral Buffered Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian Blue Stain	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Citrate-Based Antigen Retrieval Buffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler package	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2 package	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE package	R package	Version 1.0.13	N/A
GSCALite platform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx database	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hematoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Hydrogen Peroxide	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier Survival Analysis	survival R package	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG Gene Sets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Light Microscope	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin Embedding Medium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymer-Based Detection System	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
Secondary Rabbit Anti-Mouse IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA database	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3 Primary Antibody	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-Buffered Saline (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN database	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon Statistical Analysis	stats R package	N/A	SCR_003005
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A