Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas Aneuploides a Partir de Células Primárias do Líquido Amniótico via Eletroporação por Plasmídeo Episomal

Zifan Song; Jing Wang; Peng Yuan; Xiaohui Zhu; Liying Yan; Jianying Guo

doi:10.3791/71975

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Artigo de método

Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas Aneuploides a Partir de Células Primárias do Líquido Amniótico via Eletroporação por Plasmídeo Episomal

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DOI:

10.3791/71975

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3 de setembro de 2026

Zifan Song¹^,²^,³^,⁴ , Jing Wang¹^,²^,³^,⁴ , Peng Yuan¹^,²^,³^,⁴ , Xiaohui Zhu¹^,²^,³^,⁴ , Liying Yan¹^,²^,³^,⁴ , Jianying Guo¹^,²^,³^,⁴

¹State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ²National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ³Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, ⁴Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método reprodutível para gerar iPSCs humanas aneuploides livres de integração a partir de células primárias de líquido amniótico utilizando eletroporação com plasmídeo episomal. Ele otimiza as condições de entrega e cultivo para estabilizar as anormalidades cromossômicas, oferecendo uma plataforma prática para criar modelos específicos de doenças para pesquisas subsequentes e aplicações clínicas.

Resumo

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) específicas de pacientes a partir de células do líquido amniótico (AFCs) portadoras de aneuploidias cromossômicas definidas oferece uma plataforma poderosa para modelar distúrbios genéticos. No entanto, o estabelecimento de um protocolo confiável e reprodutível de reprogramação para AFCs aneuploides permanece tecnicamente desafiador devido à instabilidade genômica intrínseca e à capacidade proliferativa variável dessas células. Aqui, apresentamos um método abrangente e não integrativo para gerar iPSCs humanas aneuploides a partir de AFCs primárias utilizando eletroporação com plasmídeos episomais. Este protocolo detalha todo o fluxo de trabalho, abrangendo o descongelamento e expansão celular com uma estratégia gradual de adaptação ao meio, além da entrega otimizada de plasmídeos via sistema de eletroporação, cultura pós-eletroporação sequencial com mudanças de meio direcionadas à transição mesenquimal para epitelial (MET) e seleção mecânica de colônias com base em critérios morfológicos definidos. Descrevemos ainda procedimentos de validação, incluindo coloração por imunofluorescência para marcadores centrais de pluripotência, análise cariotípica por bandamento G para confirmar a manutenção do cariótipo aneuploide e verificação da eliminação do vetor episomal por PCR. Este protocolo livre de camada de alimentação (feeder-free) e livre de integração gera linhagens de iPSCs aneuploides adequadas para modelagem de doenças, triagem de fármacos e estudos de biologia cromossômica.

Introdução

O advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas transformou a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e a descoberta de fármacos, ao permitir a geração de células pluripotentes específicas de pacientes sem os dilemas éticos associados às células-tronco embrionárias humanas (hESCs). A base conceitual do reprogramamento celular surgiu da demonstração de transferência nuclear de células somáticas por Gurdon¹, seguida pelo estabelecimento das células-tronco embrionárias²^,³^,⁴ e, finalmente, pelo desenvolvimento da pluripotência induzida⁵por meio da expressão ectópica de OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC. Desde então, a tecnologia de iPSC tornou-se uma plataforma indispensável para investigar o desenvolvimento humano, distúrbios genéticos e medicina de precisão. Os primeiros métodos de reprogramamento utilizavam vetores retrovirais ou lentivirais, mas os riscos associados à integração limitaram sua aplicação clínica. Consequentemente, o desenvolvimento de métodos de reprogramamento livres de integração tornou-se uma prioridade para a tradução clínica. Esses métodos incluem o uso do vírus Sendai⁶, mRNA sintético⁷, vetores episomais baseados no mecanismo oriP/EBNA1 (antígeno nuclear de Epstein-Barr-1)⁸ e reprogramamento químico⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² utilizando apenas compostos de pequenas moléculas.

A aneuploidia é a principal causa de aborto espontâneo e defeitos congênitos em humanos. Compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes às anomalias do desenvolvimento relacionadas à aneuploidia exige modelos celulares apropriados que recapitulem fielmente o contexto genético dessas condições. As células do líquido amniótico (CLA) representam um material inicial atrativo e eficiente para a geração de iPSCs específicas do paciente¹³^,¹⁴^,¹⁵, particularmente no contexto de distúrbios genéticos diagnosticados pré-natalmente¹⁶^,¹⁷. O líquido amniótico residual obtido durante a amniocentese de rotina permite o acesso a células derivadas do feto sem a necessidade de biópsia invasiva adicional do tecido após o nascimento. Em comparação com células somáticas adultas, as CLA geralmente apresentam maior capacidade proliferativa, telômeros mais longos, menor carga mutacional ambiental acumulada e maior plasticidade de desenvolvimento, características que facilitam a reprogramação celular¹⁸^,¹⁹. De forma importante, as CLA preservam fielmente a constituição cromossômica do feto em desenvolvimento, tornando-se uma fonte ideal para o estabelecimento de modelos de iPSCs específicos para doenças com anomalias cromossômicas, incluindo trissomia 21²⁰, trissomia 18²¹, síndrome de Turner e síndrome de Klinefelter²².

Este protocolo fornece um guia abrangente para a geração de iPSCs livres de integração a partir de células de líquido amniótico aneuploides utilizando vetores episomais. O método inclui procedimentos detalhados para isolamento celular, reprogramação, seleção de clones e caracterização. Em comparação com outros métodos de reprogramação livres de integração, o sistema de plasmídeos episomais oferece um equilíbrio prático entre segurança genômica, simplicidade técnica e custo-efetividade, tornando-o particularmente adequado para uso rotineiro em laboratório e aplicações de biobancos em larga escala. O protocolo aplica-se tanto a CAFs criopreservadas provenientes de biobancos estabelecidos quanto a amostras frescas residuais de líquido amniótico obtidas durante diagnóstico pré-natal de rotina. Embora as eficiências de reprogramação episomal relatadas para CAFs sejam relativamente baixas, e possa ocorrer recuperação cromossômica espontânea durante a reprogramação ou cultivo prolongado, especialmente em certas aneuploidias, o fluxo de trabalho é facilmente aplicável ao estabelecimento de biobancos de iPSCs específicos para doenças, estudos de biologia cromossômica e desenvolvimento humano inicial, e diferenciação posterior em tipos celulares linhagem-específicos. Esta abordagem é particularmente adequada para gerar linhagens de iPSCs livres de integração e clinicamente relevantes a partir de amostras pré-natais, para modelagem de doenças e estudos mecanicistas de anomalias cromossômicas.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de líquido amniótico humano foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (IRB) do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim (Protocolo nº M2023406). As amostras com aneuploidia foram obtidas do Biobanco do Centro de Medicina Reprodutiva do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim, um repositório clínico certificado pelo Estado, especializado em recursos humanos relacionados ao desenvolvimento e à reprodução. Esses espécimes consistem em líquido amniótico residual originalmente coletado durante amniocentese de rotina para diagnóstico pré-natal clínico, que de outra forma teria sido descartado. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores antes da coleta, autorizando expressamente o armazenamento das amostras residuais no Biobanco e seu uso posterior para pesquisa. Todas as amostras foram rigorosamente anonimizadas para proteger a privacidade dos pacientes. Foram selecionadas amostras com cariótipos de aneuploidia confirmados por meio de análise clínica de bandas G, incluindo trissomia 21 (síndrome de Down, N = 2), trissomia 18 (síndrome de Edwards, N = 1), monossomia X (síndrome de Turner, N = 1) e síndrome de Klinefelter (N = 2), para a indução de iPSCs. As informações detalhadas sobre as linhagens celulares com aneuploidia utilizadas na reprogramação estão resumidas na Tabela 1.

1. Descongelamento e cultura primária de células de líquido amniótico biobancadas

OBSERVAÇÃO: Esta seção detalha o procedimento padronizado para recuperação e isolamento de CAFs aneuploides do Biobanco. As células cultivadas são expandidas para obter populações suficientes para o subsequente reprogramamento episomal.

Procedimento padronizado de descongelação
1. Equilíbrio do meio: Aqueça o meio completo AmnioType-1 a 37 °C antes do uso.
2. Recuperação da amostra: Retire um criotubo contendo aproximadamente 300.000 CAFs criopreservadas em meio de congelamento celular do armazenamento em nitrogênio líquido. Transfira imediatamente o tubo para o laboratório sobre gelo seco para evitar descongelação prematura.
3. Descongelação rápida: Mergulhe a metade inferior do criotubo em banho-maria a 37 °C e agite suavemente. Interrompa o processo de descongelação quando restar apenas um pequeno cristal de gelo visível.
  NOTA: Evite a descongelação completa. Isso evita que as células sejam expostas aos efeitos tóxicos do DMSO aquecido.
4. Diluição: Em capela de fluxo laminar, transfira a suspensão celular gota a gota para um tubo cônico de 15 mL contendo 4 mL de meio AmnioType-1 pré-aquecido.
5. Centrifugação: Centrifugue a suspensão a 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Plaqueamento: Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em 2 mL de meio fresco AmnioType-1. Transfira as células para uma placa de 6 poços ou frasco T25 previamente recoberto com gelatina a 0,1% numa densidade de 30.000–50.000 células/cm².
7. Incubação inicial: Coloque as células em incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO₂. Examine os frascos ao microscópio invertido de contraste de fase no Dia 3 após o plaqueamento para confirmar a adesão inicial das células.
Expansão e transição de meio de CAFs primárias
1. Preparação do meio de cultura de fibroblastos (FC): Para preparar 100 mL de meio de cultura de fibroblastos caseiro, combine 82 mL de DMEM de alta glicose com 15 mL de Soro Bovino Fetal (FBS). Adicione 1 mL de GlutaMAX 100×, 1 mL de Ácidos Aminoácidos Não Essenciais (NEAA) 100× e 1 mL de Penicilina-Estreptomicina (P/S). Filtre o meio por meio de sistema de filtração a vácuo com membrana de 0,22 µm em ambiente estéril.
2. Durante a expansão, altere gradualmente o meio das CAFs a cada 3 dias, partindo do meio clínico especializado (AmnioType-1) para um sistema padronizado de cultura de fibroblastos (meio FC, caseiro), a fim de garantir estabilidade metabólica antes da eletroporação.
  1. Realize uma transição gradual do meio:
    1. Dia 3 (75% AmnioType-1: 25% FC): Aspire o meio AmnioType-1 existente. Adicione um meio misto composto por 75% de AmnioType-1 e 25% de meio FC.
    2. Dia 6 (50% AmnioType-1: 50% FC): Aspire e substitua por uma proporção 1:1 de meio AmnioType-1 e meio FC.
    3. Dia 9 (25% AmnioType-1: 75% FC): Aspire e substitua por uma mistura de 25% de AmnioType-1 e 75% de meio FC.
    4. Dia 12 (100% FC): Aspire e mude para meio FC a 100%.
      NOTA: Essa adaptação gradual reduz o choque celular e evita a dessanexão de clones aneuploides sensíveis.
3. Observe diariamente a morfologia das colônias. O líquido amniótico contém uma população heterogênea de células. Em microscopia de contraste de fase, identifique os dois tipos principais: tipo F (semelhante a fibroblastos, em forma de fuso) e tipo E (semelhante a epitélio, arredondadas). A subpopulação mesenquimal com morfologia de fibroblasto é a mais adequada para reprogramação.
  NOTA: Monitore atentamente as células quanto a sinais de senescência.
Subcultivo de CAFs primárias
1. Quando as células atingirem 80%–90% de confluência (geralmente entre o Dia 10–14), aspire o meio do frasco e lave uma vez suavemente com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem Ca²⁺/Mg²⁺.
2. Adicione 1 mL de solução de Tripsina-EDTA 0,25% para um único poço de uma placa de 6 poços, cobrindo a monocamada celular.
3. Incube a 37 °C por 4–5 min até que as células se desprendam completamente.
4. Neutralize o reagente de dissociação adicionando 3 mL de meio FC. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL.
5. Centrifugue a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente.
6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio FC fresco. Conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro ou contador automático de células com exclusão de azul de tripano.
7. Plaque as células em um novo frasco T25 numa densidade de 30.000–50.000 células/cm² em meio completo (geralmente numa proporção de 1:2 ou 1:3).
8. Expanda as células até a passagem 3–5 antes de utilizá-las para reprogramação. Não utilize células além da passagem 6.
  NOTA: A qualidade celular no momento da eletroporação é o fator mais importante para o sucesso da reprogramação. Utilize apenas CAFs do tipo F saudáveis, em fase logarítmica de crescimento, sem sinais de senescência ou morfologia anormal.

2. Eletroporação de plasmídeos episomais em CAFs utilizando um sistema de eletroporação celular

Revestir os vasos de cultura com matriz da membrana basal
1. Descongele a matriz da membrana basal (Matrigel) durante a noite em 4 °C em gelo
2. Resfrie esterilmente DPBS ou DMEM/F-12 em gelo. Pré-resfrie ponteiras e tubos em gelo por 30 minutos.
3. Dilua a matriz da membrana basal 1:200 em DMEM/F-12 gelado utilizando ponteiras e tubos frios (por exemplo, 30 µL matriz + 6 mL de DMEM/F-12 para uma placa de 6 poços).
4. Misture bem, mas suavemente, pipetando para cima e para baixo 5 a 6 vezes. Evite introduzir bolhas de ar.
5. Adicione a solução de revestimento diluída aos recipientes de cultura na proporção de 1 mL por poço para uma placa de 6 poços.
6. Incubar os recipientes revestidos em 37 °C por pelo menos 1 h, ou à temperatura ambiente por 2 h.
7. Aspire a solução de revestimento imediatamente antes do plaqueamento das células. Adicione 2 mL de meio FC sem antibiótico mais 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCK) e devolva a placa a um 37 °C incubadora. Não permita que a superfície revestida seque.
  OBSERVAÇÃO: As placas revestidas podem ser armazenadas em 4 °C selado com parafilm por até 7 dias. Equilibrar à temperatura ambiente antes do uso.
Descongele e prepare os plasmídeos de reprogramação episomal
1. Seleção de plasmídeos: Utilize os seguintes plasmídeos episomais para reprogramação: pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL e pCXLE-EBNA1.
  OBSERVAÇÃO: (Opcional) Para otimização das condições de eletroporação, o pCE-GFP pode ser eletroporado em paralelo nas mesmas condições. A expressão de GFP nas primeiras 48–72 h fornece um indicador conveniente da eficiência de transfeção, enquanto a perda gradual do sinal de GFP durante passagens subsequentes pode ser utilizada para monitorar a diluição transitória do plasmídeo.
2. Controle de qualidade (QC): Verifique a concentração e pureza do DNA utilizando um espectrofotômetro. Certifique-se de que a razão A260/A280 esteja entre 1,8 e 1,9. Certifique-se de que a concentração de cada plasmídeo seja maior que 1 µg/µL e estéril.
  OBSERVAÇÃO: É fundamental garantir que todos os plasmídeos sejam preparados utilizando métodos livres de endotoxinas. Endotoxinas residuais podem causar alta citotoxicidade e eficiência de reprogramação significativamente reduzida. Armazene os plasmídeos em alíquotas pequenas a -20 °C para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
3. Para um 100 µL reação, preparar 5 µg da mistura de plasmídeos (razão de peso igual de pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL e pCXLE-EBNA1.
Configure os parâmetros de eletroporação.
1. Inicialize o dispositivo de eletroporação. Configure os parâmetros do pulso para a configuração otimizada para células aderentes primárias: Tensão do pulso: 1.200 V; Duração do pulso: 20 ms; Número de pulsos: 2.
2. Encha a estação de pipetagem com 2 mL do tampão E, garantindo que o eletrodo esteja completamente submerso.
  OBSERVAÇÃO: Se experimentos iniciais apresentarem viabilidade celular abaixo de 50%, considere testar conjuntos alternativos de parâmetros: 950 V / 20 ms / 2 pulsos (mais suave). Essas alternativas sacrificam alguma eficiência em troca de maior sobrevivência.
Preparar CAFs para eletroporação
1. No Dia 0, verifique ao microscópio se as células apresentam morfologia saudável, em forma de fuso, sem sinais de supercrescimento, senescência ou contaminação. Assegure-se de que as células tenham atingido 90% de confluência e estejam na fase logarítmica ativa de crescimento.
2. Imediatamente antes do procedimento de eletroporação, aspire o revestimento de Matrigel e substitua por 2 mL de meio pré-aquecido sem antibiótico meio FC mais 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCK). Pré-aqueça este meio FC sem antibiótico até 37 °C em um incubador por pelo menos 20 min antes de colher as células para o sistema de eletroporação.
  OBSERVAÇÃO: NÃO adicione Penicilina-Estreptomicina (P/S) nem qualquer outro antibiótico a este lote específico de meio. Após a eletroporação, a membrana celular permanece temporariamente permeável e vulnerável. A presença de antibióticos pode levar a um aumento da apoptose.
3. Aspire o meio dos AFCs para eletroporação e lave a monocamada uma vez com DPBS sem Ca²⁺/Mg²⁺.
4. Adicione 2 mL (para frasco T25) da enzima TrypLE Select e incube em 37 °C por 4–5 min.
5. Neutralize com 6 mL de meio completo FC e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Conte as células utilizando um contador automático de células.
6. Centrifugue a 300 × g por 5 min a temperatura ambiente.
7. Remova completamente o sobrenadante utilizando um 200 μL ponta de pipeta, tomando cuidado para não perturbar o pequeno pellet celular.
8. Resuspenda o pellet celular no Tampão R com uma densidade final de 1,0 × 10⁷ a 1,4 × 10⁷ células/mL
  OBSERVAÇÃO: Aspire o sobrenadante tão completamente quanto possível para garantir que o pellet celular esteja seco. O meio de cultura residual pode diluir o tampão de ressuspensão, o que pode reduzir a eficiência da eletroporação. Utilize o Tampão R (para células aderentes) para AFCs. Verifique a seleção do tampão conforme as recomendações do fabricante.
Realize a eletroporação.
1. Alíquota 110 μL da suspensão celular (contendo 1,0–1,4 × 10⁶ células) em um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
  OBSERVAÇÃO: Adicione um extra 10 μL do tampão R até o volume final para garantir uma suspensão celular adequada, o que ajuda a evitar a introdução de bolhas de ar durante a aspiração.
2. Adicione 5 μg mistura de plasmídeos para o 110 μL alíquota celular. Misture com pipetagem suave por 3 vezes.
3. Afixe um estéril 100 μL ponta de eletroporação ao pipetador. Certifique-se de que a ponta clique com segurança.
4. Carregar 100 μL da suspensão de células/ADN, garantindo que não haja bolhas de ar visíveis presentes.
  OBSERVAÇÃO: Bolhas de ar provocam arco elétrico durante o pulso elétrico, o que mata as células e danifica a ponteira. Se forem visíveis bolhas, expulse a mistura de volta para o tubo e repita a aspiração lentamente.
5. Insira a pipeta carregada verticalmente no tubo de Tampão na estação até que clique no lugar. Verifique se todos os parâmetros estão corretos na tela de toque, então pressione o botão Iniciar para entregar a sequência de pulsos.
6. Aguarde a exibição na tela "Completo" (geralmente dentro de 1–2 s). Remova imediatamente a pipeta da estação e dispense diretamente a suspensão de células eletroporadas em 2–3 poços de uma placa revestida de 6 poços contendo meio FC sem antibiótico pré-aquecido + 10 μM Y-27632
7. Descarte a ponteira usada com segurança. Repita os passos para poços adicionais ou réplicas conforme necessário. Coloque a placa de 6 poços em um 37 °C, 5% CO₂₂ incubadora umidificada durante a noite.

3. Cultura de reprogramação pós-eletroporação

OBSERVAÇÃO: Esta seção descreve as mudanças sequenciais de meio e a obtenção do reprogramamento completo de CAFs em iPSCs. A linha do tempo abrange aproximadamente 25 dias, desde a eletroporação até a seleção de colônias.

Aproximadamente 16–18 h após a eletroporação, aspire cuidadosamente o meio sem desalojar as células aderentes sobreviventes. Adicione suavemente 2 mL de meio FC pré-aquecido (contendo P/S) a cada poço para permitir que as células se estabilizem nas primeiras 24 h. Retorne a placa ao incubador.
Do Dia 2 ao Dia 6, substitua metade do meio a cada dois dias: aspire cuidadosamente 1 mL do meio usado e adicione 1 mL de meio fresco TeSR-E8 (E8).
NOTA: A troca parcial do meio preserva fatores autócrinos secretados que apoiam os eventos iniciais de reprogramação. Aspire lentamente da borda do poço para minimizar a perturbação das células em transição, que estão fracamente aderidas.
No Dia 7, realize uma troca completa do meio com 2 mL de E8 a cada dois dias.
Observe diariamente as alterações morfológicas ao microscópio. Espere o aparecimento de agregados parcialmente reprogramados, com aspecto semelhante a calçadas, por volta do Dia 10–14.
NOTA: (Opcional) Suplemente os cultivos com 25–100 μM de butirato de sódio entre os Dias 9–15 se a formação de colônias for fraca²³.
Substitua o meio E8 diariamente a partir do Dia 15.
A partir de aproximadamente Dia 18, inspecione diariamente os poços quanto ao surgimento de colônias verdadeiras de iPSCs. Uma linha do tempo completa do fluxo de trabalho de reprogramação, desde a eletroporação no Dia 0 até a seleção de colônias, é fornecida na Tabela 2.

4. Coleta mecânica de colônias de iPSCs e expansão de linhagens estabelecidas de iPSCs

OBSERVAÇÃO: Distingua colônias verdadeiras de iPSCs de células reprogramadas ou não reprogramadas com base nos critérios morfológicos abaixo. Identifique colônias "ideais" com base nas seguintes características morfológicas: (1) Definição da borda: Busque uma borda nítida, lisa e circular que delimite claramente a colônia das células do líquido amniótico ao redor; (2) Densidade celular: Assegure que as células dentro da colônia sejam pequenas, densamente empacotadas e possuam uma alta razão nucleocitoplasmática com nucléolos proeminentes; (3) Refringência: Colônias de alta qualidade aparecem brilhantes e altamente refringentes em contraste de fase; (4) Planicidade: A colônia deve crescer como uma camada plana e bidimensional, e não como um "agregado" tridimensional. Colônias parcialmente reprogramadas frequentemente aparecem antes das colônias verdadeiras de iPSCs e tendem a ser maiores, mais espessas e mais tridimensionais. Elas se diferenciarão espontaneamente ao serem isoladas e subcultivadas. Não isole colônias que apresentem "vacúolos", bordas irregulares ou sinais de diferenciação central.

Selecionar e transferir colônias de iPSCs mecanicamente
1. Prepare uma placa de 24 poços revestida com Matrigel contendo 0,5 mL por poço de meio E8 suplementado com 10 μM de Y-27632. Mantenha a 37 °C até o uso.
2. Coloque a placa de cultura sob um microscópio estereoscópico dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II. Esterilize a objetiva e o estágio do microscópio estereoscópico com etanol 70% antes de aproximar a placa do campo de visão.
3. Identifique colônias que apresentem morfologia adequada (planas, compactas, com bordas definidas).
4. Usando uma ponteira estéril de 10 μL segurada em um ângulo raso (aproximadamente 30° em relação à horizontal), risque suavemente ao redor do perímetro de uma colônia selecionada para delimitar sua borda. Corte a colônia em cerca de 3 fragmentos fazendo incisões paralelas ao longo de seu diâmetro. Use a mesma ponteira para raspar e levantar suavemente os fragmentos da colônia do substrato e transfira-os para um poço da placa de 24 poços preparada.
5. Repita os passos para cada colônia, colocando os fragmentos em poços separados.
6. Coloque a placa de 24 poços no incubador. Deixe sem perturbação por 24 h para permitir a adesão dos fragmentos.
7. A partir do Dia 2 após a seleção, substitua o meio diariamente por meio E8 sem Y-27632.
8. Quando as colônias selecionadas atingirem 70–80% de confluência (geralmente em 3–6 dias), faça a passagem utilizando Accutase.
Passagem e expansão de linhagens estabelecidas de iPSCs
1. Aspire o meio do poço contendo iPSCs. Adicione Accutase para cobrir a monocamada. Incube à temperatura ambiente por 2–6 min. Observe as bordas das colônias ao microscópio; as células devem começar a se separar, e surgir espaços entre elas.
2. Aspire completamente a solução de Accutase. Adicione 1 mL de meio E8 + 10 μM de Y-27632. Pipete suavemente o meio sobre a superfície das colônias de 5 a 8 vezes usando uma pipeta P1000 para dissociar as colônias em pequenos agregados de 2–8 células.
  NOTA: Evite a dissociação excessiva das iPSCs, pois isso reduz drasticamente a sobrevivência. O objetivo é obter agregados pequenos e uniformes, não uma suspensão de células isoladas.
3. Transfira os agregados com 1 mL de meio E8 + 10 μM de Y-27632 uniformemente para uma placa de 12 poços recém-revestida com Matrigel. Coloque a placa no incubador.
4. Substitua o meio diariamente com meio E8 (sem Y-27632 após o Dia 1).
5. Continue fazendo passagens a cada 3–4 dias em uma razão de divisão de 1:2 a 1:5, dependendo da confluência.
6. Cultive as linhagens de iPSCs por um mínimo de 10 passagens antes de aplicações posteriores para garantir a eliminação estável dos episomos.

5. Caracterização de linhagens iPSC aneuploides

OBSERVAÇÃO: Realize os seguintes ensaios de validação em linhagens de iPSC estabelecidas (passagem 10 ou posterior) para confirmar a pluripotência, a integridade do cariótipo e a eliminação do vetor episomal.

Confirmar a expressão dos marcadores de pluripotência.
1. Validar a expressão dos marcadores centrais de pluripotência utilizando coloração por imunofluorescência, citometria de fluxo ou ambos. Os perfis esperados de marcadores estão resumidos na Tabela 3.
  NOTA: Embora a coloração por imunofluorescência forneça uma confirmação inicial da pluripotência, recomenda-se RT-qPCR e RNA-seq para uma avaliação mais ampla da expressão gênica associada à pluripotência, incluindo LIN28A, DPPA4 e KLF4.
Análise de cariótipo por bandamento G
CRÍTICO: O reprogramamento pode induzir a recuperação da trissomia em um subconjunto de clones. Analisar múltiplos clones (5–10 por linhagem parental) para identificar derivados com manutenção de aneuploidia e aqueles recuperados para euploidia.
1. Coletar iPSCs na passagem 10–15 com 70%–80% de confluência.
2. Adicionar 0,1 μg/mL de colcemida ao meio de cultura. Incubar a 37 °C por 2–4 h para deter as células em metáfase.
  NOTA: A colcemida é um veneno mitótico. Manipular com luvas em cabine de segurança biológica. Descartar resíduos contendo colcemida como material perigoso.
3. Dissociar as células para obter uma suspensão unicelular utilizando Accutase ou equivalente. Centrifugar a 300 × g por 5 min.
4. Res suspender o pellet em 5 mL de solução hipotônica pré-aquecida (0,075 M cloreto de potássio). Incubar a 37 °C por 15–20 min.
5. Adicionar 1 mL de fixador recém-preparado (metanol:ácido acético, na proporção volumétrica 3:1) ao tubo, misturando suavemente. Centrifugar a 300 × g por 10 min.
6. Aspirar o sobrenadante. Adicionar 5 mL de fixador fresco. Misturar suavemente e incubar por 10 min. Centrifugar novamente.
7. Repetir a etapa de fixação (Etapa 6) mais uma vez, totalizando 3 fixações.
8. Após a última centrifugação, ressuspender o pellet em 0,5–1 mL de fixador fresco para obter uma densidade celular adequada.
9. Deixar cair 2–3 gotas da suspensão celular sobre lâminas de vidro limpas e úmidas, de uma altura aproximada de 30 cm. Deixar secar ao ar.
10. Incubar as lâminas a 80 °C por 2 h ou a 65 °C durante a noite para envelhecer os cromossomos.
11. Realizar o bandamento G: tratar as lâminas com solução de tripsina a 0,025% por 30–60 s, enxaguar e corar com solução de Giemsa a 5% por 1–5 min.
12. Analisar pelo menos 20 metáfases bem espalhadas por clone em microscópio de campo claro com imersão em óleo (objetiva 100×).
13. Documentar o cariótipo utilizando a nomenclatura ISCN (por exemplo, 47,XX,+21 para trissomia 21 feminina; 45,X para síndrome de Turner).
  NOTA: O cariótipo com bandamento G detecta anormalidades cromossômicas maiores, mas possui resolução limitada. Ensaios complementares, como análise de Variação no Número de Cópias (CNV), Sequenciamento do Exoma Inteiro (WES) ou Sequenciamento do Genoma Inteiro (WGS), são recomendados para identificar alterações genéticas submicroscópicas e confirmar a integridade genômica das iPSCs.
Verificar a eliminação do vetor episomal por PCR.
NOTA: Esta etapa confirma que todos os plasmídeos episomais foram perdidos da linhagem de iPSCs por meio da amplificação por PCR de sequências específicas do vetor.
1. Extrair DNA genômico de iPSCs (passagem ≥ 10) e de AFCs controle não transfectados utilizando um kit padrão de extração baseado em coluna.
2. Preparar uma reação de PCR de 25 μL. Realizar a PCR utilizando os pares de primers Orip/GAPDH sob as condições de ciclagem (94 °C por 2 min; seguido por 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; extensão final a 72 °C por 5 min). Incluir controle positivo (modelo de plasmídeo) e controle negativo (DNA genômico de células não transfectadas) em cada corrida de PCR.
3. Separar os produtos de PCR em gel de agarose a 2% com um marcador de DNA apropriado.
4. Interpretar os resultados: linhagens de iPSCs com episomas eliminados não devem apresentar bandas de amplificação em 544 pb. O controle positivo deve mostrar bandas do tamanho esperado. O controle negativo não deve apresentar bandas.
Detecção de micoplasma por PCR
1. Coletar 0,5–1 mL do sobrenadante do cultivo após pelo menos 24 h de incubação das culturas de iPSCs, antes da troca do meio, e centrifugar a 12.000 × g por 5 min para remover detritos celulares.
2. Utilizar o sobrenadante clarificado como molde para PCR com o Kit de Detecção de Micoplasma por PCR, seguindo as instruções do fabricante.
3. Separar os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 2%. Prosseguir com experimentos subsequentes somente se as culturas de iPSCs forem confirmadas como livres de micoplasma.
  NOTA: Se as AFCs parentais não forem obtidas de um biobanco certificado com esterilidade documentada e testagem para micoplasma, recomenda-se fortemente a realização de triagem rotineira para micoplasma antes do reprogramamento como etapa inicial de controle de qualidade.
Ensaio de potencial de diferenciação trilinhas (Opcional)
1. Confirmar a capacidade de diferenciação in vitro utilizando diferenciação direcionada trilinhas ou formação de corpos embrioides (EB), seguida pela análise de marcadores específicos das camadas germinativas. Alternativamente, realizar a formação de teratoma in vivo em camundongos imunodeficientes para validação padrão-ouro da pluripotência.
  NOTA: Para protocolos detalhados de ensaio de teratoma ou diferenciação direcionada, consultar procedimentos operacionais padrão publicados²⁴. Esses ensaios são recomendados, mas podem ser omitidos se forem fornecidos dados abrangentes de análise de marcadores in vitro e de diferenciação funcional.

6. Derivação e verificação clonal de célula única

OBSERVAÇÃO: Para garantir que cada linhagem de iPSC origine-se de uma única célula, recomenda-se um processo de verificação clonal em duas etapas. Após a seleção mecânica e expansão, recomenda-se um segundo replante de clone em célula única após a confirmação do cariótipo. A verificação de que cada linhagem de iPSC origina-se de uma única célula é um requisito crítico para a geração de iPSCs. Isso assegura a eliminação da mosaicidade somática parental e confirma que a assinatura diagnóstica de aneuploidia é uniforme em toda a população.

Plaqueamento de célula única
1. Dissocie e re-suspenda colônias de iPSCs com cariótipo confirmado em uma suspensão de células isoladas utilizando Accutase por 2–6 min a 37 °C.
2. Utilize meio E8 suplementado com 10 µM de Y-27632 para maximizar a sobrevivência das células isoladas. Realize o plaqueamento de célula única utilizando um dos seguintes métodos:
  1. Diluição limitante: Dilua a suspensão até uma concentração de 0,5–1 célula por 100 µL. Plaque 100 µL em cada poço de uma placa de 96 poços revestida com Matrigel.
  2. Classificação Fluorescente Ativada por Células (FACS): Ordene diretamente células viáveis únicas nos poços de uma placa de 96 poços revestida com Matrigel.
Verificação e expansão da monoclonalidade
1. Inspeção inicial: Entre 24–48 h após o plaqueamento, utilize um microscópio de contraste de fase de alta resolução para inspecionar cada poço. Marque apenas os poços que contenham um único evento de adesão bem definido. Exclua poços com múltiplos agregados ou sem células.
2. Crescimento da colônia: Mantenha as células únicas identificadas em meio E8 sem inibidor de ROCK após as primeiras 24 h.
3. Expansão sequencial: Quando a colônia derivada de célula única atingir 70% de confluência, expanda sequencialmente as células da placa de 96 poços para placas de 24, 12 e, finalmente, 6 poços.
  NOTA: Em pesquisas com terapia celular, frequentemente é exigida evidência fotográfica do estágio de célula única (Dia 0 ou Dia 1) como parte do Certificado de Análise, a fim de comprovar o status de linhagem pura das linhagens de iPSCs.
  As causas potenciais de reprogramação mal-sucedida, formação subótima de colônias e desafios durante o estabelecimento de clones de iPSCs são resumidas juntamente com soluções práticas na Tabela 4.

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Resultados

Progressão morfológica durante a reprogramação

As células primárias do líquido amniótico exibiram morfologias heterogêneas, incluindo células do tipo E e do tipo F (Figura 1A). Células do tipo F devem ser expandidas e utilizadas para reprogramação. Após a eletroporação das células do líquido amniótico (AFCs) com plasmídeos episomais Epi5, observa-se uma sequência característica de alterações morfológicas. No dia 0, as AFCs exibem morfologia típica em forma de fuso...

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Discussão

Este protocolo descreve um método não integrador e livre de células alimentadoras para gerar iPSCs humanas aneuploides a partir de células do líquido amniótico utilizando plasmídeos episomais entregues via eletroporação. Várias etapas críticas determinam o sucesso do reprogramamento. Primeiro, a qualidade da população inicial de CLAs é fundamental. Em laboratórios clínicos de citogenética, as CLAs são normalmente expandidas em meio visando acelerar a proliferação celular para análise de cariótipo pré-natal,...

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Divulgações

Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes. A ilustração esquemática na Figura 7A foi gerada usando ferramentas assistidas por IA e posteriormente revisada e modificada pelos autores.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Fundamental da China (número do convênio 2022YFA0913300) e pelo Projeto Clínico Fundamental do Hospital Terceiro da Universidade de Pequim (número do convênio BYSY2022054), concedidos a Jianying Guo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tripsina-EDTA 0,25%	Thermo Fisher (Gibco)	25200056	Dissociação celular para passagem de AFC
Escada de DNA 100 pb Plus II	TransGen Biotech	BM321-01	Escada de DNA
Freezer a -80 °C	Thermo Fisher	FDE60086fv	Armazenamento de longo prazo de DNA plasmidial e amostras
Solução de Dessociação Celular Accutase	StemCell Technologies	07920	Dissociação suave de iPSCs em pequenos agregados
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	338826	Componente do fixador para cariótipo (MeOH:AcOH 3:1)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Eletroforese em gel para produtos de PCR (2%)
Meio AmnioType-1	VivaCell BIOSCIENCES	C3620-0100	Meio de cultura primário para AFC
Contador Automatizado de Células / Hemocitômetro	Countstar	TC20	Contagem de células viáveis com exclusão por azul de tripano
Microscópio de Campo Claro (100x com óleo)	Zeiss	Axiovert5	Análise de metáfase para cariótipo
Centrífuga (rotor de balde oscilante)	Eppendorf	5810R	Pelotização celular a 300 × g
Cabinet de Biossegurança Classe II	ESCO	AC2-4S8-CN	Área de trabalho estéril para todas as operações de cultura celular
Incubadora de CO₂ (umidificada)	Thermo scientific	3131	Manutenção do ambiente a 37 °C e 5% de CO₂
Colcemid (10 µg/mL)	Capricorn scientific	COL-H	Arresto em metáfase para cariótipo (0,1 µg/mL, 2-4 h)
Meio de Congelamento Celular CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07959	Meio de congelamento celular
DAPI	Merck Millipor	10236276001	Coloração nuclear
DMEM (glicose alta)	Thermo Fisher (Gibco)	11965092	Base para meio de cultura de fibroblastos (FC)
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11330032	Tampão para diluição de Matrigel (1:200)
DPBS sem Ca²⁺/Mg²⁺	Thermo Fisher (Gibco)	14190250	Tampão de lavagem
Plasmídeo episomal (pCE-GFP)	Addgene	#41858	Vetor de reprogramação não integrante (controle GFP)
Plasmídeo episomal (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F)	Addgene	#27077	Vetor de reprogramação não integrante (OCT4 + shp53)
Plasmídeo episomal (pCXLE-hSK)	Addgene	#27078	Vetor de reprogramação não integrante (SOX2 + KLF4)
Plasmídeo episomal (pCXLE-hUL)	Addgene	#27080	Vetor de reprogramação não integrante (L-MYC + LIN28)
Soro Bovino Fetal	HyClone	SH30071.03	Suplemento sérico para expansão de AFC (meio FC, 15%)
Microscópio de Fluorescência	Leica	Sp8	Visualização de coloração viva e IF para TRA-1-60/81
Sistema de Eletroforese em Gel	Bio-Rad	164-5056	Análise em gel de agarose de produtos de PCR
Gelatina (0,1%)	Sigma-Aldrich	G1393	Revestimento de recipiente de cultura para adesão de AFC
Kit de Extração de DNA Genômico	TIANGEN	4992199	Isolamento de DNA de qualidade para PCR a partir de iPSCs
Solução de Corante Giemsa	Sigma-Aldrich	GS500	Corante de bandamento G cromossômico (5%)
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	35050061	Suplemento para meio FC
Microscópio Invertido de Contraste de Fase	Zeiss	Axiovert5	Monitoramento diário da cultura e morfologia de colônias
Tanque de Armazenamento em Nitrogênio Líquido	Thermo Scientific	CY50985	Criopreservação de células
Matriz da Membrana Basal Matrigel	Corning	354230	Revestimento de recipiente de cultura para adesão de iPSCs
Metanol (anidro)	Sigma-Aldrich	34860	Componente do fixador para cariótipo (MeOH:AcOH 3:1)
Anticorpo NANOG (Coelho)	Abcam	ab109250	Imunofluorescência; marcador nuclear de pluripotência
Kit de Eletroporação Neon NxT (100 µL)	Thermo Fisher (Invitrogen)	N10025	Eletroporação; contém os tampões R, T, E e ponteiras de 100 µL
Sistema de Eletroporação Neon NxT	Thermo Fisher (Invitrogen)	NEON18S	Entrega de plasmídeos episomais por eletroporação
Aminoácidos Não Essenciais (NEAA, 100x)	Thermo Fisher (Gibco)	11140050	Suplemento para meio FC
Anticorpo OCT4 (Coelho)	Abclonal	A7920	Imunofluorescência; marcador nuclear de pluripotência
PCR Master Mix (alta fidelidade)	TIANGEN	4992920	Verificação da eliminação episomal por PCR
pCXWB-EBNA1	Addgene	#37624	Expressão episomal não replicante de EBNA1
Anticorpo PE anti-humano TRA-1-81	BioLegend	330708	Coloração de pluripotência
Penicilina-Estreptomicina (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122	Suplemento antibiótico (NÃO utilizado após eletroporação)
Reagente Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759	Marcação de F-actina (filamentos de actina)
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P5405	Solução hipotônica para cariótipo (0,075 M)
Sistema de PCR em Tempo Real	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio3	qPCR para verificação de genes marcadores
Butirato de sódio (NaB)	Sigma-Aldrich	B5887	Inibidor de HDAC; 25-100 µM para melhorar a reprogramação
Anticorpo SOX2 (Rato)	R&D Systems	MAB2018	Imunofluorescência; marcador nuclear de pluripotência
Anticorpo SSEA-4	BioLegend	330408	Imunofluorescência; marcador de superfície celular de pluripotência
Stereo microscópio	Nikon	SMZ745	Coleta mecânica de colônias sob ampliação
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	05990	Meio de manutenção de iPSCs sem células de apoio
Anticorpo TRA-1-60	Merck Millipor	MAB4360	Coloração de pluripotência
Trans DNA Marker II	TransGen Biotech	BM411-01	Escada de DNA
Kit de Detecção de Micoplasma TransDetect PCR	TransGen Biotech	FM311-01	Teste de micoplasma
Enzima TrypLE Select (1x)	Thermo Fisher (Gibco)	12563011	Dissociação suave de AFCs aderentes
Tripsina (0,025%)	Sigma-Aldrich	T4799	Pré-tratamento para bandamento G de lâminas (30-60 s)
Ciclador Térmico VeritiPro de 96 poços	Thermo Fisher Scientific	A48141	PCR para verificação da eliminação episomal
Banho-maria (37 °C)	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-S22	Descongelação de meios e reagentes
Y-27632 Dicloridrato (inibidor de ROCK)	Tocris	1254	Melhora a sobrevivência de iPSCs após dissociação (10 µM)

Referências

Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. Development. 1962;10(4):622-640.
Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292(5819):154-156.
Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(12):7634-7638.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel J, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-1147.
Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872.
Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-362.
Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010;7(5):618-630.
Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324(5928):797-801.
Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013;341(6146):651-654.
Guan J, Wang G, Wang J, Zhang Z, Fu Y, et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 2022;605(7909):325-331.
Liuyang S, Wang G, Wang Y, He H, Lyu Y, et al. Highly efficient and rapid generation of human pluripotent stem cells by chemical reprogramming. Cell Stem Cell. 2023;30(4):450-459.e9.
Wang Y, Peng F, Yang Z, Cheng L, Cao J, et al. A rapid chemical reprogramming system to generate human pluripotent stem cells. Nat Chem Biol. 2025;21(7):1030-1038.
Li C, Zhou J, Shi G, Ma Y, Yang Y, et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 2009;18(22):4340-4349.
Slamecka J, Salimova L, McClellan S, van Kelle M, Kehl D, et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 2016;15(2):234-249.
Li Q, Fan Y, Sun X, Yu Y. Generation of induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid cells by reprogramming with two factors in feeder-free conditions. J Reprod Dev. 2013;59(1):72-77.
Crosland BA, Hedges MA, Ryan KS, D'mello RJ, Mccarty OJT, Amniotic fluid: its role in fetal development and beyond. J Perinatol. 2025 Aug;45(8):1163-1170. doi: 10.1038/s41372-025-02313-1. Epub 2025 May 8. PMID: 40341778; PMCID: PMC12354197.
Liu L, et al. Amniotic fluid stem cells in birth defects: integrated roles in disease modeling, prenatal diagnosis, and therapy. Stem Cell Rev Rep. 2026. doi:10.1007/s12015-026-11161-1.
Antonucci I, Provenzano M, Rodrigues M, Pantalone A, Salini V, et al. Amniotic fluid stem cells: a novel source for modeling of human genetic diseases. Int J Mol Sci. 2016;17(4):607.
Guillot PV. Induced pluripotent stem (iPS) cells from human fetal stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016;31:112-120. doi:10.1016/j.bpobgyn.2015.08.007.
Lu HE, Yang YC, Chen SM, Su HL, Huang PC, et al. Modeling neurogenesis impairment in Down syndrome with induced pluripotent stem cells from trisomy 21 amniotic fluid cells. Exp Cell Res. 2013;319(4):498-505.
Lee CC, et al. Establishment of a human trisomy 18 induced pluripotent stem cell line from amniotic fluid cells. Stem Cell Res. 2018;29:115-119.
D'Aurora M, et al. Modeling Klinefelter syndrome using induced pluripotent stem cells reveals impaired germ cell differentiation. Front Cell Dev Biol. 2020;8:567454.
Mali P, Chou BK, Yen J, Ye Z, Zou J, et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 2010;28(4):713-720.
Guo J, Lee Q, Qiu H, Wei Y, Zhu X, et al. Patient-derived neural organoids reveal developmental impairments associated with a novel GJB1 mutation in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis. 2026;220:107299.
Nanbo A, Sugden A, Sugden B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. EMBO J. 2007;26(19):4252-4262.
Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 2011;21(3):518-529.
Okita K, Matsumura Y, Sato Y, Okada A, Morizane A, et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 2011;8(5):409-412.
Cheng L, Wang Y, Yang Z, Cao J, Peng F, et al. p53 safeguards chemical reprogramming of human somatic cells toward pluripotency. Cell. 2026. doi:10.1016/j.cell.2026.03.038.
Akutsu SN, Miyamoto T, Oba D, Tomioka K, Ochiai H, et al. iPSC reprogramming-mediated aneuploidy correction in autosomal trisomy syndromes. PLoS One. 2022;17(3):e0264965.

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Reimpressões e permissões

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iPSCs Humanas Aneuploides Marcadores de Pluripotência Transição Mesenquimal para Epitelial Cariótipo por Bandamento G Depuração de Vetor por PCR Reprogramação Livre de Alimentadores Modelagem de Doenças Biologia Cromossômica

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