Este protocolo fornece um fluxo de trabalho padronizado e reproduzível para avaliar a capacidade proliferativa e a diferenciação osteogênica e odontogênica de células-tronco dentais humanas cultivadas em esqueletos de nanomateriais, utilizando ensaios padronizados (atividade de fosfatase alcalina, imunofluorescência de RANKL [osteogênica] e imunofluorescência de DMP-1 [odontogênica]) e estratégias de normalização para garantir a comparabilidade entre estudos.
Artigo de método
Um Protocolo In Vitro Padronizado para Avaliar a Diferenciação e Proliferação de Células-Tronco da Polpa Dentária Humana em Estruturas de Nanomateriais
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação confiável da diferenciação osteogênica e odontogênica, bem como da proliferação de células-tronco, é fundamental para analisar o desempenho biológico de estratégias regenerativas baseadas em scaffolds. No entanto, a variabilidade em protocolos experimentais, seleção de ensaios e interpretação de dados frequentemente limita a reprodutibilidade e a comparação entre estudos. O protocolo descrito neste artigo apresenta um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível para a avaliação in vitro da diferenciação osteogênica e odontogênica, bem como da capacidade proliferativa, de células-tronco cultivadas em scaffolds de biomateriais. O comprometimento osteogênico é avaliado pela atividade enzimática da fosfatase alcalina (ALP) e pela imunofluorescência do ligante do ativador de receptor do fator nuclear κB (RANKL), enquanto o comprometimento odontogênico é avaliado pela imunofluorescência da proteína da matriz dentinária-1 (DMP-1); ambos os pontos finais proteicos são quantificados utilizando a metodologia padronizada de pontuação H. Parâmetros experimentais críticos, incluindo densidade de semeadura celular, cronogramas de indução, condições de ensaio, estratégias de normalização (incluindo atividade de ALP normalizada por proteína, viabilidade ao MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo) normalizada por célula e pontuação H de imunofluorescência) e abordagens de análise de dados, são detalhados, juntamente com orientações para solução de problemas, a fim de minimizar a variabilidade técnica. A metodologia foi aplicada como uma estrutura padronizada em múltiplos estudos experimentais baseados em scaffolds, demonstrando robustez e reprodutibilidade. Ao fornecer uma estrutura abrangente e validada, este artigo tem como objetivo facilitar a avaliação padronizada das interações entre células-tronco e scaffolds e melhorar a comparabilidade entre estudos regenerativos pré-clínicos.
Introdução
A endodontia regenerativa representa uma mudança de paradigma na odontologia, concentrando-se na restauração da vitalidade da polpa dental por meio do uso de células-tronco, fatores de crescimento e scaffolds1,2. A manutenção da vitalidade da polpa é essencial para a função sensorial e a resposta imune, sendo particularmente importante no tratamento de dentes imaturos com polpas necrosadas, para permitir o desenvolvimento contínuo da raiz2.
As células-tronco da polpa dentária humana (DPSCs) e as células-tronco da papila apical (SCAPs) são candidatas principais para esses procedimentos devido ao seu alto potencial proliferativo, capacidade de autorrenovação, propriedades imunossupressoras e habilidade de se diferenciarem em células semelhantes a odontoblastos sob condições microambientais adequadas, tornando-as candidatas altamente viáveis para aplicações futuras em medicina regenerativa e intervenções terapêuticas baseadas em células3,4,5.
Embora materiais formulados convencionalmente, como cimentos à base de silicato de cálcio, tenham sido investigados, evidências recentes sugerem que a modificação com nanopartículas pode influenciar substancialmente as interações entre biomateriais e células6. Biomateriais com estrutura nanométrica podem proporcionar um microambiente mais biomimético, potencialmente melhorando a adesão de células-tronco e a diferenciação específica por linhagem7. No entanto, o comportamento biológico de materiais inovadores, como o NeoMTA2 na forma nanoparticulada, ainda não é suficientemente compreendido em comparação com materiais estabelecidos, como a nanohidroxiapatita8. Este protocolo atende à necessidade de um framework metodológico padronizado para avaliar com precisão e reprodutibilidade essas interações.
Esta estrutura padronizada é particularmente adequada para estudos que avaliam novos biomateriais ou esqueletos de nanomateriais sob condições biológicas idênticas, nas quais a comparabilidade entre estudos é fundamental. Oferece vantagens em relação a abordagens com ensaios únicos ao integrar triagem de viabilidade (MTT), comprometimento osteogênico inicial (atividade de ALP) e diferenciação em nível proteico (pontuação H por imunofluorescência) dentro de um único fluxo de trabalho. Pesquisadores que utilizam coloração convencional com alizarina vermelha ou ensaios em um único ponto temporal podem se beneficiar da adoção desta estrutura multiparamétrica para reduzir o viés do observador e melhorar a resolução quantitativa. No entanto, este protocolo não é indicado para culturas de organoides tridimensionais, sistemas de co-cultura ou modelos de células-tronco derivadas de animais sem adaptação apropriada. Pesquisadores que necessitem de perfilagem da expressão gênica (por exemplo, RT-qPCR para RUNX2, OCN ou DSPP) devem complementar este fluxo de trabalho com ensaios moleculares, já que o protocolo atual foca exclusivamente em desfechos proteicos e enzimáticos.
Para capturar de forma abrangente a capacidade bifuncional de diferenciação de células-tronco dentárias, este protocolo utiliza dois marcadores complementares de imunofluorescência que refletem diferentes desfechos biológicos. RANKL (ligante do ativador do fator nuclear kappa B) é usado como marcador de comprometimento com a linhagem osteogênica: sua expressão em células semelhantes a osteoblastos reflete a sinalização de mineralização mediada por íons de cálcio e a ativação de células formadoras de osso, o que está de acordo com seu uso em diversos estudos que avaliam SCAPs4,8,9. DMP-1 (proteína da matriz dentinária-1) é usado paralelamente como marcador específico de diferenciação odontogênica/dentinogênica: sua superexpressão em células semelhantes a odontoblastos reflete a indução da formação da matriz dentinária e a reparação de tecidos duros específicos da polpa, sendo particularmente relevante quando a população celular-alvo é a DPSC10. Ao quantificar tanto RANKL quanto DMP-1 dentro do mesmo arcabouço experimental utilizando a metodologia de escore H, este protocolo permite aos pesquisadores distinguir o comprometimento osteogênico do odontogênico — dois desfechos sobrepostos, mas mecanisticamente distintos, das interações entre células-tronco e scaffolds — sem a necessidade de delineamentos experimentais separados.
Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Ético da Faculdade de Odontologia da Universidade Ain Shams, com o número de aprovação FDASU-Rec IM112105. Todos os procedimentos envolvendo tecidos humanos foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki. Os termos de consentimento informado por escrito foram obtidos de todos os participantes antes da extração dentária e da coleta de células-tronco.
1. Preparação e caracterização de nanomateriais
- Sintetize nanomateriais de acordo com requisitos específicos10,11. Para o Nano-NeoMTA2, moa o pó utilizando um moinho de bolas planetário (consulte a Tabela de Materiais) por 10 h a 350 rpm com intervalos de 3 min ligado/desligado. Utilize uma razão de massa bolas/pó de 10:1 com bolas de moagem de zircônia (diâmetro de 5 mm) em um frasco de moagem de zircônia. Verifique o tamanho final das partículas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) (alvo: <200 nm) antes de prosseguir.
CAUTION: O pó de NeoMTA2 pode causar irritação respiratória se inalado. Realize todas as etapas de moagem a seco em capela de exaustão certificada, utilizando respirador N95, óculos de segurança e luvas de nitrila. - Prepare a nanohidroxiapatita utilizando um método de precipitação química úmida8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Prepare 1 L de solução de nitrato de cálcio 0,5 M e 0,6 L de solução de fosfato de amônio 0,3 M, ambas em água deionizada. Adicione gota a gota a solução de nitrato de cálcio à solução de fosfato de amônio a aproximadamente 2–3 mL/min sob agitação contínua a 400 rpm e aqueça até 70 °C, mantendo o pH entre 10–12 pela adição gota a gota de hidróxido de amônio8.
CAUTION: O hidróxido de amônio é corrosivo e libera vapores tóxicos de amônia. Manipule apenas em capela química. Use luvas resistentes a ácidos, óculos de proteção contra respingos e jaleco de laboratório. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente com água por ≥15 min. - Trate o precipitado de apatita resultante hidrotermicamente em autoclave a 140 °C e 0,3 MPa por 2–3 h10. Liofilize o precipitado purificado a -50 °C sob vácuo de ≤0,05 mbar por 48 h8.
- Prepare nanopartículas de vidro bioativo 45S5 utilizando o método sol-gel conforme descrito a seguir.
- Prepare a solução precursora misturando 40 mL de ortossilicato de tetraetila (TEOS) com 10 mL de ácido nítrico 2 M (HNO₃) como catalisador ácido em um béquer de polipropileno sob agitação contínua a 300 rpm à temperatura ambiente.
- Após 30 min, adicione nitrato de cálcio tetraidratado (Ca(NO₃)₂·4H₂O) e nitrato de sódio (NaNO₃) para atingir a composição molar alvo: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O e 6 mol% P₂O₅. Adicione fosfato de trietila (TEP) como precursor de fósforo.
- Agite à temperatura ambiente por 24 h. Envelheça o gel a 60 °C por 24 h em recipiente fechado. Seque a 120 °C por 24 h. Calcine em forno mufla a 650 °C por 3 h (taxa de rampa: 2 °C/min). Triture e confirme a composição de fases por MET e difração de raios X (DRX)4,9.
CAUTION: TEOS e etanol são inflamáveis. O HNO₃ é corrosivo. Realize todos os procedimentos em capela de exaustão, longe de fontes de ignição.
- Caracterize todas as nanopartículas preparadas utilizando MET de alta resolução e DRX para confirmar o tamanho das partículas e a cristalinidade8. Registre o tamanho médio das partículas, índice de politropicidade (PDI) e potencial zeta utilizando espalhamento dinâmico de luz (DLS) para confirmar a estabilidade coloidal. Aceite lotes com tamanho médio de partícula <200 nm e potencial zeta <−15 mV ou >+15 mV.
2. Coleta e cultivo de células-tronco
- Coletar DPSCs ou SCAPs de terceiros molares mandibulares impactados recém-extraídos após obtenção de consentimento informado por escrito10. Processar os dentes extraídos dentro de 2 h após a extração e transportá-los em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 4 °C.
NOTA: Os critérios de elegibilidade do doador incluem adultos sistemicamente saudáveis com idade entre 18 e 35 anos, não fumantes, sem histórico de uso de antibióticos nos últimos 3 meses, sem doença periodontal e sem evidência radiográfica de patologia periapical. - Isolar as células utilizando o método de digestão enzimática9. Picar o tecido dental em fragmentos de 1–2 mm e digerir com uma solução de colagenase tipo I na concentração de 3 mg/mL em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sem soro durante 1 h a 37 °C com agitação contínua a 60 rpm em plataforma oscilante8. Neutralizar com meio de cultura completo e filtrar através de um filtro celular de 70 µm.
CAUTELA: A colagenase tipo I pode conter endotoxinas. Utilize apenas colagenase de grau para cultura de tecidos e testada para endotoxinas. Use luvas e evite inalação. - Plaque a suspensão de células simples em frascos de 75 cm2 com uma densidade inicial de 1 × 104 células/cm2 em meio de cultura completo composto por DMEM, 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (Tabela de Materiais)8.
- Incubar os frascos a 37 °C em uma atmosfera com 5% de CO₂8. Monitorar diariamente o crescimento e contaminação utilizando microscópio invertido de contraste de fase10. Substituir o meio de cultura a cada 48–72 h. Descartar qualquer frasco que apresente sinais de contaminação (turbidez, mudança de cor, morfologia celular irregular).
- Coletar as células após a terceira passagem, quando atingirem cerca de 70–80% de confluência8. Para a repicagem, aspirar o meio, lavar com PBS e destacar as células utilizando tripsina-EDTA 0,25% a 37 °C por 3–5 min. Neutralizar com meio de cultura completo, centrifugar a 300 x g por 5 min e replacar a 1 × 104 células/cm2. Utilizar apenas células entre a terceira e a sexta passagem para manter a estabilidade fenotípica.
3. Caracterização de células-tronco
- Avalie o imunofenótipo das células isoladas utilizando citometria de fluxo8,10. Caracterize as células na terceira passagem. Inclua um controle negativo não corado e controles de compensação monocorados para cada fluorocromo utilizado.
- Ajuste a contagem celular para 106/mL em PBS. Centrifugue a 800 x g durante 10 min e lave o pellet duas vezes com PBS8,10.
- Cole as células com anticorpos anti-humanos para marcadores mesenquimais (CD44, CD43) e marcadores hematopoéticos (CD45) nas diluições recomendadas pelo fabricante (tipicamente 1:100 em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA)) (Tabela de Materiais)8,10. Incube a 4 °C por 45 min no escuro. Lave duas vezes com PBS e re-suspenda em 300 µL de PBS para aquisição.
- Analise as células utilizando software de análise de citometria de fluxo (Tabela de Materiais) para avaliar o imunofenótipo (expressão de CD44 e CD73, com CD45 como marcador de exclusão hematopoética). Aplique o sequenciamento de seleção: (a) seleção por dispersão (FSC-A vs. SSC-A); (b) exclusão de dupletos (FSC-H vs. FSC-A); (c) seleções específicas para cada fluorocromo definidas com base nos controles não corados. Relate a porcentagem de células positivas para cada marcador juntamente com a estratégia de seleção.
4. Determinação da concentração segura do material (concentração efetiva máxima, EC₅₀)
- Determine a CE₅₀ utilizando um software de análise estatística (GraphPad Prism 9). Ajuste os dados de dose-resposta a uma curva sigmoide de regressão não linear (modelo logístico de quatro parâmetros: Y = Inferior + (Superior − Inferior) / (1 + 10^((LogCE₅₀ − X) × Inclinação de Hill))). Informe o valor de CE₅₀ em µg/mL com intervalo de confiança de 95%8.
- Prepare diluições seriadas dos nanomateriais (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 e 1,56 µg/mL) em 1 mL de PBS. Agite a suspensão estoque por 30 s em vórtex, depois sonique (sonicador de sonda, 40 W, 30 s ligado/10 s desligado por 3 ciclos a 4 °C) para garantir uma suspensão homogênea. Esterilize por UV em uma cabine de segurança biológica sob luz UV por 30 min.
- Cultive células-tronco numa densidade de 1 × 104 células/bem em placas de 96 poços por 72 h com as diferentes concentrações e conte as células viáveis utilizando azul de tripano para calcular a CE₅₀ usando o modelo logístico de quatro parâmetros descrito no passo 4.1.
- Realize os experimentos em triplicata (n = 3 poços independentes por concentração) com pelo menos três réplicas biológicas. Relate os valores de CE₅₀ como média ± DP e calcule o coeficiente de variação (CV%) entre as réplicas (CV aceitável <15%).
5. Avaliação da diferenciação osteogênica e odontogênica
OBSERVAÇÃO: Esta seção avalia duas vias de diferenciação complementares utilizando ensaios de imunofluorescência paralelos a partir da mesma preparação celular. O RANKL (etapa 5.5) serve como marcador osteogênico; a DMP-1 (etapa 5.6) serve como marcador odontogênico. Ambos são quantificados pela mesma metodologia de escore H (etapa 5.8). Realize ambos os ensaios em lamínulas separadas preparadas simultaneamente.
- Semente as células-tronco em placas de seis poços com uma densidade de 4,5 × 105 células/poço. Deixe as células aderirem por 24 h em meio de cultura completo antes de iniciar a diferenciação.
- Atribua as amostras a quatro grupos: controle negativo (DMEM isolado), controle positivo (meio de diferenciação osteogênica/odontogênica) e grupos experimentais (nanomateriais na CE₅₀-concentrações seguras derivadas).
- Prepare o meio de diferenciação osteogênica suplementando o DMEM com 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM β-glicerofosfato, 50 µg/mL ácido ascórbico (L-ascorbato-2-fosfato) e 100 nM de dexametasona. Substitua o meio a cada 48 h. Incube durante 72 h a 37 °C e 5% CO₂.
- Medição da atividade de ALP
- Semeie as células em placas de cultura de 24 poços a 1 × 104 células/poço e incubar a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ por 72 h.
- Aspire o meio de cultura, lave os poços com PBS e lise as células adicionando 200 µL de tampão de lise por poço (0,1% de Triton X-100 em PBS) e incubando em 4 °C por 10 min com agitação suave.
- Coletar o lisado e centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C; use o sobrenadante para todas as medições subsequentes de FAL. Transfira 50 µL de cada amostra-teste e 100 µL de padrões de p-nitrofenol em uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicione tampão substrato AMP (Tabela de Materiais) para iniciar a reação catalítica.
- Após uma incubação secundária de 30 min em 37 °C, interromper a reação adicionando 50 µL de 0,5 M de NaOH por poço. Meça imediatamente a absorbância a 405 nm utilizando um leitor de microplacas com detecção de absorbância (Tabela de Materiais).
- Gere uma curva padrão de absorbância versus concentração de p-nitrofenol e calcule a atividade de FAL em U/L.
- Determine o teor total de proteína do mesmo lisado celular utilizando um ensaio de proteína Bradford ou BCA. Normalize a atividade de fosfatase alcalina (ALP) em relação ao teor total de proteína e apresente os resultados finais como U/mg de proteína.
- Marcador osteogênico (RANKL)
- Avalie a expressão da proteína RANKL utilizando imunofluorescência. Primeiro, prepare controles de isotipo e apenas secundário: (a) substitua o anticorpo primário por IgG de coelho com isotipo correspondente na mesma concentração e (b) omita completamente o anticorpo primário em poços separados.
- Fixe as células com formaldeído a 4% recém-preparado em PBS durante 15 min à temperatura ambiente. Lave três vezes com PBS (5 min cada).
- Permeabilizar com Triton X-100 0,1% em PBS durante 10 min, depois bloquear com soro de cabra normal 5% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente para reduzir a ligação inespecífica. Sem lavar, adicionar diretamente o anticorpo primário Coelho Anti-RANKL na diluição de 1:200 no tampão de bloqueio (Tabela de Materiais) e incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave três vezes com PBS, depois incube com anticorpo secundário conjugado a fluoróforo Anti-Coelho IgG de cabra na diluição de 1:500 em tampão de bloqueio (Tabela de Materiais) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro8Após a incubação com o anticorpo secundário, lavar três vezes com PBS (5 min cada) e prosseguir diretamente para a etapa 5.7 para montagem.
ATENÇÃO: O formaldeído (solução a 4%) é um fixador tóxico e provável carcinogênico. Prepare e utilize apenas em capela química certificada. Use luvas de nitrila, óculos de proteção contra respingos e jaleco de laboratório. Descarte os resíduos conforme as orientações institucionais.
OBSERVAÇÃO. A identidade celular é confirmada por microscopia de contraste de fase e critérios morfológicos antes da pontuação por imunofluorescência (ver passo 5.10).
- Marcador odontogênico (DMP-1)
OBSERVAÇÃO: avaliar a expressão proteica de DMP-1 (proteína da matriz dentinária-1) por imunofluorescência em paralelo com o passo 5.5 para avaliar o comprometimento odontogênico.- Usando um conjunto separado de lamínulas da mesma preparação celular, repita todos os passos de fixação, permeabilização e bloqueio conforme descrito no passo 5.5, incluindo os controles de isotipo e somente secundário.
- Sem lavar após o bloqueio, adicione diretamente um anticorpo primário anti-DMP-1 (ver Tabela de Materiais) na diluição de 1:200 em tampão de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C. Lave três vezes com PBS, depois incube com o anticorpo secundário conjugado ao fluoróforo apropriado (utilize um fluorocromo espectralmente distinto daquele usado para RANKL; veja Tabela de Materiais) em diluição 1:500 no tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
- Adquira imagens de fluorescência em magnificação de 10x para avaliar a expressão de DMP-1 como indicador da diferenciação em odontoblastos semelhantes10Após a incubação com o anticorpo secundário, lavar três vezes com PBS (5 min cada) e prosseguir diretamente para o passo 5.7 para montagem.
- Monte as lâminas com meio de montagem antidesvanecimento (consulte Tabela de Materiais) e deixe secar durante a noite à temperatura ambiente. Monte separadamente as lâminas coradas para RANKL e DMP-1 e rotule-as claramente (por exemplo, "Grupo RANKL 1" e "Grupo DMP-1 1") antes da aquisição de imagens.
- Examine imediatamente as lâminas por microscopia de fluorescência ou armazene em 4 °C protegido da luz. Quantifique a expressão proteica avaliando a intensidade da coloração utilizando um sistema de pontuação padronizado de quatro níveis: 0 (sem coloração), 1+ (fraca), 2+ (moderada) e 3+ (forte).
- Adquira imagens utilizando configurações idênticas do microscópio (tempo de exposição, potência do laser e ganho) em todos os grupos experimentais. Aplique configurações idênticas de forma independente para cada marcador (RANKL e DMP-1) para garantir consistência intra-marcador entre os grupos.
- Avalie um mínimo de cinco campos aleatórios de alta potência (objetiva de x20) por poço. Dois observadores independentes e cegos devem realizar a avaliação e informar o coeficiente kappa de Cohen (kappa aceitável ≥ 0,7).
- Calcule o escore H utilizando a fórmula: escore H = Σ(i × Pi), onde i = intensidade da coloração (1, 2 ou 3) e Pi = porcentagem de células (0–100%) em cada nível de intensidade.
OBSERVAÇÃO: o escore H varia de 0 a 30010. - Normalize os dados do escore H pela contagem total de células por campo, determinada pela contagem manual de todas as células visíveis em cada campo sob microscopia de contraste de fase antes da imagem de imunofluorescência, para compensar as diferenças na densidade celular entre poços.
- Calcule e relate as pontuações H separadamente para RANKL (parâmetro osteogênico) e DMP-1 (parâmetro odontogênico) para permitir comparação direta entre as duas vias de diferenciação.
6. Avaliação da proliferação e viabilidade
- Realize a contagem celular utilizando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano para distinguir células viáveis das não viáveis. Calcule o número total de células viáveis por mL de cultura. Conte pelo menos 100 células por amostra para garantir confiabilidade estatística.
- Realize o ensaio de MTT para medir a atividade metabólica mitocondrial8,10.
- Adicione a solução de MTT numa concentração final de 0,5 mg/mL (Tabela de Materiais) às células e incube por 4 h a 37 °C. Remova a solução, adicione um agente solubilizante (por exemplo, SDS-HCl; veja a Tabela de Materiais) e meça a densidade óptica a 570 nm utilizando um espectrofotômetro (comprimento de onda de referência: 630–650 nm).
- Calcule a viabilidade celular como: Viabilidade (%) = (Absorbância das células tratadas / Absorbância das células controle não tratadas) × 100. Valores >100% indicam estimulação proliferativa em relação ao controle negativo. Inclua uma poça em branco para correção do fundo.
- Normalize os resultados em relação ao número de células utilizando uma contagem paralela com azul de tripano. Realize todos os ensaios em triplicata (n = 3 poças/grupo, ≥3 réplicas biológicas).
CAUTION: O tampão de solubilização SDS-HCl é corrosivo. Manipule com EPI apropriado. Descarte resíduos contendo formazano de acordo com as regulamentações institucionais.
Resultados
Todos os resultados apresentados aqui foram adaptados de estudos complementares4,8,9,10 realizados pelo mesmo grupo de pesquisa sob uma aprovação ética institucional unificada (FDASU-Rec IM112105).
Caracterização de nanomateriais e isolamento de células-tronco
O fluxo de trabalho padronizado fornece inicialmente confirmação quantificável das propriedades do andróide e dos fenótipos das células-tronco. Após a síntese, os nanomateriais preparados são validados por meio de MET de alta resolução e DRX para confirmar o tamanho das partículas e a cristalinidade (Figura 1A,B). Paralelamente, DPSCs ou SCAPs isoladas por digestão enzimática mostram adesão e proliferação robustas em meio de cultura completo. A análise por citometria de fluxo valida o imunofenótipo das células colhidas na passagem 3, demonstrando alta expressão de marcadores mesenquimais (CD44, CD43) e confirmando sua origem não hematopoética pela ausência de CD45 (Figura 1C).
Estabelecimento da concentração segura de materiais e proliferação
Por meio do cultivo de células-tronco em diluições seriadas dos nanomateriais (50–1.56 µg/mL) durante 72 h, a regressão logística de quatro parâmetros das contagens de células viáveis fornece uma EC confiável₅₀ valor (modelo de dose-resposta sigmoidal não linear, conforme descrito na etapa 4.1). Valores de viabilidade MTT superiores a 100% indicam estimulação proliferativa em relação ao controle não tratado, já que os valores são normalizados em relação ao grupo controle negativo (células não tratadas definidas como 100%). Um valor de ~196% para o Nano-NeoMTA2, por exemplo, reflete estimulação bioativa da atividade mitocondrial e não >100% de sobrevivência celular absoluta9.
Em diversos estudos que aplicaram este protocolo padronizado, foram determinados valores de CE₅₀ de 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 e 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 utilizando o modelo logístico de quatro parâmetros (passo 4.1), confirmando concentrações seguras para uso nos ensaios de diferenciação descritos neste protocolo. Esses valores foram incorporados à Tabela 1 como métricas representativas de validação.
Quantificação da diferenciação osteogênica e odontogênica (avaliação por duplo marcador)
A abordagem de imunofluorescência dupla fornece duas medidas de resultado distintas e complementares a partir da mesma preparação celular. Para a avaliação osteogênica, os escores H de RANKL diferenciaram significativamente os quatro grupos: as células cultivadas com Nano-NeoMTA2 apresentaram expressão de RANKL substancialmente maior do que o controle negativo, compatível com ativação osteoblástica aumentadaFigura 2A, Tabela 1)8,9Para a avaliação odontogênica, os escores H de DMP-1 revelaram uma diferenciação robusta semelhante à de odontoblastos em DPSCs cultivadas com Nano-NeoMTA2, com escores H significativamente mais altos do que os observados nos grupos de nanohidroxiapatita e controle negativo, confirmando o comprometimento preferencial com a linhagem dentinogênica. (Figura 3A, Tabela 1)10A identidade celular foi confirmada por microscopia de contraste de fase e critérios morfológicos característicos (morfologia fusiforme ou poligonal) antes da análise.
A atividade de ALP foi distinguida espectrofotometricamente entre todos os grupos a 405 nm, servindo como marcador enzimático precoce do comprometimento osteogênico e odontogênico (Tabela 1). A análise espectrofotométrica de MTT confirmou que todos os nanomateriais, nas concentrações seguras derivadas da CE₅₀, mantiveram alta viabilidade celular em relação ao controle negativo, consistente com os valores representativos apresentados (Tabela 1).
Resultados experimentais subótimos e malsucedidos
Os resultados subótimos são resumidos na Tabela 2. Baixa viabilidade celular no ensaio de MTT geralmente indica que a concentração do nanomaterial excedeu o limiar de CE₅₀ ou que a esterilização por UV foi insuficiente. A absorvância inconsistente de ALP (CV > 20%) geralmente indica densidade de semeadura desigual ou homogeneização incompleta do tampão de lise. Sinal fraco ou ausente de imunofluorescência para RANKL ou DMP-1 ocorre mais comumente devido à inativação do anticorpo, permeabilização insuficiente ou fixação excessiva; o uso de formaldeído a 4% fresco e alíquotas de anticorpos de uso único resolve esse problema. A reatividade cruzada entre os canais de RANKL e DMP-1 deve ser excluída mediante análise das imagens de controle com apenas o anticorpo secundário antes da quantificação.
Figura 1: Caracterização padronizada de nanomateriais e validação do fenótipo de células-tronco. (A) Espectros de DRX confirmando a fase cristalina e a integridade estrutural das nanopartículas. (B) Imagens representativas de MET demonstrando o tamanho nanométrico das partículas, morfologia e dispersão homogênea dos biomateriais sintetizados; comparando NeoMTA2 e hidroxiapatita. As imagens em baixa ampliação são mostradas para (a) NeoMTA2 e (b) hidroxiapatita, enquanto as imagens em alta ampliação são detalhadas em (c) NeoMTA2 e (d) hidroxiapatita. As barras de escala estão indicadas no canto inferior esquerdo. (C) Protocolo de seleção por citometria de fluxo para caracterização de células-tronco. Gráficos de dispersão multiparamétricos representativos mostram células coradas para CD44, CD73 (rotuladas como CD43 PE nos gráficos originais) e CD45. As subpopulações CD44+ e CD73+ foram selecionadas com base na expressão de CD45. O painel A e C foram adaptados de Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) e o painel B foi adaptado de Habib et al.10 (CC BY-NC). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2Avaliação quantitativa e semi-quantitativa da diferenciação osteogênica por imunofluorescência de RANKL. (A) Micrografias imunofluorescentes de alta resolução representativas mostrando a expressão dos marcadores proteicos osteogênicos essenciais RANKL no microambiente do andróide 2D. (a) Células controle negativo formam colônias pequenas com expressão de RANKL fraca e membranar, enquanto (b) as células controle positivo exibem aumento no número de colônias semelhantes a osteoblastos, com expressão densa e homogênea. Células-tronco tratadas com (c) NHAP, (d) NHAP/quitosana e (e) nanopartículas de vidro bioativo apresentam diferenciação avançada, caracterizada por colônias grandes e fusionadas, semelhantes a osteoblastos, com intensa e homogênea localização de RANKL tanto na membrana quanto no núcleo; adaptado de: Elshahat et al.4. (B) Gráficos de barras representando a quantificação do escore H da expressão de RANKL ao longo dos diferentes estudos. Aplicação da metodologia do escore H para normalização de dados de imunofluorescência. Ao integrar matematicamente a intensidade visual da coloração (classificada de 0 a 3) com o percentual de células positivamente coradas, o escore H transforma a microscopia qualitativa em uma métrica robusta e semi-quantitativa, reduzindo significativamente o viés subjetivo do observador. (a) Comparação de Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) e nanopartículas de vidro bioativo (NBG; 500 µg/mL) em relação ao controle positivo de meio osteogênico (OM-PC) e ao controle negativo de DMEM (DMEM-NC). O NBG induziu o perfil de expressão mais elevado (p &< 0,001). Adaptado de Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Avaliação da nanohidroxiapatita (NHAP; 10µg/mL), compósito NHAP/Quitosana (10 µg/mL) e NBG (500 µg/mL) em relação aos controles, com NHAP/Quitosana apresentando escores H máximos. Adaptado de Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Avaliação do Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) versus NHAP (10 µg/mL) e controles, demonstrando expressão significativamente elevada de RANKL no Nano-NeoMT adaptado de: Zaki et al.8. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens Representativas de Imunofluorescência e Análise do Escore H. (AAvaliação por microscopia de imunofluorescência da expressão da Proteína da Matriz Dentina (DMP-1) entre grupos experimentais; a fluorescência verde indica coloração positiva para anticorpos policlonais anti-DMP-1. (a) Controle Negativo: células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs) em meio indiferenciado (UM) exibem pequenos agregados celulares com expressão tênue e uniforme de DMP-1 (+). (b) Controle Positivo: hDPSCs em meio odontogênico (OM) demonstram expansão de colônias marcadas por sinais densos e homogêneos de DMP-1 (++). (c) Nanohidroxiapatita (10 μg/mL) e (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): As hDPSCs diferenciadas formam grandes colônias fusionadas de células semelhantes a odontoblastos, exibindo expressão intensa e homogênea de DMP-1 localizada nas membranas e núcleos. Aumento: ×10. Círculos amarelos indicam colônias semelhantes a odontoblastos; setas amarelas indicam expressão intensa de DMP-1. (B) Gráfico de barras representando a quantificação do escore H da expressão da Proteína da Matriz Dentina nos grupos do estudo. Foi observada uma diferença altamente significativa entre os grupos de avaliação, com o escore H mais alto observado no grupo Nano-NeoMTA2 (169,33) ± 4,04), seguido de nanohidroxiapatita (140,33 ± 2,52) e o controle negativo (15,33 ± 1,53). Painéis A e B adaptados de Habib et al.10 (CC BY-NC). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Ensaio / Parâmetro | Nanomaterial / Tipo Celular | Valor Representativo (Média ± DP) | Normalização | Fonte |
| Viabilidade Celular (Ensaio MTT) | ||||
| Viabilidade MTT | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1,56 ± 0,24) | Normalizado em relação ao controle não tratado (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilidade MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99,97% | Normalizado em relação ao controle não tratado (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| Viabilidade MTT — Controle Positivo | OM-PC / SCAPs | 113,46% (OD = 0,93 ± 0,03) | Normalizado em relação ao controle não tratado (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilidade MTT — Controle Negativo | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0,82 ± 0,02) — Linha de base de referência | DMEM-NC definido como referência de 100% para todos os grupos | Abdelaziz et al.⁹ |
| Atividade de Fosfatase Alcalina (ALP) | ||||
| Atividade ALP | Nanopartículas de Vidro Bioativo (500 µg/mL) / SCAPs | 69,86 ± 0,98 U/L | Normalizado em relação ao teor total de proteína (U/mg proteína, ensaio de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Atividade ALP — Controle Positivo | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Normalizado em relação ao teor total de proteína (U/mg proteína, ensaio de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Atividade ALP — Controle Negativo | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Normalizado em relação ao teor total de proteína (U/mg proteína, ensaio de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Concentração Segura do Material (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7,9 µg/mL | Modelo logístico de quatro parâmetros (resposta dose-resposta sigmoidal não linear, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9,92 µg/mL | Modelo logístico de quatro parâmetros (resposta dose-resposta sigmoidal não linear, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| Pontuação H — Expressão da Proteína RANKL (Marcador Osteogênico) | ||||
| Pontuação H (RANKL) Marcador osteogênico | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Pontuação H (RANKL) Marcador osteogênico | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Pontuação H (RANKL) Controle Positivo | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Pontuação H (RANKL) Controle Negativo | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Pontuação H — Expressão da Proteína DMP-1 (Marcador Odontogênico) | ||||
| Pontuação H (DMP-1) Marcador odontogênico | Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs | 169,33 ± 4,04 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Pontuação H (DMP-1) Marcador odontogênico | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140,33 ± 2,52 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Pontuação H (DMP-1) Controle Negativo | DMEM-NC / DPSCs | 15,33 ± 1,53 (escala 0–300) | Número total de células visíveis por campo (microscopia de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Pontuação H (DMP-1) Marcador odontogênico [Controle Positivo -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 pontos na pontuação H (escala 0–300) | Número total de células por campo (microscopia de contraste de fase) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| Pontuação H = Σ(i × Pi): i = intensidade da coloração (1, 2 ou 3); Pi = porcentagem de células em cada nível de intensidade (0–100%); intervalo 0–300. Viabilidade MTT expressa em relação ao DMEM-NC definido como referência de 100%. Atividade ALP expressa em U/L a partir da desfosforilação enzimática do fosfato de p-nitrofenil; posteriormente normalizada em relação ao teor total de proteína (U/mg proteína). OM-PC = meio de indução osteogênica/odontogênica (controle positivo). DMEM-NC = Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (controle negativo). | ||||
Tabela 1: Resultados representativos do fluxo de trabalho padronizado de avaliação in vitro. Resultados quantitativos representativos de estudos previamente publicados que demonstram a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina e análises de imunofluorescência realizadas utilizando o protocolo padronizado.
| Problema observado | Causa potencial | Solução recomendada |
| Baixa viabilidade celular no ensaio de MTT (OD < controle não tratado | A concentração do nanomaterial excede a CE₅₀, ou esterilização UV insuficiente, ou dispersão inadequada de nanopartículas. | Executar novamente EC₅₀ determinação (Seção 4). Prolongue a esterilização por UV por 30 min. Verifique a suspensão homogênea de nanopartículas por sonicação com sonda (40 W, 30 s ligado/desligado, 3 ciclos em) 4 °C) imediatamente antes do uso. |
| CV de viabilidade MTT >15% entre as réplicas | Erro de pipetagem, semeadura irregular de células ou tempo/temperatura variável de incubação com MTT. | Utilize uma pipeta multicanal calibrada para todas as adições. Confirme a densidade de semeadura por meio de hemocitômetro antes do plaqueamento. Mantenha uma incubação rigorosa de 4 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO₂ incubadora. Inclua um poço em branco para correção do fundo. |
| Leituras inconsistentes de absorbância de FAL (CV >20% entre poços) | Densidade desigual de semeadura celular, lise celular incompleta ou inconsistência na pipetagem durante a adição do substrato. | Aderir estritamente a 1 × 10⁴ células/poço em placas de 24 poços. Vortexar o tampão de lise completamente antes do uso. Manter incubação de lise consistente (10 min, 4 °C, agitação suave). Verifique a absorbância de fundo com uma poça em branco sem células. |
| Imunofluorescência fraca ou ausente de RANKL sinal (etapa 5.4a) | Inativação de anticorpos devido ao armazenamento inadequado, fixação excessiva reduzindo a acessibilidade do epítopo ou permeabilização insuficiente. | Prepare formaldeído 4% fresco imediatamente antes do uso. Adicione permeabilização com Triton X-100 0,1% (10 min, temperatura ambiente) antes do bloqueio. Titre a diluição do anticorpo primário (inicie em 1:200). Inclua uma seção de tecido controle positivo. Aliquote o estoque de anticorpo para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. |
| Imunofluorescência fraca ou ausente de DMP-1 sinal (etapa 5.4b) | Inativação de anticorpos devido a ciclos de congelamento-descongelamento, diluição subótima do anticorpo primário ou espécie hospedeira incompatível do anticorpo secundário. | Aliquotar o anticorpo anti-DMP-1 para evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Realizar titulação com diluição inicial de 1:200. Confirmar a compatibilidade entre as espécies do hospedeiro do anticorpo primário (DMP-1) e do anticorpo secundário. Incluir uma seção de tecido dentinário como controle positivo para DMP-1. |
| Reatividade cruzada entre RANKL e DMP-1 canais de fluorescência | Sobreposição espectral nos espectros de emissão se o mesmo fluoróforo for usado para ambos os anticorpos secundários, ou separação inadequada de canais no microscópio de fluorescência. | Utilize fluorocromos de anticorpos secundários com espectros distintos para RANKL e DMP-1 (por exemplo, Alexa Fluor 488 para um marcador, Alexa Fluor 594 para o outro). Revise as imagens de controle com apenas o anticorpo secundário para cada canal separadamente antes da análise. Adquira as imagens de RANKL e DMP-1 separadamente utilizando o modo de aquisição sequencial. |
| Alto fundo inespecífico em coloração por imunofluorescência | Bloqueio protéico insuficiente, concentração do anticorpo secundário muito alta ou etapas de lavagem inadequadas entre as incubações. | Prolongue a incubação do bloqueio por 2 h em temperatura ambiente. Aumente a diluição do anticorpo secundário para 1:1000. Confirme a especificidade com o controle somente com anticorpo secundário (sem anticorpo primário). Certifique-se de que todas as lavagens com PBS sejam completas (3 × 5 min cada). |
| H-score da variabilidade entre observadores (Kappa de Cohen <0,7, etapa 5,6) | Aplicação inconsistente da escala de intensidade de coloração em quatro níveis (0, 1+, 2+, 3+) entre observadores, ou calibração insuficiente antes das sessões de avaliação. | Realize uma sessão conjunta de calibração utilizando imagens de treinamento representativas antes da pontuação formal. Utilize configurações idênticas de exibição das imagens (brilho, contraste) para todos os observadores. Pontue um mínimo de cinco campos de alta potência por poço e calcule o kappa a cada 10 campos para monitorar desvios. |
| EC₅₀ a curva não converge ou o ajuste é ruim (passo 4.1) | Número insuficiente de pontos de dados, faixa de concentração estreita ou suspensão homogênea não obtida antes da semeadura. | Amplie a faixa de diluição seriada para incluir pelo menos 6 concentrações abrangendo 50–1.56 µg/mL. Certifique-se de que a sonicação com sonda seja realizada imediatamente antes de cada etapa de diluição. Repita com pelo menos 3 réplicas biológicas independentes. Confirme o CV <15% entre as réplicas. |
Tabela 2: Parâmetros críticos e guia de solução de problemas. Problemas técnicos comuns encontrados durante o protocolo, suas causas potenciais e soluções recomendadas para melhorar a reprodutibilidade experimental e a qualidade dos dados. Abreviações: CV = coeficiente de variação; RT = temperatura ambiente.
Discussão
Os passos críticos neste protocolo incluem a determinação precisa da CE₅₀, a suspensão homogênea de nanomateriais e a normalização dos resultados dos ensaios biológicos. O cálculo da CE₅₀ por meio de regressão não linear (modelo logístico de quatro parâmetros) fornece uma estimativa de resposta à dose mais rigorosa do que a interpolação linear e deve ser preferido quando houver pontos de dados suficientes disponíveis13,14. Garantir uma suspensão homogênea de nanopartículas por sonicação com sonda imediatamente antes da exposição celular é essencial; suspensões mal dispersas geram curvas de dose-resposta não confiáveis e comprometem as estimativas da CE₅₀. Para materiais novos, como o NeoMTA2, a moagem em escala nanométrica é um passo inicial essencial, pois o tamanho das partículas em escala macroscópica altera substancialmente a reatividade da superfície e a bioatividade subsequente13,14. Se for observada baixa viabilidade celular em concentrações esperadas como seguras, os pesquisadores devem verificar o protocolo de esterilização por UV e reavaliar os procedimentos de moagem e dispersão antes de repetir o ensaio de CE₅₀10.
Um ponto fundamental deste protocolo é o uso de dois marcadores complementares de imunofluorescência que refletem vias de diferenciação distintas, porém sobrepostas. A superexpressão de RANKL em células semelhantes a osteoblastos reflete a sinalização osteogênica mediada por íons de cálcio e é proporcional ao número de células osteogênicas8,9, enquanto a expressão de DMP-1 atua como um indicador específico da diferenciação em células semelhantes a odontoblastos e da atividade dentinogênica, tornando-se particularmente relevante quando a população celular-alvo é constituída por DPSCs10. Ao quantificar ambos os marcadores utilizando a metodologia de pontuação H, este protocolo permite aos pesquisadores distinguir o comprometimento com linhagem osteogênica daquele com linhagem odontogênica dentro de um único sistema padronizado de ensaio, representando um avanço em relação às abordagens com marcador único, que não conseguem diferenciar o comprometimento com formação óssea daquele com formação dentinária. Ambas as pontuações H para RANKL e DMP-1 devem ser relatadas em todas as publicações que utilizem este protocolo, a fim de manter a comparabilidade entre os estudos. Os pesquisadores devem usar fluorocromos espectralmente distintos para os dois anticorpos secundários, a fim de evitar sobreposição de canais, e devem analisar as imagens dos controles com apenas o anticorpo secundário antes da pontuação.
Várias modificações metodológicas podem ser necessárias ao adaptar este protocolo para biomateriais ou modelos celulares alternativos. Para scaffolds altamente opacos ou coloridos, a interferência na absorbância do MTT em 570 nm pode exigir um ensaio de viabilidade alternativo, como o CellTiter-Glo (luminescência) ou o PrestoBlue (redução de resazurina), que são menos suscetíveis à interferência óptica dos materiais do scaffold. Pesquisadores que utilizam SCAPs em vez de DPSCs devem observar que as SCAPs tendem a apresentar expressão mais forte de RANKL, refletindo seu maior comprometimento osteogênico, enquanto as DPSCs demonstram expressão mais acentuada de DMP-1, refletindo sua maior tendência à linhagem odontogênica/dentinogênica. O número de passagens é uma variável crítica: deve-se evitar o uso de células além da passagem 6, pois podem exibir capacidade de diferenciação reduzida e alteração na expressão de marcadores de superfície.
As limitações dessa estrutura metodológica incluem uma janela de avaliação de curto prazo (72 h), que pode não captar eventos de mineralização em fase tardia, os quais tipicamente requerem de 14 a 21 dias. A ausência de validação in vivo representa uma lacuna translacional significativa. O uso do escore H introduz variabilidade potencial entre observadores; a confiabilidade entre observadores (kappa de Cohen) relatada na Seção 5.10 deve ser incluída em todos os resultados publicados.
Esta estrutura oferece diversas vantagens em comparação com as abordagens convencionais de ponto final único. Os ensaios osteogênicos convencionais geralmente dependem exclusivamente da coloração com alizarina vermelha ou da atividade de fosfatase alcalina em um único ponto temporal. A integração do ensaio de viabilidade MTT, da quantificação da atividade de fosfatase alcalina e da pontuação H por imunofluorescência dupla de RANKL + DMP-1 em um único fluxo de trabalho fornece uma saída multiparamétrica que permite comparação estatística direta entre diferentes tipos de scaffolds sob condições experimentais idênticas. As estratégias de normalização descritas — atividade de fosfatase alcalina expressa por mg de proteína, resultados do MTT como porcentagem do controle não tratado e pontuação H normalizada pelo número total de células por campo — eliminam fatores de confusão decorrentes da variabilidade entre poços4,8.
Estudos futuros podem aplicar esta metodologia para avaliar os efeitos de biomateriais sobre marcadores inflamatórios, respostas angiogênicas ou modelos alternativos de células-tronco. A sequência do ensaio também é adaptável a formatos de scaffolds tridimensionais. Em última análise, a adoção dessa estrutura padronizada em laboratórios independentes facilitará comparações meta-analíticas significativas do desempenho de scaffolds em pesquisas pré-clínicas de odontologia regenerativa15.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de 24 poços | Corning | 3527 | Utilizadas para ensaios de ALP |
| Placas de 96 poços | Corning | 3596 | Utilizadas para leituras de absorbância de ALP e ensaios de MTT |
| Kit de ensaio de ALP | Abcam | ab83369 (ou equivalente) | Utilizado para medir a atividade da fosfatase alcalina |
| Tampão substrato de ALP (2-amino-2-metil-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizado para iniciar a reação catalítica de ALP |
| Hidróxido de amônio (NH4OH) | N/A | N/A | Utilizado para ajuste de pH durante a síntese de nanohidroxiapatita. CORROSIVO |
| Anticorpo primário anti-DMP-1 | N/A | N/A | Marca-dor odontogênico; diluição 1:200 em tampão de bloqueio; incubação noturna a 4 °C |
| Anticorpo anti-CD44 humano (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometria de fluxo; marca-dor positivo de células-tronco mesenquimais |
| Anticorpo anti-CD45 humano (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometria de fluxo; marca-dor negativo de linhagem hematopoética |
| Anticorpo anti-CD73 humano (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometria de fluxo; marca-dor positivo de células-tronco mesenquimais |
| Autoclave (reator hidrotérmico) | Tuttnauer | N/A | Utilizado para tratamento hidrotérmico de nanohidroxiapatita a 140 °C, 0,3 MPa |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (ou equivalente) | Utilizado para determinar a concentração total de proteína para normalização da atividade de ALP |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Ajustada a 37 °C e 5% de CO2 para todas as etapas de cultura celular |
| Colagenase Tipo I | Sigma-Aldrich | C0130 | Utilizada para digestão enzimática de tecidos dentários durante o isolamento de células-tronco |
| DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Meio de cultura basal; também utilizado como grupo controle negativo |
| Soro bovino fetal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Suplemento para meio de cultura completo; FBS qualificado para MSC utilizado no meio de diferenciação |
| Citômetro de fluxo (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Utilizado para imunofenotipagem de células-tronco |
| Software de análise de citometria de fluxo (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para seleção de populações e análise de dados de painéis de citometria de fluxo |
| Microscópio de fluorescência | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Utilizado para imagens de imunofluorescência e pontuação de escore H |
| Liofilizador (freezer dryer) | Labconco | N/A | Utilizado para secar precipitados de nanomateriais a −50 °C |
| Anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Anticorpo secundário fluorescente; diluição 1:500; 1 h à temperatura ambiente |
| Anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (ou equivalente) | A-11012 (ou equivalente) | Anticorpo secundário com espectro distinto, utilizado para imunofluorescência de DMP-1 quando é realizada coloração múltipla |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versão 9 | Utilizado para cálculo de EC50 e análise estatística |
| Hemocitômetro | Neubauer | N/A | Utilizado para contagem manual de células e contagem total de células para normalização do escore H |
| Microscópio invertido de contraste de fase | Olympus | N/A | Utilizado para monitoramento diário do crescimento e morfologia celular |
| Meio de montagem antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Utilizado para montagem de lâminas após coloração de imunofluorescência |
| Reagente MTT | Invitrogen | M6494 | Utilizado para avaliar a atividade metabólica celular; 0,5 mg/mL, 4 h a 37 °C |
| Nanohidroxiapatita (NHAP) | Nanogate, Cairo, Egito | N/A | Sintetizada por precipitação úmida ou adquirida comercialmente; utilizada a 10 µg/mL |
| Pó NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Material inicial para preparação de Nano-NeoMTA2 por moinho planetário de bolas |
| Soro normal de cabra | N/A | N/A | Utilizado para bloqueio (5% em PBS) antes da aplicação do anticorpo primário |
| Meio de diferenciação osteogênica/odontogênica | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Meio controle positivo; contém DMEM, FBS, ascorbato, beta-glicerofosfato e dexametasona |
| Paraformaldeído (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | Utilizado para fixação celular antes da imunofluorescência. TÓXICO — usar em capela |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Utilizado para lavagem celular, diluição de anticorpos e suspensão de nanomateriais |
| Solução de penicilina-estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Suplemento antibiótico; utilizado a 1% no meio de cultura completo |
| Moinho planetário de bolas | Retsch (ou equivalente) | PM 400 | Utilizado para nanodimensionamento do pó NeoMTA2; 350 rpm, 10 h |
| Padrões de p-nitrofenol | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizados para gerar a curva padrão de atividade de ALP |
| Anticorpo primário coelho anti-RANKL | Abcam | ab9957 | Marca-dor osteogênico; diluição 1:200; incubação noturna a 4 °C |
| Anticorpo controle isotópico IgG de coelho | N/A | Controle negativo para imunofluorescência; concentração equivalente ao anticorpo primário | |
| Solução de solubilização com SDS-HCl | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizada para dissolver os cristais de formazano de MTT. CORROSIVO |
| Placas de cultura de tecidos de seis poços | Corning | 3516 | Utilizadas para ensaios de diferenciação |
| Hidróxido de sódio (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (ou equivalente) | N/A | Utilizado para interromper a reação de ALP antes da medição de absorbância; CORROSIVO |
| Sonicador (sonda ou banho ultrassônico) | Branson Ultrasonics | N/A | Utilizado para dispersão de nanopartículas antes dos ensaios biológicos |
| Frascos de cultura T-75 | Corning | 430641 | Utilizados para expansão de células-tronco |
| TEOS (ortossilicato de tetraetila) | N/A | N/A | Precurssor de sílica para síntese sol-gel de vidro bioativo 45S5. INFLAMÁVEL |
| Microscópio eletrônico de transmissão | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Utilizado para caracterização de tamanho e morfologia de nanomateriais |
| Triton X-100 (0,1% em PBS) | N/A | N/A | Utilizado para permeabilização celular antes da imunofluorescência |
| Solução de azul de tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | Utilizada para avaliação da viabilidade celular |
| Difratômetro de raios X (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Utilizado para análise cristalográfica de nanopartículas |
Referências
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.