Este estudo avalia a expressão de miR-21-5p, sua associação com a molécula de adesão celular 1 e suas relações com migração, proliferação, expressão de marcadores inflamatórios e sobrevida em tecidos e linhagens celulares de câncer de pulmão de células não pequenas.
Artigo de investigação
O Eixo miR-21-5p-Molécula de Adesão Celular 1 na Progressão e no Prognóstico do Câncer de Pulmão de Não Pequenas Células
28 visualizações
⸱
11 de setembro de 2026
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Evidências indicam que o miR-21-5p é um importante regulador molecular no câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP). A molécula de adesão celular 1 (CADM1) é um possível supressor tumoral, mas a relação regulatória entre o miR-21-5p e o CADM1 na progressão do CPCNP permanece pouco clara. A PCR quantitativa com transcrição reversa (qRT-PCR) foi utilizada para detectar a expressão do miR-21-5p e do CADM1 em tecidos e células de CPCNP; a ligação alvo entre o miR-21-5p e o CADM1 foi verificada por ensaio de gene repórter de luciferase dual; a capacidade de migração celular foi avaliada pelo ensaio Transwell; os dados clínico-patológicos e a análise de sobrevida foram combinados para explorar o significado clínico do miR-21-5p; o enriquecimento funcional dos genes-alvo do miR-21-5p foi analisado por bioinformática. A expressão do miR-21-5p em tecidos de CPCNP foi significativamente maior do que em tecidos normais adjacentes, e pacientes com alta expressão de miR-21-5p apresentaram menor sobrevida geral. A alta expressão de miR-21-5p é um fator de risco independente para a sobrevida de pacientes com CPCNP; a superexpressão do miR-21-5p promoveu a migração celular em células de CPCNP e aumentou a expressão de fatores inflamatórios; o ensaio de gene repórter de luciferase dual confirmou que o miR-21-5p tem como alvo direto o CADM1; a superexpressão do CADM1 inibiu a migração celular em células de CPCNP e reduziu a expressão de fatores inflamatórios; a análise de bioinformática mostrou que os genes-alvo do miR-21-5p estão enriquecidos em múltiplas vias de sinalização relacionadas à ocorrência e ao desenvolvimento tumoral. O miR-21-5p promove a progressão do CPCNP ao direcionar e inibir o CADM1 e pode atuar como biomarcador prognóstico e alvo terapêutico.
Introdução
Em todo o mundo, o câncer de pulmão ocupa uma das principais posições entre as causas de mortalidade relacionada ao câncer, com sua incidência em constante aumento1,2. Nas populações do leste asiático, a incidência e a mortalidade por câncer de pulmão atingem 222,1 e 155,5 por 100.000 homens, contra 158,1 e 87,3 por 100.000 mulheres, respectivamente. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) representa cerca de 80% de todos os casos de câncer pulmonar e inclui três subtipos histológicos principais3. Em comparação com o altamente agressivo câncer de pulmão de células pequenas (CPCP), o CPCNP progride e metastatiza mais lentamente; no entanto, sintomas clínicos iniciais vagos fazem com que mais de 75% dos pacientes recebam o diagnóstico em estágios intermediários ou avançados, contribuindo para uma sobrevida global persistentemente baixa em cinco anos4. A tumorigênese pulmonar é impulsionada pela ativação oncogênica e pelo silenciamento de genes supressores de tumor5, destacando a necessidade urgente de desvendar os fundamentos moleculares do CPCNP para o avanço de terapias inovadoras6.
Os microRNAs (miRNAs, com 18–25 nucleotídeos de comprimento) mediam a repressão gênica pós-transcricional ao se ligarem à região não traduzida 3′ (3′-UTR) dos RNAs mensageiros-alvo, desencadeando a supressão traducional ou a degradação do mRNA7. A biogênese dos miRNAs inicia-se com a transcrição pela RNA polimerase II, gerando transcritos primários de miRNA, que são então clivados por enzimas RNase III para formar precursores de miRNA com estrutura em formato de laço (pre-miRNAs)8. Embora a maioria dos miRNAs reprima a expressão gênica por complementaridade parcial ou total com as 3′-UTRs dos mRNAs, certos miRNAs podem aumentar a tradução do mRNA em contextos específicos do ciclo celular9. Até o momento, centenas de miRNAs humanos foram identificados, os quais regulam processos biológicos fundamentais, incluindo proliferação celular, diferenciação e apoptose10. Anteriormente, a detecção de miRNAs expressos de forma anômala permanecia tecnicamente desafiadora; o advento do sequenciamento de alto rendimento permitiu o perfilamento rápido e imparcial de miRNAs disregulados em tecidos doentes11. Aqui, focamos no miR-21-5p, um dos primeiros miRNAs transcritos pela RNA polimerase II a ser caracterizado, cujas funções regulatórias oncogênicas estão sob intensa investigação12.
O miR-21-5p é codificado dentro de um íntron do gene TMEM49 e está consistentemente superexpresso em múltiplas neoplasias humanas, incluindo cânceres de esôfago, colorretal e pulmonar13. Dados pré-clínicos existentes em Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (CPNPC) confirmam sua atividade oncogênica: níveis elevados de miR-21-5p aceleram a proliferação tumoral, a transição epitélio-mesênquima (TEM) e a metástase à distância por meio do silenciamento de alvos anti-oncogênicos, como PTEN e PDCD414. No entanto, trabalhos anteriores concentram-se principalmente na sinalização proliferativa e apoptótica mediada pelo miR-21, e poucos relatos investigam de forma sistemática o eixo regulatório miR-21-5p/CADM1 no CPNPC15. A molécula de adesão celular 1 (CADM1) é um supressor tumoral bem estabelecido em cânceres epiteliais16; ela preserva a adesão intercelular para impedir a dissociação das células tumorais e sua disseminação metastática, e sua subexpressão está associada a estágios tumorais avançados e pior sobrevida em coortes de pacientes com CPNPC. Mecanicamente, CADM1 também inibe a sinalização inflamatória pró-tumoral do fator nuclear kappa B (NF-κB), que promove a metástase por meio da indução da secreção de citocinas pró-inflamatórias e da remodelação do microambiente tumoral17. Apesar da documentação separada da oncogenicidade do miR-21-5p e dos efeitos supressores tumorais do CADM1, três lacunas críticas de conhecimento persistem quanto ao eixo miR-21-5p/CADM1 no CPNPC: primeiro, a ligação direta e a repressão de CADM1 pelo miR-21-5p carecem de validação experimental em células de câncer de pulmão; segundo, permanece indefinido se esse eixo induz fenótipos malignos por meio de vias inflamatórias downstream; terceiro, a capacidade prognóstica preditiva de assinaturas combinadas de expressão de miR-21-5p/CADM1 ainda não foi avaliada em espécimes clínicos de CPNPC.
Com base nessas questões não resolvidas, propomos uma hipótese mecanicista central: a miR-21-5p regulada para cima no CCRP se liga diretamente à região 3′-UTR de CADM1 para suprimir a expressão de CADM1, desreprimindo assim a sinalização inflamatória metastática inibida por CADM1, acelerando a migração do CCRP e conferindo um prognóstico clínico inferior. Este estudo busca alcançar três objetivos de pesquisa pré-definidos: (1) Verificar o direcionamento molecular direto de CADM1 pela miR-21-5p e avaliar a migração nas linhagens celulares A549 e H1299 de CCRP; (2) Elucidar se a cascata miR-21-5p/CADM1 modula o potencial metastático por meio da transdução de sinal inflamatório; (3) Avaliar o valor prognóstico clínico da assinatura de expressão miR-21-5p/CADM1 para identificar novos biomarcadores diagnósticos e candidatos terapêuticos para CCRP metastático.
Protocolo
Este estudo retrospectivo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Quzhou (número de aprovação 202402208). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos ou de um responsável legal antes da coleta das amostras.
Coleta de amostras
Tecidos tumorais primários de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) foram obtidos cirurgicamente dos pacientes incluídos no estudo, enquanto os tecidos pulmonares normais adjacentes pareados foram coletados retrospectivamente do Centro Nacional de Pesquisa de Engenharia para Biópsia Clínica (Cidade de Quzhou, Província de Zhejiang, China). Um total de 157 espécimes de pacientes com NSCLC incluídos consecutivamente entre janeiro de 2019 e dezembro de 2024 foram incluídos neste estudo de coorte. O tamanho da amostra de 157 espécimes pareados foi estatisticamente justificado com base em pesquisas prognósticas prévias publicadas sobre miRNAs em NSCLC: assumindo um tamanho de efeito moderado de 0,5, α = 0,05 e poder estatístico de 80%, o tamanho mínimo necessário da amostra foi calculado como 122 casos. Considerando possíveis perdas de espécimes, necrose tecidual grave e pacientes perdidos durante o acompanhamento, incluímos consecutivamente 157 pacientes elegíveis de janeiro de 2019 a dezembro de 2024 para garantir poder estatístico suficiente. Todos os tecidos tumorais e os tecidos pulmonares normais adjacentes pareados foram obtidos do mesmo paciente durante a ressecção cirúrgica, formando amostras pareadas para análises comparativas subsequentes.
Os critérios de inclusão foram: (1) Pacientes com diagnóstico histopatológico confirmado de CCRP primário por meio de biópsia pós-operatória; (2) Dados completos de linha de base clínica, estadiamento histopatológico e acompanhamento de sobrevida a longo prazo; (3) Ausência de radioterapia, quimioterapia ou terapia direcionada prévia antes da coleta de tecido; (4) Disponibilidade de espécimes completos pareados de tecido tumoral e tecido para-canceroso.
Os critérios de exclusão foram: (1) Tumores malignos secundários combinados de outros órgãos; (2) Pacientes perdidos durante o acompanhamento nos 3 meses após a cirurgia; (3) Espécimes com necrose grave ou volume insuficiente de tecido para detecção molecular subsequente.
Todas as amostras frescas de tecido foram colocadas em nitrogênio líquido dentro de 15 minutos após a ressecção cirúrgica, transferidas para um congelador de ultra-baixa temperatura e armazenadas a −80 °C para extração de RNA e proteína. O acompanhamento clínico foi realizado regularmente, e a sobrevida global foi medida em meses a partir do diagnóstico anatomopatológico até o óbito ou a data final do último acompanhamento.
Classificação do nível de expressão de miR-21-5p
Os valores relativos de expressão de miR-21-5p dos 157 pacientes foram ordenados em ordem crescente, e a coorte foi estratificada pelo valor mediano de corte. Devido a múltiplos valores idênticos próximos à mediana, os pacientes com expressão abaixo da mediana foram alocados no grupo de baixa expressão (n = 61); os pacientes com expressão igual ou superior à mediana, incluindo todas as observações repetidas no valor mediano, foram classificados no grupo de alta expressão (n = 96). Essa regra de alocação de valores repetidos foi previamente definida antes do agrupamento, a fim de resolver leituras medianas duplicadas, e o resultado do agrupamento foi verificado cruzadamente com os dados brutos de quantificação por qRT-PCR.
Cultura celular
As linhagens celulares humanas de Câncer de Pulmão de Não Pequenas Células (NSCLC) A549 e H1299 foram obtidas de um fornecedor comercial (consulte a Tabela de Materiais). As células A549 foram mantidas em meio RPMI-1640, e as células H1299 foram cultivadas em DMEM. Ambos os meios de cultura celular foram enriquecidos com 10% de soro bovino fetal (FBS) inativado pelo calor, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL). As células foram cultivadas em condições padrão a 37 °C em incubadora umidificada suprida com 5% de CO₂.
O perfil por repetições em tandem curtas (STR) foi realizado para autenticar a identidade das linhagens celulares A549 e H1299 antes de todos os experimentos funcionais. O teste de contaminação por micoplasma foi realizado mensalmente utilizando um kit comercial de detecção de micoplasma baseado em PCR, e somente células negativas para micoplasma foram utilizadas nos ensaios subsequentes.
Células na fase de crescimento logarítmico com morfologia intacta foram colhidas para transfeção transitória. Um reagente de transfeção baseado em lipídeos (ver Tabela de Materiais) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Ensaios celulares subsequentes foram realizados 50 h após a transfeção.
Transfeção celular
Para transfeção, células na fase de crescimento logarítmico com morfologia intacta foram semeadas em placas de cultura 24 h antes, para atingir 60%–70% de confluência. A transfeção foi realizada com um reagente de transfeção baseado em lipídeos (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro grupos experimentais foram utilizados: controle negativo de mimetizadores (mimic-NC), mimetizador de miR-21-5p, controle negativo de inibidores (inhibitor-NC) e inibidor de miR-21-5p. As sequências de nucleotídeos estão fornecidas no Arquivo Suplementar 1.
O RNA total foi extraído 50 h após a transfeção, e a PCR quantitativa de transcrição reversa (qRT-PCR) foi realizada para medir a expressão relativa do miR-21-5p e verificar a eficiência de transfeção. Ensaios de migração celular foram realizados 50 h após a transfeção. Para transfeção transitória, as células foram tratadas com o análogo do miR-21-5p ou controle negativo do análogo (mimic-NC) em uma concentração final de 50 nM, enquanto o inibidor do miR-21-5p e o controle negativo do inibidor (inhibitor-NC) foram introduzidos em 100 nM. Para evitar efeitos confundidores atribuíveis a diferenças na quantidade de ácido nucleico, a quantidade total de ácido nucleico transfectado foi mantida idêntica em todos os quatro grupos de tratamento.
A proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio com o Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8). Células estavelmente transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços a 3 × 103 células/poço, com seis réplicas técnicas estabelecidas para cada grupo. Após 24, 48 e 72 h da semeadura, 10 µL do reagente CCK-8 foram adicionados a cada poço, seguidos por incubação a 37 °C durante 2 h. A proliferação celular foi quantificada mediante a medição da absorbância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
Todos os experimentos de transfeção transitória, CCK-8 e migração foram realizados com não menos de três réplicas biológicas independentes, e cada réplica biológica continha 3–6 réplicas técnicas conforme descrito acima.
PCR quantitativo de transcrição reversa
O RNA total de células de CCRP e de tecidos tumorais clínicos pareados e tecidos normais adjacentes foi isolado com um reagente de extração de RNA baseado em fenol/guanidina (consulte a Tabela de Materiais). A pureza e a concentração do RNA foram determinadas por espectrofotometria ultravioleta; apenas amostras com razões de densidade óptica (DO) 260/280 e DO 260/230 entre 1,8 e 2,1 foram submetidas à transcrição reversa. As sequências dos iniciadores estão fornecidas no Arquivo Suplementar 1. O sistema de transcrição reversa continha 500 ng de RNA total, 2 µL de tampão de transcrição reversa, 1 µL de mistura de dNTP, 0,5 µL de transcriptase reversa, 1 µL de iniciador específico em alça para miRNA ou iniciador oligo(dT) para mRNA e água livre de RNase até um volume total de 20 µL. O sistema de amplificação qRT-PCR (volume total de 20 µL) consistiu em 10 µL de mix mestre de qPCR com SYBR Green, 0,4 µL de iniciador direto (10 µM), 0,4 µL de iniciador reverso (10 µM), 2 µL do molde de cDNA diluído e 7,2 µL de água livre de RNase.
O RNA mensageiro de CADM1 e GAPDH foi transcrito reversamente com um kit de transcrição reversa, enquanto o miR-21-5p foi transcrito reversamente com iniciadores em alça de haste e o cel-miR-39 exógeno como controle de adição. O controle exógeno cel-miR-39 foi adicionado a cada amostra de RNA imediatamente após o isolamento de RNA total e antes da transcrição reversa. Como um microRNA sintético de C. elegans sem sequência homóloga nos transcritos humanos, o cel-miR-39 pode corrigir as variações causadas por diferenças na eficiência de extração de RNA, perda por degradação do RNA e variações na eficiência da transcrição reversa entre diferentes amostras clínicas de tecido, servindo como um controle universal exógeno de normalização para a quantificação de miRNA. A qRT-PCR foi realizada com uma mistura mestra baseada em corante fluorescente de ligação ao DNA em um sistema de PCR em tempo real (consulte a Tabela de Materiais): 95 °C por 3 min, seguido por 40 ciclos a 95 °C por 10 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 20 s, com análise de curva de dissociação para confirmar a amplificação específica. Cada amostra teve três réplicas biológicas, cada uma com três réplicas técnicas, e a expressão relativa foi calculada utilizando o método 2⁻ΔΔCt. As sequências completas dos iniciadores para amplificação de mRNA de CRP, TNF-α e IL-6 estão fornecidas no Arquivo Suplementar 1, juntamente com as sequências dos iniciadores de CADM1, GAPDH e miR-21-5p.
Estabelecimento da expressão estável de miR-21-5p mediada por lentivírus
Vetores lentivirais comerciais LV-miR-21-5p e controle vazio LV-NC foram empacotados em células 293T. A sequência precursora de miR-21-5p foi inserida em um vetor lentiviral contendo genes de resistência à puromicina e de GFP como marcador. Os sobrenadantes lentivirais foram coletados 48 h e 72 h após a transfeção, concentrados e purificados para infecção celular.
As células A549 e H1299 foram semeadas 24 h antes da infecção para atingir 50–60% de confluência. As células foram infectadas com MOI = 10 (A549) e MOI = 15 (H1299) na presença de 5 µg/mL de polibreno para melhorar a eficiência de transdução. O meio foi substituído 24 h após a infecção, e as células foram cultivadas por mais 48 h antes da seleção com puromicina.
A seleção de células estáveis foi realizada com 5 µg/mL de puromicina durante 10 dias consecutivos; células brancas não infectadas foram utilizadas para verificar a eliminação completa das células não transduzidas em até 7 dias. Clones individuais positivos para GFP foram isolados e expandidos para gerar linhagens celulares monoclonais estáveis LV-21 e LV-NC.
Para ensaios de resgate de CADM1, foram preparados lentivírus comerciais de superexpressão de LV-CADM1 e de silenciamento por sh-CADM1. Foram estabelecidos quatro grupos experimentais: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 e o grupo de resgate LV-miR-21-5p + LV-CADM1. Os lentivírus de CADM1 foram infectados nas mesmas condições de MOI e seleção com puromicina utilizadas para os vetores de miR-21-5p. Todos os experimentos de resgate de proliferação e migração foram repetidos com três réplicas biológicas independentes.
Validação da superexpressão estável de miR-21-5p
O RNA total foi extraído de clones celulares estáveis LV-21 e LV-NC colhidos. A qRT-PCR foi realizada para detectar o nível relativo de expressão de hsa-miR-21-5p, utilizando cel-miR-39 como referência exógena. Clones celulares com superexpressão superior a 8 vezes de miR-21-5p em relação ao grupo LV-NC foram selecionados para todos os ensaios funcionais subsequentes, confirmando a construção bem-sucedida de linhagens celulares com superexpressão estável de miR-21-5p.
Ensaio de repórter dual-luciferase
Foram construídos um plasmídeo repórter da região 3'-UTR selvagem de CADM1 (WT-CADM1) contendo a sequência predita de ligação do miR-21-5p e um plasmídeo repórter da região 3'-UTR mutante de CADM1 (MUT-CADM1) com uma região semente de ligação mutada. Células A549 foram semeadas em placas de 24 poços 24 h antes da transfeção para atingir 60%–70% de confluência. Cada poço foi co-transfectado com 500 ng do plasmídeo repórter WT/MUT, 50 nM do análogo do miR-21-5p ou do análogo controle (mimic-NC) e um plasmídeo de referência interno de luciferase Renilla em uma proporção de massa fixa. Após 48 h de incubação pós-transfeção, as células foram completamente lisadas e os sinais de luminiscência das luciferases de *Photinus pyralis* e Renilla foram detectados sequencialmente utilizando um kit de detecção dual-luciferase. A atividade relativa de luciferase foi calculada como a razão entre o valor de luminiscência de *Photinus pyralis* e o valor de luminiscência de Renilla. Cada grupo experimental continha três réplicas biológicas independentes, com três réplicas técnicas por réplica biológica, e um teste t de amostras independentes de dois grupos foi utilizado para a comparação estatística da atividade relativa de luciferase entre os grupos mimic-NC e miR-21-5p mimic.
Ensaio de migração em Transwell
Para o ensaio de migração em Transwell, células estavelmente transfectadas foram suspensas em meio livre de soro e semeadas nos compartimentos superiores a 4 × 104 células por poço. Os compartimentos inferiores foram preenchidos com meio de cultura completo suplementado com 10% de FBS para estabelecer um gradiente quimiotático. Após incubação por 48 h a 37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂, as células que permaneceram na superfície superior da membrana foram cuidadosamente removidas. As células que migraram para o lado inferior da membrana foram fixadas em metanol e coradas com violeta cristal. A migração foi quantificada contando-se as células em cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente por inserto. Cada experimento foi realizado com três réplicas biológicas independentes, incluindo três réplicas técnicas para cada réplica biológica.
Análises estatísticas
Todos os experimentos in vitro foram realizados com no mínimo três réplicas biológicas independentes, cada uma acompanhada por réplicas técnicas correspondentes. A distribuição dos dados foi inicialmente avaliada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk para orientar a análise estatística. Para comparações pareadas entre tecidos tumorais e tecidos normais adjacentes, foi aplicado o teste t pareado ou o teste de Wilcoxon para postos com sinal, conforme a distribuição dos dados. As comparações entre dois grupos independentes foram analisadas utilizando o teste t independente ou o teste U de Mann-Whitney. As diferenças entre múltiplos grupos, incluindo experimentos de resgate, foram avaliadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida da correção post hoc de Bonferroni, enquanto a ANOVA de medidas repetidas foi utilizada para analisar conjuntos de dados longitudinais, como os ensaios de proliferação CCK-8 e de cicatrização de ferimento. As associações entre variáveis clínicas categóricas foram examinadas utilizando o teste χ2, e a relação entre a expressão de miR-21-5p e CADM1 foi avaliada por análise de correlação de Pearson. A sobrevida dos pacientes foi analisada por meio de curvas de Kaplan-Meier, com comparações realizadas pelo teste log-rank. Fatores prognósticos independentes foram identificados por meio de análises de regressão de riscos proporcionais de Cox univariada e multivariada. A significância estatística foi definida como P < 0,05. A regressão de Cox multivariada foi ajustada para idade, sexo, tipo histológico, nível de miR-21-5p e estado dos linfonodos (referência: idade ≤ 60 anos, sexo feminino, carcinoma escamoso, miR-21-5p baixo, linfonodos negativos); os resíduos de Schoenfeld foram utilizados para verificar a suposição de riscos proporcionais, e as variáveis com P univariado < 0,10 foram incluídas pelo método de seleção por entrada.
Resultados
Correlação entre a expressão de miR-21-5p e as características clinicopatológicas de pacientes com CCRP
Um total de 157 amostras tumorais de CCRP foram estratificadas em grupos de baixa expressão de miR-21-5p (n = 61) e alta expressão (n = 96) com base nos níveis medianos de miR-21-5p, e análises qui-quadrado não revelaram correlações significativas entre a expressão de miR-21-5p e a idade do paciente (χ2 = 1,36, P = 0,2435), sexo (χ2 = 1,06, P = 0,3032), tipo histológico (χ2 = 1,09, P = 0,2965) ou tamanho do tumor (χ2 = 5,623, P = 0,0601), enquanto a alta expressão de miR-21-5p esteve significativamente associada a grau tumoral avançado (χ2 = 16,25, P = 0,00006), metástase linfonodal positiva (χ2 = 12,17, P = 0,00049) e estágio T mais elevado (χ2 = 4,30, P = 0,117), sugerindo que o miR-21-5p exerce efeitos oncogênicos que facilitam a progressão do CCRP (Tabela 1).
Análise de regressão multivariável de Cox para fatores prognósticos independentes de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC)
A análise de regressão multivariável de Cox, incluindo idade, sexo, tipo histológico, expressão de miR-21-5p e metástase em linfonodo, revelou que a alta expressão de miR-21-5p (razão de risco [HR] = 3,066; intervalo de confiança [IC] 95%: 1,412–6,659; P = 0,005) e a metástase linfonodal positiva (HR = 22,295; IC 95%: 3,039–163,588; P = 0,002) foram fatores de risco prognósticos desfavoráveis independentes para baixa sobrevida global em pacientes com NSCLC, enquanto a idade do paciente, sexo e subtipo histológico não exerceram impactos prognósticos independentes significativos (todos P > 0,05) (Tabela 2).
Características da expressão clínica do miR-21-5p e sua correlação com CADM1 e fatores inflamatórios
A detecção por qRT-PCR em tecidos tumorais de CPMN e tecidos normais adjacentes emparelhados mostrou níveis relativos de miR-21-5p significativamente elevados nos tecidos tumorais em comparação com os controles normais (Figura 1A, P < 0,001). As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostraram que pacientes com alta expressão de miR-21-5p tiveram sobrevida global significativamente pior do que aqueles com baixa expressão de miR-21-5p (Figura 1B, P = 0,0027). As abundâncias de mRNA dos mediadores inflamatórios proteína C-reativa (PCR), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) estiveram todas acentuadamente aumentadas em espécimes de CPMN (Figura 1C, P < 0,01, P < 0,001). A análise de correlação de Pearson revelou uma correlação negativa fortemente significativa entre a expressão de miR-21-5p e de mRNA de CADM1 em amostras clínicas (r = -0,7773, IC 95%: -0,8325 a -0,7076, P < 0,0001, Figura 1D).
Validação funcional celular do miR-21-5p em células de CCRP
A RT-qPCR confirmou a eficiência bem-sucedida da transfeção do mimetizador de miR-21-5p em células A549 e H1299 (Figura 2A). Ensaios Transwell mostraram que a superexpressão de miR-21-5p aumentou significativamente a capacidade de migração relativa e as contagens de migração celular em ambas as linhagens celulares (Figura 2B,C). A detecção por RT-qPCR de citocinas inflamatórias revelou níveis acentuadamente aumentados de mRNA de CRP, TNF-α e IL-6 após a transfeção com o mimetizador de miR-21-5p, enquanto o tratamento com inibidor de miR-21-5p reverteu essa superexpressão (Figura 2D). Experimentos de resgate confirmaram que o mimetizador de miR-21-5p suprimiu drasticamente a transcrição de CADM1, e a cotransfeção com LV-CADM1 restaurou completamente a expressão de mRNA de CADM1 em células A549 e H1299 (Figura 2E,F). Em conjunto, esses dados celulares demonstraram que o miR-21-5p promove a migração de células de CCRP e a resposta inflamatória por meio da repressão de CADM1.
Efeitos do miR-21-5p na proliferação de células de CPMN
As curvas de proliferação pelo CCK-8 em 24 h, 48 h e 72 h mostraram que a transfeção com o mimetizador do miR-21-5p aumentou acentuadamente os valores de OD a 450 nm em ambas as linhagens celulares A549 e H1299, enquanto o inibidor do miR-21-5p suprimiu significativamente a viabilidade celular, com diferenças estatisticamente significativas observadas em 72 h (Figura 3A,B; P < 0,001). Esses dados demonstraram que o miR-21-5p exerce um efeito pró-proliferativo sobre células de CPMN.
Validação de CADM1 como alvo direto do miR-21-5p por meio de predição bioinformática e ensaio de repórter de dupla luciferase
Três bancos de dados online de predição de alvos de miRNA (miRWalk, StarBase, TargetScan) foram cruzados para identificar genes alvo downstream candidatos do miR-21-5p, obtendo-se 95 genes alvo comuns (Figura 4A). A análise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) indicou que esses genes candidatos estavam principalmente enriquecidos em processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares relacionados ao metabolismo celular, resposta ao estresse e regulação da transcrição (Figura 4B). A análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelou ainda um enriquecimento acentuado em cascatas de sinalização associadas a tumores, incluindo as vias da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da Ras (Figura 4C). O ensaio de repórter de dupla luciferase demonstrou que o mimetizador do miR-21-5p suprimiu significativamente a atividade relativa da luciferase no repórter do 3'-UTR selvagem de CADM1, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado no grupo com 3'-UTR mutante de CADM1 (Figura 4D, P < 0,01, ns: não significativo), confirmando a ligação direta entre o miR-21-5p e CADM1.
Promoção de fenótipos malignos de CPMN por meio da supressão de CADM1 em experimentos de resgate
A PCRqRT verificou a eficiência de transfeção do mimetizador e do inibidor de miR-21-5p em células A549 e H1299 (Figura 5A). A superexpressão de CADM1 (LV-CADM1) reduziu os níveis de mRNA dos fatores pró-inflamatórios CRP, TNF-α e IL-6, enquanto o silenciamento de CADM1 com RNA interferente pequeno (si-CADM1) elevou acentuadamente sua expressão (Figura 5B). Ensaios de migração em Transwell mostraram que a transfeção com LV-CADM1 suprimiu significativamente a capacidade migratória de ambas as linhagens celulares de CPMN (Figura 5C,D). A detecção de proliferação por CCK-8 demonstrou ainda que o efeito pró-proliferativo mediado por LV-21 foi completamente anulado pela co-transfeção com LV-CADM1, enquanto a aceleração do crescimento celular induzida por si-CADM1 pôde ser revertida pelo inibidor de miR-21-5p (Figura 5E,F). Em conjunto, esses dados de resgate confirmaram que CADM1 atua como um mediador funcional a jusante, responsável pela proliferação, migração e ativação inflamatória desencadeadas por miR-21-5p no CPMN.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados de origem que apoiam as descobertas deste estudo estão fornecidos no Arquivo Suplementar 2 e estão disponíveis com o artigo publicado.
Figura 1: Perfis de expressão de miR-21-5p, fatores inflamatórios e sua correlação com CADM1 em amostras clínicas de CCRP (A) Expressão relativa de miR-21-5p em tecidos pulmonares normais e tecidos tumorais de CCRP.BCurvas de sobrevida global de Kaplan-Meier de pacientes com CCRP estratificados por nível de expressão de miR-21-5p.CExpressão relativa de mRNA de fatores inflamatórios PCR, TNF-α, e IL-6 em tecidos normais e de CCRP.DGráfico de dispersão da correlação de Pearson mostrando a correlação linear negativa entre miR-21-5p e CADM1 Expressão de mRNA. **P < 0,01, ***P < 0,001. Para o Painel C: comparações estatísticas foram realizadas entre tecidos tumorais pareados e tecidos normais adjacentes para CRP, TNF-α e IL-6, respectivamente; **P < 0,01, ***P < 0,001 denotam diferenças significativas em comparação com tecidos pulmonares normais pareados. Todos os painéis incluíram ≥3 réplicas biológicas independentes; os dados de qRT-PCR representam média ± desvio padrão; pareado t-test foi adotado para comparação entre grupos; a análise de correlação em gráfico de dispersão utilizou o teste de Pearson. Abreviações: CADM1 = molécula de adesão celular 1; IC = intervalo de confiança; PCR = proteína C-reativa; IL-6 = interleucina-6; CPMNC = câncer de pulmão de células não pequenas; TNF-α = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fenótipos celulares e expressão de CADM1 regulados pelo miR-21-5p em células de CPMNC A549 e H1299. (A) Detecção por qRT-PCR da expressão do miR-21-5p após transfeção com o mimetizador. (B) Quantificação estatística da migração celular relativa a partir de ensaios Transwell. (C) Quantificação do número de células migradas por campo microscópico. (D) Expressão relativa de mRNA de CRP, TNF-α e IL-6 sob superexpressão ou inibição do miR-21-5p. (E) Expressão relativa de mRNA de CADM1 nos grupos de resgate A549 (NC, mimetizador de miR-21-5p, LV-CADM1, mimetizador+LV-CADM1). (F) Expressão relativa de mRNA de CADM1 nos grupos de resgate H1299. **P < 0,01, ***P < 0,001. Todos os ensaios celulares foram repetidos em três réplicas biológicas independentes, com três réplicas técnicas cada; as barras de erro representam média ± DP; comparações entre grupos utilizaram ANOVA unidirecional com correção de Bonferroni; os rótulos dos grupos correspondem rigorosamente aos grupos de transfeção descritos nos Métodos. Abreviaturas: CADM1 = molécula de adesão celular 1; CRP = proteína C-reativa; IL-6 = interleucina-6; LV = vetor lentiviral; NC = controle negativo; CPMNC = câncer de pulmão de células não pequenas; qRT-PCR = PCR quantitativo de transcrição reversa; TNF-α = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curvas de proliferação CCK-8 refletindo a viabilidade celular após superexpressão ou silenciamento de miR-21-5p. (A) Curvas de absorvância OD₄₅₀ dependentes do tempo de células A549 transfectadas com mimic-NC, miR-21-5p mimic, inhibitor-NC ou inibidor de miR-21-5p. (B) Curvas de absorvância OD₄₅₀ dependentes do tempo de células H1299 nos quatro grupos de transfeção. ***P < 0,001. Os ensaios CCK-8 continham seis réplicas técnicas por grupo em 3 repetições biológicas; os dados são apresentados como média ± DP; a ANOVA de medidas repetidas foi utilizada para comparações entre os pontos temporais. Abreviações: CCK-8 = Kit de Contagem Celular-8; NC = controle negativo; OD = densidade óptica. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Triagem bioinformática e ensaio de dupla luciferase para o gene alvo miR-21-5p CADM1. (A) Diagrama de Venn ilustrando os genes alvo comuns do miR-21-5p identificados pelos bancos de dados preditivos miRWalk, StarBase e TargetScan. (B) Gráfico de bolhas da análise de enriquecimento funcional da Ontologia Genética (GO) para os genes alvo interseccionados. (C) Gráfico de barras das principais vias de sinalização KEGG enriquecidas. (D) Atividade do repórter de dupla luciferase do 3'-UTR selvagem e mutante de CADM1 após superexpressão do miR-21-5p. **P < 0,01; ns, sem significância. O painel D utiliza apenas WT-CADM1 3'-UTR e MUT-CADM1 3'-UTR co-transfetados com o miR-21-5p mimic/mimic-NC para detecção de dupla luciferase; os rótulos Controle/superexpressão/interferência mostrados nos esboços originais foram ajustados para o agrupamento padrão WT/MUT nas figuras finais. A análise de predição de alvos utilizou três bancos de dados online; os valores de P de enriquecimento foram ajustados pelo método de correção FDR de Benjamini-Hochberg; os experimentos de dupla luciferase incluíram três repetições biológicas (cada uma com três repetições técnicas); as barras de erro representam média ± DP; teste t de dois grupos para comparação estatística. Abreviações: CADM1 = molécula de adesão celular 1; GO = Ontologia Genética; KEGG = Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas; MUT = mutante; NC = controle negativo; ns = não significativo; UTR = região não traduzida; WT = tipo selvagem. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Experimentos de resgate funcional verificando o eixo regulatório miR-21-5p/CADM1 em células A549 e H1299. (A) Expressão relativa de miR-21-5p após transfeção com mimetizador ou inibidor. (B) Expressão relativa de mRNA de CRP, TNF-α e IL-6 nos grupos LV-CADM1 e si-CADM1. (C) Quantificação estatística da capacidade relativa de migração sob superexpressão de CADM1. (D) Quantificação do número de células migradas por campo microscópico nos grupos LV-CADM1. (E) Valores de OD₄₅₀ do CCK-8 dos grupos de resgate A549 (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+inibidor de miR-21). (F) Valores de OD₄₅₀ do CCK-8 dos grupos de resgate H1299 com tratamentos de transfeção idênticos. **P < 0,01, ***P < 0,001. Todos os ensaios de resgate incluíram três réplicas biológicas independentes; as barras de erro indicam média ± DP, ANOVA unifatorial com teste post-hoc de Bonferroni para comparações entre múltiplos grupos. Abreviações: CADM1 = molécula de adesão celular 1; CRP = proteína C-reativa; IL-6 = interleucina-6; LV = vetor lentiviral; NC = controle negativo; OD = densidade óptica; qRT-PCR = PCR quantitativo de transcrição reversa; si = RNA interferente pequeno; TNF-α = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Expressão de miR-21-5p | Total | x2 | Valor de P | |||
| Baixa | Alta | |||||
| Idade (anos) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1,357 | 0,244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Sexo | Masculino | 42 | 73 | 115 | 1,06 | 0,3032 |
| Feminino | 19 | 23 | 42 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Tipo histológico | Carcinoma de células escamosas | 31 | 41 | 72 | 1,09 | 0,2965 |
| Adenocarcinoma | 30 | 55 | 85 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Grau do tumor | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16,25 | 0,00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Metástase em linfonodo | Negativa | 41 | 37 | 78 | 12,17 | 0,00049 |
| Positiva | 20 | 59 | 79 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Tamanho do tumor (cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5,623 | 0,0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
| Estágio T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4,295 | 0,117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Total | 61 | 96 | 157 | |||
Tabela 1: Associação entre a expressão de miR-21-5p e características clinicopatológicas em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Os valores correspondem ao número de pacientes. As associações foram avaliadas com o teste χ2. Abreviação: NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas. Cada teste χ2 foi realizado para variáveis clinicopatológicas categóricas; todas as análises utilizaram as 157 amostras completas de pacientes.
| n | P valor | Risco relativo | Intervalo de confiança de 95% | |||
| Inferior | Superior | |||||
| Idade (anos) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Sexo | Masculino | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Feminino | 42 | |||||
| Tipo histológico | Carcinoma de células escamosas | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Adenocarcinoma | 85 | |||||
| Expressão de miR-21-5p | Alta | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| Baixa | 61 | |||||
| Metástase em linfonodo | Negativa | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| Positiva | 79 | |||||
Tabela 2: Análise multivariável de riscos proporcionais de Cox para a sobrevida global em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Os valores são razões de risco com intervalos de confiança de 95%. Abreviações: CI = intervalo de confiança; NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas. A regressão multivariável de Cox foi realizada com dados completos da coorte clínica, e a HR e o IC de 95% foram calculados para triagem prognóstica independente.
Arquivo Suplementar 1: Sequências de oligonucleotídeos e iniciadores utilizados para transfeção e PCR quantitativo de transcrição reversa. O arquivo lista o mimetizador e o inibidor do miR-21-5p, seus respectivos controles negativos e os iniciadores para CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p e cel-miR-39. Todas as sequências são apresentadas na direção 5′–3′. Abreviações: CADM1 = molécula de adesão celular 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato; hsa = Homo sapiens; miR = microRNA; PCR = reação em cadeia da polimerase. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2. Dados brutos que sustentam as figuras. Este arquivo contém os conjuntos de dados subjacentes e as análises estatísticas utilizadas para gerar as figuras apresentadas no manuscrito, incluindo as características clínicas, análises de expressão, dados de sobrevida e os resultados estatísticos associados. Esses dados brutos sustentam as descobertas relatadas no texto principal. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo confirmou de forma sistemática a expressão elevada de miR-21-5p em tecidos clínicos de CCRP, a qual se correlacionou com maior transcrição de fatores inflamatórios, maior capacidade de migração e proliferação celular, enquanto experimentos de duplo luciferase, qRT-PCR e de resgate identificaram CADM1 como seu alvo funcional direto; previsões bioinformáticas indicaram ainda que os alvos downstream do miR-21-5p estavam enriquecidos nas cascatas oncogênicas MAPK e Ras, fornecendo evidências preliminares de que o eixo miR-21-5p/CADM1 pode estar envolvido em vias de sinalização relacionadas à progressão maligna do tumor.
A análise de coorte clínica revelou que a alta expressão de miR-21-5p estava fortemente associada ao grau avançado do tumor, metástase em linfonodos e menor sobrevida geral. A regressão de Cox multivariada confirmou o miR-21-5p como um fator prognóstico adverso independente, sugerindo que o miR-21-5p pode servir como um biomarcador potencial para avaliar o risco de progressão e o desfecho de sobrevida em pacientes com Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (NSCLC).
Ensaios funcionais in vitro demonstraram que a superexpressão de miR-21-5p facilitou a proliferação, migração e resposta inflamatória de células de CCRP, enquanto a superexpressão de CADM1 reverteu todos esses fenótipos oncogênicos; a correlação negativa de expressão entre miR-21-5p e CADM1 em amostras de pacientes, juntamente com dados celulares de resgate, esclareceram completamente o mecanismo regulatório pelo qual miR-21-5p induz comportamentos malignos no CCRP por meio da inibição direta de CADM1.
Conforme estudos anteriores que relatam o papel oncogênico do miR-21-5p no carcinoma pulmonar, este trabalho complementa ainda mais os dados de correlação clínica intactos e a validação completa de resgate para consolidar sua função promovedora de tumor; distinto das pesquisas existentes, que se concentram apenas em um único fenótipo de metástase, o presente estudo associa simultaneamente o miR-21-5p à proliferação celular e ao microambiente inflamatório do tumor por meio do alvo CADM1, ampliando a rede reguladora do miR-21-5p no CCRP.
Com base nas evidências preliminares acima, a detecção da expressão tecidual de miR-21-5p possui valor auxiliar potencial para a estratificação de risco e avaliação prognóstica do CCRP, e o eixo miR-21-5p/CADM1 pode fornecer novos alvos moleculares candidatos para o desenvolvimento de estratégias de intervenção contra a progressão do CCRP, embora sua eficácia terapêutica clínica permaneça por ser verificada.
Este estudo apresenta várias limitações. Foram utilizados ensaios celulares in vitro e uma única coorte clínica retrospectiva, sem validação por xenotransplante in vivo ou por coorte externa independente. Ensaios adicionais de proliferação (por exemplo, ensaios de EdU e de formação de colônias), bem como ensaios de invasão, apoptose e ciclo celular, não foram realizados. Testes em sangue periférico para avaliar o potencial diagnóstico não invasivo, validação do nível proteico de CADM1, a lista completa de genes-alvo sobrepostos e análise sistemática da rede de interação proteína-proteína (PPI) também não estiveram disponíveis. Trabalhos futuros devem abordar essas limitações e investigar mais a fundo os reguladores upstream do miR-21-5p e a sinalização downstream de CADM1.
Coletivamente, este trabalho oferece evidências preliminares de que o miR-21-5p atua como um microRNA oncogênico, acelerando a proliferação, migração e inflamação do CCRP ao direcionar diretamente o CADM1, e sua alta expressão prediz sobrevida desfavorável para os pacientes.
Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a declarar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Formol tamponado neutro a 10% | Fisher Scientific (Fisherbrand)™) | SF100-4 (típico) | Fixador de tecidos; tecidos cortados em &espessura <5 mm, fixado à temperatura ambiente por 14–26 horas |
| Placa de Cultura Celular de 24 Poços | Corning | 3526 | Placa para semeadura de células transfectadas e realização do ensaio de cicatrização de ferida (ensaio de arranhão) |
| Linha Celular A549 | ATCC (ou Centro de Recursos de Xangai) | CCL-185 | Linha celular de câncer de pulmão não microcítico (CPNMC) humano (adenocarcinoma) |
| Kit de ensaio CCK-8 | Dojindo | CK04 | Detecção de proliferação |
| Meio de Cultura Celular (não especificado) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Vários (por exemplo, RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | Meio basal para linhagens celulares de CCRP; a composição exata depende da linhagem celular utilizada |
| cel-miR-39 (Controle exógeno de spike-in) | GenePharma (Xangai, China) | Personalizado (por exemplo, B010302) | Referência externa para normalização da expressão de miRNA, adicionada durante o isolamento de RNA |
| CO2 Incubadora (umidificada) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Fornece 37°C, 5% CO₂2, e umidade saturada para cultivo celular |
| CRP/TNF-αpares de iniciadores IL-6 | Sangon Biotech | síntese personalizada | Sequências completas no Arquivo Suplementar 1 |
| Solução corante de violeta de cristal | Solarbio | G1062 | Coloração de células migradas |
| meio DMEM | Gibco | 11965092 | Para o cultivo de H1299/293T |
| Kit de ensaio de repórter duplo com luciferase | Promega | E1910 | Detecção da região 3'UTR do CADM1 WT/MUT |
| miR-39 exógeno de C. elegans | Qiagen | spike-in personalizado | Adicionado após o isolamento de RNA para normalização |
| Soro bovino fetal (SBF) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Suplemento adicionado ao meio de cultura na concentração final de 10% para suportar o crescimento celular |
| Ponta de Pipeta Fina (por exemplo, 10 µL dica | Axygen (Corning) | T-300 | Utilizado para raspar manualmente uma monocamada de células a fim de criar um "ferida" lacuna |
| GAPDH (Controle endógeno) | Vários fornecedores (por exemplo, Sangon Biotech, RiboBio; primers personalizados) | Personalizado | Gene de referência para normalização de mRNA utilizado em qRT-PCR |
| GO/KEGG (anotação clusterProfiler) | Bioconductor | construção de 2026 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v9.5.1 | Plotagem & estatísticas in vitro |
| Linha Celular H1299 | ATCC (ou Centro de Recursos de Xangai) | CRL-5803 | Linha celular de câncer de pulmão não microcítico (CPNMC) humano derivada de metástase em linfonodo |
| SFB inativado pelo calor | Gibco | 10099141 | concentração de trabalho de 10% |
| linha celular HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; teste de STR realizado mensalmente, detecção de micoplasma negativa |
| Mistura para Embalagem de Lentivírus | Genecopoeia (ou Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Fornece plasmídeos de empacotamento (gag/pol, rev, vsv-g) para a produção de lentivírus |
| Vetor Lentivírus-21 (LV-21) | GeneChem (Xangai, China) ou Genecopoeia | Personalizado | Vetor lentiviral contendo miR-21-5p para a construção de linhagens celulares com expressão estável |
| Vetor Lentiviral-NC (LV-NC) | GeneChem (Xangai, China) ou Genecopoeia | Personalizado | Vetor lentiviral de controle negativo sem inserção de miR-21-5p |
| Reagente de transfeção lipídico | Thermo Fisher | L3000015 | Para transfeção transitória |
| Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 ou L3000008 | Reagente de transfeção baseado em lipídios; 50 horas pós-transfeção para experimentos subsequentes |
| Metanol | Sinopharm | 67-56-1 | Fixação celular |
| Metanol (Fixador/Diluente para Coloração) | Sigma-Aldrich | 34860 | Utilizado como fixador ou diluente para a coloração com violeta cristal |
| inibidor de miR-21-5p/inibidor-NC | GenePharma | síntese personalizada | Sequências no Arquivo Suplementar 1 |
| mimético de miR-21-5p/mimético NC | GenePharma | síntese personalizada | Sequências no Arquivo Suplementar 1 |
| miRDB | Universidade de Washington | v6.0 | |
| miRWalk | Universidade de Heidelberg | v3.0 | |
| Centro Nacional de Engenharia de Biópsias | Centro Nacional de Engenharia de Biópsias (China) | N/A | Fornecedor institucional de amostras de tecido de câncer de pulmão com dados clínicos registrados e diagnóstico histopatológico |
| Tecido de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (para cultura primária) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Pedido personalizado | Fonte do tecido; cultivado em meio com 10% de FBS a 37°C; células com boa morfologia na fase de crescimento logarítmico selecionadas para transfeção |
| Instrumento de PCR | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | Obtenha produtos de amplificação para qRT-PCR |
| Penicilina-Estreptomicina | Solarbio | P1400 | 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL estreptomicina |
| Pipetas (Únicas & Multicanal | Eppendorf | Série Research Plus | Para manipulação precisa de líquidos em todos os experimentos |
| Polibreno | Sigma-Aldrich | H9268 | Final 5 μg/mL para infecção por lentivírus |
| Puromicina | InvivoGen | ant-pr-1 | 5 μg/mL para triagem de células estáveis |
| Puromicina Dihidrocloridrato | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | antibiótico de seleção, usado em 5 μg/mL para estabelecer linhagens celulares transfectadas de forma estável |
| R | Fundação R | v4.2.1 | Pacote: clusterProfiler, ggplot2 |
| Kit de transcrição reversa | Takara | RR047 | RT em alça para miRNA, oligo(dT) para mRNA |
| Tubos EP livres de RNase | Axygen (Corning) | MCT-150-C | Tubos de 1,5 mL livres de RNase para armazenamento e processamento de RNA |
| meio RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Para o cultivo de A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | síntese personalizada | Sequências no Arquivo Suplementar 1 |
| si-NC | GenePharma | síntese personalizada | Sequências no Arquivo Suplementar 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | Análise clínica/Regressão de Cox |
| SYBR Green qPCR Master Mix | Roche | 4913914001 | amplificação por qRT-PCR |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| Reagente para extração de RNA total | Takara | 9109 | Lise baseada em fenol/guanidina |
| Câmara Transwell | Corning (Costar) | 3422 (24 poços, 8.0 µm) | Para transfeção celular em meio à temperatura ambiente; primers químicos adicionados e incubados por 48 h |
| Câmaras de migração Transwell | Corning | 3422 | 8 μm tamanho dos poros |
| Reagente TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Extração de RNA total de amostras de tecido; qualidade do RNA avaliada pelas razões OD260/280 e OD260/230 |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Para destacar células dos vasos de cultura antes da semeadura em placas de 24 poços |
Referências
- Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
- Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
- O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
- Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
- Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
- Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
- Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
- Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
- Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
- Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
- Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
- Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
- Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.