É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Um Novo Método de Biópsia em Escala para Coletar Linfócitos Malignos e Não Malignos do Peixe-Zebra

120 vistas

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

7 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

Neste artigo

Resumo

Um novo método de biópsia em escala permite a coleta de células de leucemia linfoblástica aguda de peixes-zebra vivos. Os resultados mostram abundância de linfócitos nas escamas de peixes do tipo selvagem (WT) e aumento dramatico dos linfócitos em escamas de peixes com LLA (leucemia linfoblástica aguda). Essa técnica permite o estudo minimamente invasivo de linfócitos normais e malignos da epidérmica.

Resumo

Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo poderoso para estudar linfopoiese e cânceres linfoides, já que peixe-zebra e humanos compartilham sistemas imunológicos adaptativos semelhantes, incluindo células B e T. Vários modelos de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) de D. rerio são descritos, incluindo peixes que expressam MYC humano específico de linfoblastos (hMYC). Relatamos que peixes rag2:hMYC também desenvolvem leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), tornando-os úteis para estudar ambos os tipos de TODOS os tipos. Uma limitação dos modelos ALL de peixe-zebra é que não existem métodos não letais para amostragem serial de ALL. Para resolver isso, fomos pioneiros em um novo método de 'biópsia em escala' para coletar TODAS as células de peixes-zebra vivos. No entanto, o conhecimento sobre quais linfócitos residem nas escamas normais do peixe-zebra é escasso. Assim, para definir identidades normais dos linfócitos epidérmicos, realizamos biópsias de escamas em linhas transgênicas marcadas por linfócitos sem rag2:hMYC. Utilizamos microscopia convencional e confocal para analisar escamas, revelando abundância de linfócitos epidérmicos. Também analisamos escamas de peixes com T- e B-ALL, que demonstraram linfócitos marcadamente aumentados em folhas confluentes de células ALL em várias escamas. Em seguida, usamos a separação celular ativada por fluorescência (FACS) para purificar linfócitos não malignos e TODOS a partir de escamas para estudos ex vivo . Análises citométricas de fluxo e de expressão de células ALL de escamas ou outros tecidos do mesmo peixe mostraram que a expressão gênica ALL da célula em escamas se assemelhava à das células ALL em outros lugares. Também quantificamos o número de células T, B, T-ALL e B-ALL normais que poderiam ser purificadas por escala. No geral, a biópsia por escamas oferece uma técnica minimamente invasiva e não letal para estudar linfócitos epidérmicos do peixe-zebra, possibilitando estudos ex vivo , incluindo análises de amostras malignas.

Introdução

A função barreira da pele dos mamíferos e seus papéis na imunidade são estabelecidos 1,2,3. Linfócitos de mamíferos contribuem para a imunidade cutânea, com células T citotóxicas residindo na epiderme, e células B, T e células natural killer (NK) presentes naderme 1,3,4,5. Os peixes-zebra possuem esses linfócitos, com imunoglobulinas de superfície, receptores de células T, receptores do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), citocinas e seus receptores, além de outras moléculas imunológicas, compartilhando assim a maioria das características imunológicas dosmamíferos 6,7,8,9. Estudos recentes com pele e escamas do peixe-zebra demonstraram várias populações cutâneas de linfócitos, incluindo células T e Bepiteliais 10,11, e uma rede linfoide que facilita o tráfico de células T e a vigilância de antígenos. Semelhanças entre linfócitos de peixes teleósteos e mamíferos fazem do D. rerio um modelo in vivo poderoso para estudar linfopoiese, função linfócitoe e doenças linfóides, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL) 8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Nossos trabalhos anteriores mostraram que a linhagem T e B (T-ALL, B-ALL) surgem em peixes-zebra transgênicos rag2:hMYC, tornando essa linha útil para estudar ambos os tiposALL 13,15,21,22. Uma grande limitação dos modelos de ALL de D. rerio, especialmente em estudos de expressão longitudinal ou testes de drogas, é a falta de métodos para coletar amostras de ALL em série de animais individuais. Métodos anteriores, como a coleta de sangue retroorbital, são tecnicamente desafiadores devido ao pequeno tamanho de D. rerio, o que dificulta a coleta serialde sangue 23. Assim, a maioria dos pesquisadores eutanásia peixe-zebra para obter células ALL. Isso tem sido prática comum no laboratório e na maioria dos profissionais de campo, mas impede a realização de experimentos longitudinais em animais vivos. Para superar isso, recentemente descrevemos linfócitos epiteliais T e B em escamas de peixe-zebra coletadas usando uma estratégia de biópsia de escamasnão letal 10. Outro estudo recente demonstrou um reservatório de células T em/próximo à superfície do peixe-zebra, entre as escamasadjacentes 12. D. rerio abriga centenas de escamas, que se regeneram rapidamente poucos dias após a remoção24. Juntas, esses achados e características indicam que as escamas do peixe-zebra são uma fonte de linfócitos que não requerem eutanásia, permitindo estudos longitudinais em peixes vivos.

Aqui, descrevemos um método de biópsia em escala para coletar linfócitos epidérmicos de peixe-zebra de peixes com marcadores fluoróforos específicos de linfócitos, com ou sem LLA. Para estudar células da linhagem T, usamos peixes bem estabelecidos lck:GFP e uma linha semelhante lck:mCherry; ambos marcam as células T e T-ALL 10,13,15,20. Para estudar células da linhagem B, usamos peixes transgênicos cd79a:GFP e cd79b:GFP com células B e B-ALL marcadasfluorescentemente 10,13,17. Cada uma dessas linhas permite a visualização por microscopia fluorescente e purificação celular citométricade fluxo 13. Examinamos escamas após a biópsia, gerando imagens de alta resolução de linfócitos em escamas, identificando a expressão gênica epidérmica dos linfócitos por qRT-PCR, comparando-a com a de linfócitos de outros tecidos linfoides do mesmo peixe e quantificando linfócitos por escama por citometria de fluxo/separação celular ativada por fluorescência. Em resumo, o protocolo descreve um método simples e prático para obter linfócitos de peixes-zebra vivos, incluindo amostragem longitudinal de animais individuais em múltiplos pontos temporais em uma sequência experimental. Este método tem como objetivo estudar a biologia dos linfócitos do peixe-zebra, progressão da leucemia, respostas a medicamentos ou outros desenhos experimentais longitudinais que exigem amostragens repetidas de peixes-zebra individuais. Desenvolvemos o protocolo usando peixes-zebra transgênicos adultos com populações de linfócitos marcadas fluorescentemente e o validamos para aplicações posteriores, incluindo microscopia de fluorescência, citometria de fluxo/separação celular ativada por fluorescência, análises de expressão de RNA e outros estudos ex vivo que exigiam linfócitos viáveis.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (protocolos 24-028-EAH e 25-068-CACHIR). Este protocolo apresenta uma abordagem para isolar e analisar linfócitos normais e/ou malignos das escamas de peixes-zebra vivos, com detalhes sobre o propósito, execução e princípios subjacentes a esses procedimentos.

ATENÇÃO: MS-222 é um anestésico químico perigoso e deve ser manuseado com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, como luvas de laboratório, proteção ocular e jaleco. Descarte as soluções MS-222 em conformidade com as diretrizes institucionais de resíduos químicos. Tenha cautela ao manusear agulhas e pinças para evitar ferimentos agudos. Considere todas as amostras biológicas potencialmente biohazardas e descarte resíduos de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança.

1. Preparação dos meios de triagem

  1. Suplemente 1× solução de meio RPMI 1640 com 1% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: O meio RPMI 1640 mantém a viabilidade linfócitos ex vivo. O RPMI 1640 pode ser substituído por um PBS de 0,9×. O soro bovino fetal (FBS) fornece fatores de crescimento para promover a viabilidade celular. Penicilina e estreptomicina limitam a contaminação bacteriana.
  2. Meios aliquotas em tubos microcentrífugas de 1,5 mL em volumes de 500 μL, com cada tubo destinado a escalas de 10 a 20 anos. Mantenha os tubos de separação no gelo.

2. Anestesia de peixe-zebra, triagem por microscopia de fluorescência e imagem

  1. Anestesie D. rerio com metanassulfonato tricaína (MS-222) tamponado a 0,02% preparado de acordo com as diretrizes institucionais de cuidado animal usando água do sistema de peixes.
  2. Uma vez sedado, coloque o peixe suavemente em um recipiente de cultura celular com água suficiente do sistema (mais 0,02% de MS-222) para manter a umidade durante o manuseio subsequente.
  3. Examine e fotografe peixes anestesiados usando um microscópio epifluorescente para detectar fluorescência do(s) transgene(s). Essa etapa identifica as balanças fluorescentes para biópsia.
    NOTA: Linhas que não possuem transgenes fluorescentes podem ser vistas por microscopia óptica padrão.
  4. Use fluorescência para identificar células T (lck:GFP ou lck:mPeixes cereja) ou T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP ou lck:mPeixes cereja). As células da linhagem T são brilhantemente fluorescentes nessas linhas; As células B-ALL são tenuemente fluorescentes nos fundos lck:GFP e lck:mCherry 13,15,21.
  5. Rastreie peixes rotulados com linhagem B cd79a:GFP ou cd79b:GFP (com ou sem rag2:hMYC) para células B epidérmicas e/ou B-ALL, usando GFP para selecionar as escamas para biópsia.
  6. Pratique posicionar o peixe-zebra e ajustar as configurações do microscópio antes da biópsia, se desejarem imagens
    NOTA: Imagens e biópsia requerem de 5 a 7 minutos de sedação via MS-222 0,02%. Monitore o movimento opercular continuamente. Se o movimento opercular desacelerar significativamente ou cessar, transfira imediatamente o peixe para um sistema de água sem anestesia e aborte a biópsia. Reaplique ~50–100 μL de água de peixe contendo anestésico na pele, opérculo e brânquias a cada 1–2 minutos durante a realização de imagens e biópsia para manter a umidade da superfície.

3. Coleta e preparação da balança

  1. Para posicionar o peixe para biópsia, coloque-o sedado de lado em um recipiente de cultura celular.
  2. Para evitar que o peixe escorregue durante a biópsia, use uma esponja úmida com um recorte linear ou em V e coloque-a no recipiente de cultura celular para embalar o peixe.
  3. Alternativamente, certifique-se de que o nível da água do sistema mal cubra o fundo do prato de cultivo celular (o suficiente para manter a superfície úmida) para permitir que a tensão superficial estabilize o peixe.
  4. Aplique periodicamente ~50–100 μL de MS-222 0,02% preparado em água do sistema no opérculo e nas brânquias para manter a umidade e sustentar a anestesia durante as imagens e biópsias.
  5. Realize biópsia usando microscopia de epifluorescência para selecionar escamas altamente fluorescentes enriquecidas com linfócitos ou células ALL.
  6. Colete de 10 a 20 escamas adjacentes de uma única região altamente fluorescente, preferencialmente dentro da primeira ou segunda faixa pigmentada horizontal.
    NOTA: Uma escala geralmente é suficiente para imagem. Uma coleção de 10–20 escamas normalmente gera >1.000 linfócitos de peixes WT e é recomendada para análises a jusante, como citometria de fluxo e qRT-PCR.
  7. Mão dominante (agulha): Use uma agulha de seringa calibre 31, coloque suavemente a ponta da agulha sob a borda posterior de uma escama e vire-a para frente (ou seja, cefálade). Use uma agulha estéril diferente para cada peixe. Limpar as pinças entre os peixes; Esterilize se necessário pelos procedimentos institucionais.
    NOTA: Elevar a escama com uma agulha é preferível a usar apenas pinças, pois ela levanta a balança para minimizar a raspagem superficial. Isso garante que a delicada camada epidérmica sob o cochonme permaneça aderente à superfície do escamo, o que é fundamental para maximizar o rendimento celular.
  8. Mão não dominante (pinça): Segurando a balança na posição virada para frente com a agulha, segure a superfície externa rígida da balança com a pinça. Em um movimento suave, retire a escama do bolso.
    NOTA: Pode ocorrer sangramento leve nos locais de extração de escamas, que normalmente é autolimitado.
  9. Se houver sangramento excessivo, aplique pressão suave com pinças e enxágue brevemente com 0,02% de MS-222 na água do sistema.
    NOTA: A hemostasia pode ser alcançada em segundos antes de avançar para a próxima escala.
  10. Para biópsia de múltiplas escamas, colete de 10 a 20 escamas por peixe, removendo escamas adjacentes de uma região contígua em uma faixa pigmentada horizontal, em vez de múltiplas regiões do corpo ou ambos os lados do animal.
  11. Puxe as escamas individuais sequencialmente e as mantenha nas pontas das pinças durante a coleta, com a superfície medial voltada para cima.
  12. Para evitar interferência das escamas acumuladas com a remoção subsequente da escama, vire cada escama para frente primeiro e então segure-a em sua borda posterior. Transfira as balanças para um tubo contendo meio de triagem após a coleta a cada 5 escamas, ou sempre que escamas adicionais não puderem ser retidas de forma segura nas pontas da pinça.
  13. Após a coleta de escamas, processe as amostras o mais rapidamente possível. Transferir imediatamente as escamas das pinças para tubos de 1,5 mL contendo 500 μL de meio frio de triagem sobre gelo para preservar a viabilidade celular. Descontamine as pinças entre os peixes usando etanol a 70% antes de coletar amostras subsequentes. Processar escamas de cada peixe em tubos separados durante a coleta, dissociação e análises a jusante.
  14. Após a coleta das escamas, transferir imediatamente os peixes para um tanque de recuperação com água do sistema doce, sem MS-222.
  15. Monitore o movimento opercular e o comportamento de natação até que a respiração e postura normais sejam restauradas. Observe o local da biópsia para detectar sangramento persistente ou sinais de sofrimento antes de retornar o peixe ao sistema de recirculação.
  16. Retorne o peixe ao seu aquário de origem após o equilíbrio normal e a retomada da natação.

4. Dissociação celular e filtragem

  1. Verifique as balanças na parte inferior do tubo. As escamas são facilmente visíveis a olho nu antes da dissociação. Dissocie escamas usando um homogeneizador de pilão de microtubos plásticos estéril, aplicando uma pressão manual suave e controlada por 30–60 s.
  2. Use movimentos lentos de rotação e de cima e baixo para liberar células epidérmicas, evitando o cisalhamento excessivo das escamas.
  3. Continue dissociando até que a mídia de seleção fique visivelmente turva.
    NOTA: O sucesso do procedimento é indicado pelo meio que fica turvo, indicando uma alta concentração de células liberadas em suspensão.
  4. Passe amostras homogeneizadas por um filtro de malha de nylon de 35 μm para remover detritos e gerar suspensões de célula única para citometria de fluxo/separação celular ativada por fluorescência.
  5. Se agregados celulares visíveis estiverem presentes após a filtração inicial, passe a amostra novamente por um novo filtro de malha de 35 μm imediatamente antes da análise citométrica de fluxo. Repita a filtragem no máximo 2x o total para minimizar a perda celular.

5. Análise citométrica de fluxo

  1. Analisar amostras por citometria de fluxo.
    NOTA: A citometria de fluxo pode ser realizada antes da purificação celular ativada por fluorescência ou extração de RNA para avaliar a composição da amostra.
  2. Analise suspensões de célula única usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm para detecção de GFP e um laser de 561 nm para detecção de mCherry.
  3. Exclua detritos usando parâmetros de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC). Identifique linfócitos usando a porta linfócitadescrita anteriormente 10,13,21.
  4. Exclua agregados celulares por meio de parâmetros de gate singlet (ou seja, área de SSC [SSC-A] versus altura de SSC [SSC-H]).
  5. Avalie a viabilidade celular usando iodeto de propidio (PI) ou um corante vivo/morto equivalente. Exclua células PI-positivas das análises e procedimentos de triagem subsequentes.
  6. Estabeleça portas de fluorescência usando controles de peixe-zebra não transgênicos e controles transgênicos fluorescentes de cor única. Defina populações positivas para GFP e mCherry-positivas em relação aos controles negativos.
  7. Exportar arquivos padrão de citometria de fluxo (FCS) e analisar dados usando software de análise de citometria de fluxo.

6. Separação celular ativada por fluorescência

  1. Para separar células, utilize uma separação de células ativada por fluorescência equipada com lasers de 488 nm e/ou 561 nm para detecção de GFP e mCherry.
  2. Linfócitos com gate sequencial (FSC/SSC), singletes (SSC-A versus SSC-H) e células viáveis (PI-negativas) antes da separação baseada em fluorescência.
  3. Defina populações deGFP lo, GFPhi e mCherry-positivas usando portas de fluorescência estabelecidas a partir de amostras controle negativas.
  4. Separe as populações deGFP lo, GFPhi e mCherry-positivas em tubos de coleta contendo meios de separação refrigerados.
    NOTA: Neste trabalho com a linha lck:GFP, células de GFP alto (GFP hi) versus baixo GFP (GFP lo) são linhagens de linfócitos distintas, conforme descritoanteriormente 10,13,15,21.
  5. Manter as amostras separadas no gelo e proceder imediatamente para aplicações a jusante, como isolamento de RNA.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Seguindo os passos acima, anestesiamos e examinamos peixes-zebra adultos para linfócitos fluorescentes ou LLA via microscopia. Peixes tipo selvagem (WT) lck:GFP apresentaram fluorescência principalmente na região tímica, enquanto peixes cd79b:GFP apresentaram fluorescência na região cabeça/brânquia, consistente com observaçõesanteriores 10 (Figura 1A, à esquerda). Em contraste, peixes dupla transgênica rag2:hMYC;...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este protocolo descreve um método de biópsia em escala não letal para coletar linfócitos epidérmicos de peixe-zebra, incluindo tanto linfócitos não malignos quanto células de leucemia linfoblástica aguda (LLA). Peixes-zebra são modelos bem estabelecidos para linfopoiese e malignidades linfóides, mas a maioria das abordagens para obter linfócitos requer eutanásia e dissecações teciduais, impedindo estudos longitudinais em animaisisolados 8,10,13,15.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos financeiros de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., e Brashé Wood por suas contribuições a este projeto. Os estudos foram apoiados pelo Programa Piloto de Subsídios do Centro de Câncer Stephenson da OUHSC, pelo Centro de Pesquisa em Células-Tronco Adultas de Oklahoma (OCASCR), pelos Programas de Ciência em Equipe e Bolsas de Apoio da Fundação de Saúde Presbiteriana, além da Fundação Familiar W.J. Jones. O FACS pelo Núcleo de Pesquisa em Biologia Molecular e Citometria do Centro de Câncer Stephenson da OUHSC foi financiado pelo Prêmio de Apoio ao Centro de Câncer do NCI P30 CA225520. Este estudo foi apoiado em parte por fundos da American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens é bolsista do programa "STRONG" pós-bacharelado da ACS.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents & Consumáveis:
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521Agente anestésico
Meio RPMI 1640ThermoFisher11875093Meio para viabilidade de linfócitos
Soro Bovinote FetalSigma-AldrichF2442Para viabilidade celular
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher15140122Limitar a contaminação bacteriana
Álcool 70%ThermoScientificT038181000Para esterilizar forceps
CellPro 1x PBSVWR104027-280Diluição a 0,9x com água estéril
Propidium IodideInvitrogenP1304MMPDiscriminação de células vivas/mortas para flow/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Tamanho: 12 x 12 POL. Papel filtro de 35um
Lab Pak 03-35/16		SefarPara classificação de células
Referência: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating malignant and non-malignant b cells from lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternativa para papel filtro: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Para classificação de células
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1,5 mlEppendorf®20901-551tubo de microcentrífuga para classificação de células
Seringas de Insulina VetRx U-100 UltiCare 3/10cc 31G x 5/16" Marcação de Meia UnidadeUltiCare9436Para biópsias de escamas
Prato Petri Profundo 100 x 25 mmUSA Scientific8609-0625Para biópsias de escamas
Pistolas Descartáveis Bel-Art®Bel-Art® BAF199230001Para dissociação de escamas
Conjunto de Pinças E-Z Pik 6 PeçasAven18480EZPara biópsias de escamas
Lâminas de microscópio Corning®, uma face fosca, uma extremidadeSigma-AldrichCLS294875X25Para imagens
Lâminas de vidroSigma-AldrichC8181Para imagens
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, com DAPIThermoFisherS36920Para montagem de escamas em lâmina
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Para extração de RNA
Equipamento:
Microscópio Nikon AZ100 e câmera DS-Qi1MCNikonMicroscópio de fluorescência & câmera
Sistema de PCR Touch CFX96Bio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterAnálises de citometria de fluxo
Leica SP8LeicaMicroscópio confocal
Software:
Software de análise Kaluza versão 2.1Beckman-CoulterAnálises de citometria de fluxo
Referência: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
Software LAS-X versão 3.7.4.23463LeicaMicroscópio confocal
Referência: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Referências

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Pesquisa sobre o C ncerEdi o 234Edi o 234Valor VazioEdi olinf citoLLAepit liosLeucemiaepiderme
Vídeo em breve
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.