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Dissecação de Aedes albopictus e Extração de RNA Total a Partir de Tecidos Pós-Dissecação

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DOI:

10.3791/72811

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30 de outubro de 2026

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresenta-se um protocolo para dissecar o intestino médio, os ovários e as glândulas salivares de Aedes albopictus, seguido da extração de RNA total para a caracterização molecular de tecidos vetoriais em estudos de transmissão de vírus transmitidos por mosquitos.

Resumo

Em Foshan, província de Guangdong, China, em julho de 2025, ocorreu um surto de dengue e chikungunya. Ae. albopictus é um vetor principal desses vírus. Este protocolo descreve um método simples e padronizado para dissecar o intestino médio, as glândulas salivares e os ovários de Ae. albopictus e extrair RNA total dos tecidos dissecados. Mosquitos fêmeas com três dias de idade, não alimentados com sangue, foram anestesiados por congelamento a −20 °C por 2 min, após o que os tecidos-alvo foram dissecados. O RNA total foi extraído com um kit de extração de RNA de tecidos, quantificado por um espectrofotômetro de microvolume e utilizado para análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Os resultados mostram que o método de dissecação separa rapidamente e completamente os tecidos e que o RNA dos tecidos separados pode atingir pureza relativamente alta. A RT-qPCR demonstrou os padrões de expressão e a estabilidade relativa de três genes de referência (GAPDH, β-actin e RPS6). O método é direto, validado e fornece suporte técnico padronizado para pesquisas relacionadas ao Ae. albopictus.

Introdução

Aedes albopictus (Ae. albopictus) é um vetor de diversos patógenos, incluindo o vírus da dengue (DENV) e o vírus chikungunya (CHIKV)1,2,3. Está amplamente distribuído e causou surtos de doenças transmitidas por mosquitos em muitas regiões4,5. A capacidade de Ae. albopictus transmitir patógenos, conhecida como competência vetorial, varia entre populações e está associada à expressão gênica específica em intestinos médios, ovários e glândulas salivares6. Compreender a estrutura desses tecidos e extrair RNA de alta qualidade são essenciais para entender a replicação, disseminação e transmissão de vírus transmitidos por vetores7.

A detecção da expressão gênica relativa por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) depende da dissecação precisa de tecidos de Ae. albopictus e da extração de RNA de alta qualidade8,9. Até o momento, os protocolos em vídeo publicados para a dissecação do intestino médio, ovários e glândulas salivares concentraram-se principalmente em Aedes aegypti10. Portanto, este protocolo demonstra a dissecação do intestino médio, ovários e glândulas salivares de Ae. albopictus, em que os tecidos dissecados são colocados diretamente em tubos de moagem contendo solução de preservação de RNA, evitando etapas de transferência de tecidos e minimizando perdas durante a transferência. O RNA total é extraído dos tecidos dissecados utilizando um método baseado em coluna, que exige menos etapas de manipulação e menos tempo do que o método convencional com TRIzol11. Essa extração geralmente fornece de 0,1 a 0,3 µg de RNA total das glândulas salivares de cinco Ae. albopictus, com razões A260/A280 entre 1,8 e 2,0, atendendo aos requisitos de pureza para RT-qPCR subsequente. A RT-qPCR é realizada para medir a expressão de três genes de referência em diferentes tecidos de Ae. albopictus, avaliando assim a qualidade do RNA extraído de cada tecido.

Deve-se observar que este protocolo foi validado apenas para o intestino médio, ovários e glândulas salivares de fêmeas de Ae. albopictus com três dias de idade e que não se alimentaram de sangue, e não é adequado para a extração de RNA do corpo gorduroso. A obtenção de tecidos intactos e individuais é a base para análises subsequentes. Por meio da dissecação sistemática dos tecidos de Ae. albopictus e da extração de RNA de alta qualidade, este protocolo fornece suporte técnico para a detecção subsequente de expressão gênica, avaliação da competência vetorial em nível populacional e controle da transmissão de arbovírus.

Protocolo

Este estudo utilizou somente mosquitos  Ae. albopictus criados em laboratório. Assim sendo, não foi necessária aprovação ética institucional para este estudo. A linhagem de  Ae. albopictus utilizada neste experimento foi fornecida pelo Laboratório Chave para Controle e Prevenção de Doenças Parasitárias da Comissão Nacional de Saúde da China (Jiangsu). Esta colônia foi originalmente coletada na cidade de Wuxi na década de 1980 e tem sido mantida no insetário do  Instituto de Doenças Parasitárias de Jiangsu em condições padrão. A colônia de mosquitos foi mantida em uma câmara climática artificial a 25 °C ± 1 °C, umidade relativa de 75% ± 5%, com fotoperíodo de 10 h de luz e 14 h de escuro. As larvas foram criadas em água ultrapura e alimentadas com uma mistura de pó de fígado de porco e extrato de levedura (Cervejaria de Xangai) na proporção de 2:1. Mosquitos adultos foram mantidos com uma solução de glicose a 5%. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação dos materiais

  1. Preparação das soluções
    1. Preparação do tampão PBS 1x: Pese 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4. Dissolva em 800 mL de água ultrapura com agitação. Ajuste o pH para 7,4. Complete o volume final para 1 L. Autoclave a 121 °C por 20 min.
    2. Preparação da solução de DEPC: Adicione 1 mL da solução estoque de DEPC a 1 L de água ultrapura. Agite vigorosamente em um agitador magnético por 12–16 h. Autoclave a 121 °C por 20 min.
      CAUTION: O DEPC é altamente tóxico e carcinogênico. Use luvas e óculos de proteção e manipule em capela.
      NOTE: Cubra o béquer com papel alumínio durante a agitação vigorosa. Aliquote a solução de DEPC e armazene a -20 °C por até 6 meses.
  2. Preparação dos materiais descartáveis
    1. Esterilize os instrumentos de dissecação: Coloque as agulhas de dissecação de 1 mm e pinças de ponta fina em um recipiente de alumínio e autoclave a 121 °C por 20 min.
    2. Prepare tubos de moagem de 2 mL contendo esferas de sílica de 0,5–1,0 mm. Coloque em um recipiente de alumínio e autoclave a 121 °C por 20 min.
    3. Adicione 200 µL da solução de preservação de RNA fornecida no kit a cada tubo de moagem.
      NOTE: A qualidade do RNA nos tecidos diminui significativamente dentro de 1 min após a remoção do organismo. Prepare os tubos de moagem com a solução de preservação com antecedência.

2. Coleta de Ae. albopictus

OBSERVAÇÃO: Use jalecos brancos e luvas. Não use roupas escuras, pois cores escuras atraem mosquitos.

  1. Feche todas as portas, janelas e sistemas de ventilação do ambiente que contém a gaiola de mosquitos para evitar a fuga de Ae. albopictus.
  2. Ligue o aspirador elétrico e insira-o na gaiola de mosquitos. Direcione o aspirador para os Ae. albopictus pousados nas paredes internas da gaiola e colete os mosquitos.
  3. Mantenha o aspirador ligado enquanto o retira lentamente da gaiola. Selo imediatamente a gaiola e feche a tampa do aspirador.
  4. Remova a câmara de coleta e coloque-a a -20 °C por 2 min para imobilização a frio de Ae. albopictus.
  5. Coloque um recipiente de vidro de 10 cm sobre gelo para pré-resfriamento. Transfira os Ae. albopictus imobilizados da câmara de coleta para o recipiente de vidro.
    NOTA: Controle rigorosamente o tempo de imobilização a frio para evitar danos teciduais.

3. Identificação de fêmeas de Ae. albopictus antes da dissecação

  1. Selecione Ae. albopictus com morfologia intacta e anestesiados com frio do recipiente de vidro e transfira-os para uma lâmina de vidro. Examine ao microscópio estereoscópico com ampliação de 80x.
  2. Identifique a faixa longitudinal branca no mesonoto.
  3. Confirme as faixas brancas na base dos segmentos tarsais e na base dos tergitos abdominais II-VI12.
  4. Examine as antenas com ampliação de 80x. Diferencie antenas filiformes (fêmea) de antenas plumosas (macho) para identificar as fêmeas.

4. Dissecação abdominal de Ae. albopictus

  1. Coloque três gotas de PBS 1x estéril da esquerda para a direita sobre uma lâmina de vidro esterilizada, com cada gota com volume aproximado de 20 µL e espaçadas cerca de 5 mm entre si.
    NOTA: As gotas de PBS devem ser grandes o suficiente para submergir inteiramente o Ae. albopictus.
  2. Use pinças finas para segurar as asas do Ae. albopictus e coloque o mosquito na gota de PBS mais à esquerda.
  3. Oriente o Ae. albopictus com o lado ventral voltado para cima. Use a mão esquerda para segurar uma agulha de dissecação e pressione o segundo segmento abdominal para imobilizar o Ae. albopictus.
  4. Com a mão direita, insira uma agulha de dissecação de 1 mm no ponto médio do sexto segmento abdominal. Faça uma incisão transversal, semicircular, para abrir a cavidade abdominal.
  5. Mova a agulha de dissecação mantida na mão direita aproximadamente 2 mm para trás e pressione a região média dos segmentos abdominais VI–VIII para fixar o abdômen.
    NOTA: Os ovários estão localizados dorsalmente nos segmentos abdominais II-VI. Não mova a agulha aleatoriamente ao pressionar os segmentos VI-VIII para evitar danificar a morfologia intacta dos ovários.
  6. Com a mão esquerda, segure o segundo segmento abdominal com a agulha de dissecação e puxe suavemente para fora, separando o abdômen no sexto segmento. Durante a separação, o intestino anterior, o intestino médio e os túbulos de Malpighian serão totalmente expostos.
    NOTA: Os túbulos de Malpighian são brancos e finos. O intestino médio é semitransparente e fusiforme.
  7. Se pare o intestino médio do intestino anterior e do intestino posterior. Lave o intestino médio na gota central de PBS duas vezes.
  8. Transfira-o para um tubo de moagem contendo 200 µL da solução de preservação de RNA fornecida no kit comercial de extração de RNA.
  9. Pressione o meio do oitavo segmento abdominal com a agulha de dissecação para expor os ovários pareados em ambos os lados. Remova os ovários, lave-os duas vezes na gota central de PBS e transfira-os para um tubo de moagem contendo 200 µL de solução de preservação de RNA.
    NOTA: Os ovários pareados são simétricos, com formato semelhante a grãos de arroz e de cor branco-esbranquiçada. Manipule com cuidado para garantir a integridade estrutural dos ovários durante a coleta.

5. Dissecação da glândula salivar de Ae. albopictus

  1. Aumente a ampliação do microscópio para 400x. Transfira o abdômen dissecado de Ae. albopictus para a gota de PBS mais à direita.
  2. Aplicar pressão suave sobre o mesotórax com a agulha de dissecação da mão esquerda até que a cabeça seja ligeiramente elevada.
  3. Use a mão direita para levantar a cabeça no nível do colo com a agulha de dissecação e puxe lentamente para fora. Observe as glândulas salivares (estrutura trilobada) enquanto se soltam do tórax junto com a cabeça.
    NOTA: As glândulas salivares estão localizadas no tórax anterior e se conectam à cabeça por meio do ducto salivar. Aplicar pressão constante sobre o tórax evita a ruptura do ducto salivar e permite que as glândulas salivares se soltem intactas do tórax junto com a cabeça. O controle da força nesta etapa exige prática repetida.
  4. Sequencie as glândulas salivares da cabeça. Enxágue-as duas vezes na gota central de PBS e transfira-as para um tubo de moagem preparado.
    NOTA: As glândulas salivares têm aproximadamente 1 mm de tamanho. Transfira-as para um tubo de moagem contendo 200 µL de solução de preservação de RNA e observe sob uma fonte de luz branca para confirmar a presença de pequenas partículas brancas flutuando na solução.

6. Extração de RNA de Ae. albopictus e suas glândulas salivares, ovários e intestino médio

OBSERVAÇÃO: Todas as etapas de extração de RNA foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante do kit comercial de extração de RNA de tecido, sem modificações.

  1. Pré-resfrie o homogeneizador de tecidos a 4 °C. Configure os parâmetros para 30 Hz, tempo de homogeneização de 30 s, 10 ciclos e tempo de pausa de 8 s.
  2. Coloque os tubos de moagem contendo as amostras de tecido no homogeneizador e execute o programa.
    NOTA: Após a homogeneização, verifique se o tecido está completamente disperso na solução de preservação de RNA. Se a homogeneização estiver incompleta, execute mais 5 ciclos.
  3. Transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 5 min.
  4. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Adicione 30 µL de clorofórmio.
    CAUTELA: O clorofórmio é tóxico e carcinogênico. Use luvas e óculos de segurança e manipule em capela de exaustão.
  5. Agite vigorosamente em vórtex por 20 s. Incube em temperatura ambiente por 15 min, depois centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 15 min.
    NOTA: Aspire cuidadosamente a fase aquosa superior, evitando a camada branca intermediária para prevenir contaminação por proteínas.
  6. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Adicione 75 µL de isopropanol.
  7. Misture por inversão e transfira toda a mistura para uma coluna de sílica em spin. Centrifugue a 12.000 x g por 1 min.
  8. Adicione 600 µL de tampão de lavagem à coluna. Centrifugue a 12.000 x g por 30 s. Descarte o fluxo passante.
  9. Adicione 600 µL de etanol 80% à coluna. Centrifugue a 12.000 x g por 30 s. Descarte o fluxo passante. Repita este passo de lavagem uma vez, totalizando duas lavagens.
  10. Adicione 30 µL de água DEPC ao centro da membrana da coluna. Incube em temperatura ambiente por 1 min.
  11. Coloque a coluna em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Centrifugue a 12.000 x g por 1 min para eluir o RNA.
  12. Retire 1 µL do RNA eluído e meça a concentração e pureza utilizando um espectrofotômetro de microvolume.

7. Transcrição reversa de RNA

  1. Preparação do sistema de reação
    1. Deixe descongelar em gelo a mistura-mestra de transcrição reversa 4x, água livre de nucleases e o molde de RNA.
    2. Em um tubo de PCR de 200 µL, prepare um sistema de reação de 20 µL adicionando 5 µL da mistura-mestra 4x de transcrição reversa, 10 µL do molde de RNA total e 5 µL de água livre de nucleases.
    3. Centrifugue brevemente a 1.000 x g durante 1 min para recolher a mistura de reação no fundo do tubo.
    4. Coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute o programa de transcrição reversa: 50 °C por 5 min; 85 °C por 5 s.
      NOTA: Dilua o produto da transcrição reversa 20 vezes antes do uso para reduzir o efeito de inibidores potenciais na RT-qPCR.

8. PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)

  1. Preparação do sistema de reação de RT-qPCR
    1. Deixe descongelar em gelo a mistura-mestra 2x SYBR Green qPCR, o molde de cDNA e os primers direto e reverso a 10 µM, protegidos da luz durante todo o processo.
    2. Em uma placa de PCR de 96 poços, prepare um sistema de reação de 20 µL por poço adicionando 10 µL da mistura-mestra 2x SYBR Green qPCR, 0,8 µL de cada primer (direto e reverso) a 10 µM (concentração final de 400 nM), 2 µL do molde de cDNA diluído 20 vezes e 6,4 µL de água livre de nucleases.
    3. Sobreponha a placa de 96 poços com uma película adesiva óptica, garantindo que todos os poços estejam completamente selados.
    4. Centrifugue a 1.000 x g durante 1 min para recolher a mistura de reação no fundo dos poços.
    5. Coloque a placa de PCR no sistema de detecção em tempo real e inicie o programa de ciclagem térmica.
      NOTA: Programa de ciclagem térmica: pré-desnaturação a 95 °C por 30 s (1 ciclo); amplificação: 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s (40 ciclos); análise da curva de dissociação: 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min, aumento até 95 °C a 0,15 °C/s. Cada amostra de RNA de tecido é submetida à qPCR em quatro réplicas técnicas. Cada amostra de tecido consiste em tecidos agrupados de 5 Ae. albopictus. As sequências dos primers utilizados para RT-qPCR estão listadas na Tabela 1.
  2. Análise de dados
    1. Verifique a curva de dissociação de cada par de primers para confirmar um único pico de dissociação bem definido.
    2. Exporte os valores de Ct do software do equipamento. A construção de gráficos e a análise de dados são realizadas utilizando software estatístico e de criação de gráficos.
Nome dos iniciadoresSequências dos iniciadores (5'-3')
Ae. albopictus β-actina Primer Direto GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus βPrimer Reverso de -actinaTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus Primer direto de GAPDHCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus Primer Reverso de GAPDHTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus Primer Direto RPS6ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6, Primer ReversoCTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tabela 1: Sequências dos iniciadores de Ae. albopictus utilizadas na RT-qPCR.

Resultados

Este estudo compreende duas partes: dissecação de Ae. albopictus e extração de RNA a partir dos tecidos pós-dissecação. O fluxo de trabalho geral é apresentado na Figura 1, onde a Figura 1A ilustra a dissecação de Ae. albopictus e a Figura 1B ilustra a extração de RNA e a subsequente detecção dos níveis de expressão de genes de referência.

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Figura 1: Esquema da dissecação de Ae. albopictus e extração de RNA total a partir de tecidos pós-dissecação. (A) Coleta, anestesia e dissecação de Ae. albopictus. (B) Extração de RNA a partir de tecidos pós-dissecação, identificação da pureza e detecção dos níveis de expressão de genes de referência. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Cinco Ae. albopictus criados em laboratório foram dissecados para isolar o intestino médio, as glândulas salivares e os ovários. Com uma ampliação de 80×, o intestino anterior transparente, o intestino médio e o intestino posterior de Ae. albopictus eram nitidamente visíveis, com os ovários semelhantes a grãos posicionados em ambos os lados e cobertos pelos túbulos de Malpighian brancos (Figura 2A). Quando o campo foi ajustado para 400×, as glândulas salivares translúcidas de Ae. albopictus tornaram-se claramente observáveis (Figura 2B). Figura 2C,D ilustram os tecidos isolados do intestino médio e dos ovários. Os resultados indicaram que os tecidos isolados por meio deste método de dissecação preservaram sua integridade estrutural, o que é essencial para a extração subsequente de RNA total a partir dos espécimes pós-dissecação.

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Figura 2: Análise pós-dissecação dos tecidos de Ae. albopictus. (A) Tecidos isolados do abdômen de Ae. albopictus. (B) Glândulas salivares translúcidas e trilobadas de Ae. albopictus. (C) Foregut e intestino médio de Ae. albopictus. (D) Ovários pareados com formato semelhante a grãos de arroz de Ae. albopictus. I: foregut; II: intestino médio; III: intestino posterior; IV: túbulos de Malpighian; V: ovários. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

O RNA total foi extraído de tecidos dissecados de Ae. albopictus. As amostras de tecido (glândulas salivares, intestino médio e ovários) foram completamente homogeneizadas antes da extração. As concentrações de RNA variaram conforme o tipo de tecido: as glândulas salivares apresentaram 7,8 ng/µL, enquanto o intestino médio, os ovários e os homogenados de corpo inteiro de fêmeas de Ae. albopictus apresentaram 55,3, 45,7 e 42,7 ng/µL, respectivamente. Todas as amostras exibiram alta pureza, com razões A260/A280 entre 1,87 e 2,10 e razões A260/A230 entre 1,73 e 2,13 (Tabela 2). Os níveis de expressão de três genes de referência candidatos (GAPDH, β-actin e RPS6) foram avaliados por RT-qPCR em todos os tecidos. Embora sua expressão tenha variado um pouco com a concentração de RNA, os três genes permaneceram relativamente estáveis em diferentes tipos de tecido (Figura 3). GAPDH, β-actin e RPS6 são adequados como genes de referência estáveis para normalização da expressão gênica em diferentes tecidos de Ae. albopictus.

TecidoNúmero de amostrasConc. de RNA (ng/μL)A260/A280A260/A230
Glândula salivar57,81,871,73
Intestino médio555,31,941,98
Ovário545,72,102,13
Fêmea142,72,041,92

Tabela 2: Concentração e pureza de RNA extraído de tecido de Ae. albopictus.

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Figura 3: Valores de Ct de genes de referência (GAPDH, β-actin e RPS6) detectados por RT-qPCR. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Ae. albopictus está amplamente distribuído em regiões temperadas, subtropicais e tropicais em todos os continentes, exceto na Antártida13,14. Como vetor importante de arbovírus, como o vírus da dengue (DENV), o vírus Zika (ZIKV) e o vírus chikungunya (CHIKV), causou repetidamente surtos de doenças transmitidas por mosquitos em Guangdong, na China15.

Para auxiliar pesquisas sobre vírus relacionados a Ae. albopictus e sua transmissão, desenvolvemos um método simples para a dissecação de tecidos de Ae. albopictus. Nos protocolos convencionais de dissecação, quando a cabeça é separada do tórax durante a dissecação das glândulas salivares, estas podem permanecer aderidas ao tórax ou à cabeça, dependendo da força aplicada; como as glândulas salivares têm aproximadamente 1 mm de tamanho, localizá-las dentro do tórax torna-se difícil16. Este método aprimora os protocolos padrão de isolamento de órgãos de mosquitos e otimiza a separação das glândulas salivares localizadas sob os esternitos prosternal e mesosternal, que devem ser observadas com ampliação de 400×17. Para realizar a dissecação, pressione suavemente o mesotórax com uma agulha enquanto utiliza outra para aplicar pressão que separe a cabeça, permitindo que as glândulas salivares se soltem intactas. Essa abordagem evita a necessidade de procurar as glândulas salivares dentro do tórax, previne contaminação e danos às glândulas e reduz o tempo total de dissecação. Os ovários estão localizados próximo aos segmentos abdominais VI–VIII e são preservados iniciando a dissecação a partir do sexto segmento abdominal e removendo cuidadosamente o intestino médio, os túbulos de Malpighian e os ovários do abdômen18. Este método produz glândulas salivares intactas, formas típicas de ovários livres de aderências e um intestino médio ininterrupto (Figura 2). Essa técnica de dissecação fornece orientação valiosa para estudos sobre Ae. albopictus e a replicação, disseminação e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

A extração de RNA de tecidos de Ae. albopictus é fundamental para a detecção de vírus transmitidos por mosquitos. O método convencional com TRIzol é demorado e tecnicamente exigente, mas geralmente fornece altos rendimentos de RNA e pode produzir RNA de alta qualidade quando realizado corretamente. Em contraste, o método baseado em coluna oferece melhor reprodutibilidade e é mais fácil de executar, mas pode resultar em menor recuperação de RNA e apresenta desempenho ineficiente quando aplicado ao corpo gorduroso19,20. Neste estudo, os tecidos dissecados foram imediatamente preservados em um estabilizador de ácidos nucleicos, macerados completamente e processados utilizando o método de coluna de centrifugação para extração de RNA destinado à síntese de cDNA21. Para garantir uma normalização precisa dos dados de RT-qPCR diante das variações na qualidade do cDNA, são necessários genes de referência estáveis22. Embora genes de referência já tenham sido estabelecidos para diversos estágios de desenvolvimento de Ae. albopictus, os genes de referência específicos para tecidos exigem validação adicional23,24. A análise por RT-qPCR do RNA transcrito reversamente a partir de todos os tecidos dissecados revelou amplificação consistente de GAPDH, β-actin e RPS6, confirmando que a qualidade do RNA obtida por meio deste protocolo de dissecação é suficiente para sustentar estudos downstream de expressão gênica específica por tecido em Ae. albopictus.

Durante a dissecação dos tecidos de Ae. albopictus com este protocolo, pode ocorrer ocasionalmente a falha nas glândulas salivares em se destacarem junto com a cabeça. Isso geralmente resulta da pressão insuficiente aplicada ao tórax combinada com a separação excessivamente rápida da cabeça. Para resolver isso, aplique pressão constante no mesotórax e puxe lentamente a cabeça para fora, permitindo que as glândulas salivares se soltem intactas com a cabeça. Ao transferir as glândulas salivares para um tubo de moagem contendo solução de preservação de RNA, examine cuidadosamente a solução contra uma fonte de luz em busca de pequenas partículas brancas flutuantes. Se as glândulas salivares não puderem ser localizadas no tubo, verifique imediatamente se ainda estão presas à agulha de dissecação. Durante a extração de RNA, siga rigorosamente o protocolo do fabricante do kit. Se a concentração de RNA obtida for baixa, uma segunda eluição com o tampão de eluição pode ser realizada. Na RT-qPCR, podem ocorrer múltiplos picos na curva de dissociação; nesse caso, primeiramente verifique a especificidade dos iniciadores. Se os valores de Ct forem altos, ajuste a temperatura de pareamento do programa de acordo com a temperatura de fusão dos iniciadores. Em geral, a temperatura de pareamento no programa deve ser definida 1–2 °C abaixo da temperatura de fusão dos iniciadores25.

Este estudo apresenta algumas limitações. O escopo da amostra é relativamente restrito, concentrando-se apenas no intestino médio, glândulas salivares e tecidos ovarianos, sem investigar outros tecidos como os túbulos de Malpighian e o corpo gorduroso26. Além disso, a análise foi limitada a fêmeas de mosquitos criadas em laboratório com três dias de idade, excluindo indivíduos alimentados com sangue e infectados pelo vírus27. Melhorias futuras devem incluir a ampliação do escopo da amostra para abranger tecidos como os túbulos de Malpighian e considerar indivíduos de Ae. albopictus em diferentes estados fisiológicos.

Em resumo, a dissecação do intestino médio, ovários e glândulas salivares de Ae. albopictus, seguida da extração de RNA total, fornece uma base técnica para avaliações subsequentes da competência vetorial e estudos de transmissão de arbovírus.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipeta Pasteur extra longa de 3 mLWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 rxns
Kit HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix para qPCRVazymeR433-01100 rxns
Kit de Extração de RNA Total MicroMedTechMDT-CFR07100T/caixa
Micropipetas 0,5-10μLEppendorf4043444
Lâminas para microscopiaCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MicrosspectrofotômetroKAIAOK5600C
Tampão de extração de ácidos nucleicosMedTechMDT-TP01100 mL
PBS Tampão Fosfato Salino (Esterilizado)ServicebioG4202500 mL
Ciclador Térmico para PCREppendorfMastercycler X50s
Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudioTM 7 ProApplied biosystemsEN61326-1
Conjunto de Microscópio Stemi 305 LABZEISS435063-9010-000

Referências

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