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Artigo de método

Modelos Celulares para o Estudo da Doença de Alexander: Análise Funcional de Astrócitos Primários de Rato

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DOI:

10.3791/72930

⸱

8 de setembro de 2026

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University, 2School of Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um modelo primário de astrócitos de rato que fornece um sistema fisiologicamente relevante para o estudo da doença de Alexander (AxD), permitindo a investigação da agregação de GFAP, modificações patológicas e disfunção dos astrócitos. Este sistema integra estudos in vitro e in vivo, oferecendo uma plataforma robusta para explorar a patologia da AxD e identificar alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas.

Resumo

Os astrócitos desempenham um papel fundamental na manutenção da homeostase do sistema nervoso central, no suporte da função neuronal e na resposta a lesões ou doenças. A disfunção da atividade dos astrócitos é cada vez mais reconhecida como um fator-chave em distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alexander (AxD), uma condição rara e fatal causada por mutações na proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Essas mutações resultam em agregação da GFAP, formação de fibras de Rosenthal e disfunção progressiva dos astrócitos. Embora modelos animais in vivo ofereçam um ambiente celular complexo, tanto os modelos in vitro quanto os in vivo atuais apresentam limitações na replicação precisa do contexto celular intricado e das funções dos astrócitos. Para resolver isso, desenvolvemos um modelo celular utilizando astrócitos primários de ratos selvagens (WT) e de ratos modelo de AxD para estudar os efeitos funcionais das mutações na GFAP. Esse sistema fisiologicamente relevante permite a investigação detalhada de mecanismos específicos dos astrócitos, incluindo agregação da GFAP, respostas ao estresse oxidativo e modificações patológicas. Para pesquisadores sem acesso a ratos modelo de AxD, a transdução com lentivírus oferece um método alternativo para introduzir mutações na GFAP associadas à AxD em astrócitos derivados de ratos normais, ampliando assim a aplicabilidade dessa abordagem. Em comparação com linhagens celulares de astrócitos imortalizadas ou estudos in vitro com proteínas recombinantes, os astrócitos primários preservam melhor a arquitetura celular nativa e os perfis moleculares, oferecendo uma plataforma robusta para estudar a dinâmica e a solubilidade da GFAP, bem como as respostas astrocitárias a estressores como danos oxidativos e modificações patológicas. Esse modelo celular preenche a lacuna entre estudos moleculares e sistêmicos, fornecendo um arcabouço experimental controlado para explorar a disfunção dos astrócitos na AxD. Ao complementar as metodologias existentes, os cultivos de astrócitos primários aprimoram nossa compreensão da patologia da AxD e representam uma ferramenta valiosa para identificar possíveis alvos terapêuticos em doenças neurodegenerativas.

Introdução

Os astrócitos são células gliais especializadas que percorrem todo o sistema nervoso central (SNC), desempenhando papéis fundamentais na manutenção da homeostase cerebral, na regulação da atividade neuronal e na resposta a lesões ou doenças1. Suas funções incluem a remoção e reciclagem de neurotransmissores, a homeostase iônica e hídrica extracelular e o suporte à função dos circuitos neurais. Moléculas secretadas pelos astrócitos são essenciais para o desenvolvimento sináptico e para a plasticidade sináptica no cérebro adulto2. Em resposta a lesões ou doenças no SNC, os astrócitos sofrem alterações reativas que podem mediar sinalizações pró- ou anti-inflamatórias, permitindo funções neuroprotetoras, mas potencialmente contribuindo para patologias do SNC, dependendo do contexto3. A desregulação da função dos astrócitos é cada vez mais reconhecida como um fator-chave na saúde e na doença do SNC4,5.

A proteína ácida fibrilar glial (GFAP), uma proteína do filamento intermediário (FI) do tipo III, é um componente citoesquelético principal dos astrócitos, expressa pela maioria, mas não todos, os astrócitos. A GFAP é regulada positivamente em resposta a lesões no SNC, servindo como marcador da gravidade do dano tecidual6. Embora a GFAP seja tradicionalmente associada a funções estruturais7, suas implicações funcionais ainda permanecem pouco exploradas. Mutações na GFAP causam a doença de Alexander (AxD)8, um distúrbio neurodegenerativo raro caracterizado pelo acúmulo de GFAP, formação de fibras de Rosenthal e disfunção progressiva dos astrócitos. Embora estudos bioquímicos in vitro9,10,11 e modelos animais in vivo12,13 tenham fornecido informações sobre a patologia da AxD, eles não conseguem capturar o contexto celular complexo da função dos astrócitos14.

Para superar essas limitações, desenvolvemos um modelo celular utilizando astrócitos primários de ratos selvagens (WT) e de ratos modelo de AxD13. Este sistema preserva a arquitetura celular nativa e os perfis moleculares dos astrócitos, permitindo o estudo do acúmulo de GFAP, das respostas ao estresse oxidativo e das modificações patológicas associadas à AxD. Para pesquisadores sem acesso a ratos modelo de AxD, a transdução com lentivírus oferece um método alternativo para introduzir mutações de GFAP associadas à AxD em astrócitos derivados de ratos normais10.

Em comparação com linhagens celulares imortalizadas, astrócitos primários preservam a heterogeneidade e a complexidade das populações de astrócitos in vivo, fornecendo uma plataforma fisiologicamente relevante para investigar mecanismos específicos de astrócitos15. Diferentemente de estudos in vitro que utilizam proteínas recombinantes9, astrócitos primários expressam naturalmente GFAP e outros marcadores específicos de astrócitos, permitindo o estudo de variantes associadas a doenças em um ambiente celular nativo10,16,17. Além disso, astrócitos primários facilitam a investigação de respostas funcionais a estímulos de estresse, como danos oxidativos18 e inflamação19, os quais são difíceis de reproduzir em sistemas in vitro simplificados.

Na pesquisa sobre a doença de Alexander (AxD), astrócitos primários complementam abordagens bioquímicas e in vivo ao preencher a lacuna entre estudos moleculares e sistêmicos. Enquanto os ensaios bioquímicos focam nas propriedades moleculares das mutações em GFAP, eles carecem de complexidade celular; por outro lado, modelos in vivo capturam efeitos sistêmicos, mas são menos adequados para estudos celulares mecanicistas. Os astrócitos primários fornecem um sistema intermediário com complexidade celular e controle experimental, alinhando-se às tendências atuais na pesquisa de doenças neurodegenerativas, que enfatizam modelos celulares para compreender os mecanismos da doença e identificar alvos terapêuticos20.

Este manuscrito apresenta o desenvolvimento e a aplicação de astrócitos primários de rato como modelo celular para a pesquisa da DxA. Ao permitir a comparação direta entre astrócitos WT e DxA, esta abordagem supera limitações importantes de técnicas alternativas e amplia a acessibilidade por meio da transdução com lentivírus. Esses achados contribuem para uma compreensão mais profunda da disfunção dos astrócitos na DxA e oferecem uma ferramenta valiosa para o avanço de descobertas terapêuticas em doenças neurodegenerativas.

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Protocolo

Os animais utilizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Colégio de Ciências da Vida e Medicina da Universidade Nacional Tsing Hua (NTHU IACUC Aprovação nº 109088 e 111060) e estão em conformidade com as diretrizes do Manual de Agricultura para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação dos meios, lamínulas, placas e placas de cultura 

  1. Antes de começar, certifique-se de que as seguintes soluções (Tabela 1) foram preparadas e estão prontas para uso.
  2. Esterilize as tesouras e pinças por autoclavagem antes do uso para garantir a esterilidade.
  3. Prepare a solução de poli-L-lisina (PLL) a 0,02 mg/mL em tampão de ácido bórico.
  4. Adicione quantidade suficiente da solução de PLL para cobrir completamente a superfície do lamínula ou o fundo do recipiente/placa de cultura. Certifique-se de que o revestimento seja uniforme.
  5. Deixe os lamínulas e recipientes revestidos com PLL incubarem durante a noite à temperatura ambiente em uma cabine de fluxo laminar.  
  6. No dia seguinte, remova cuidadosamente a solução de PLL. Lave os lamínulas ou recipiente/placa revestidos três vezes com água estéril fresca para remover qualquer resíduo de PLL.
    NOTA: É fundamental lavar completamente o frasco/placa revestido com PLL, ou os lamínulas, para remover o PLL residual que possa afetar negativamente a viabilidade celular. 

2. Preparação de cultura primária de astrócitos

OBSERVAÇÃO: Uma visão geral esquemática é mostrada na Figura 1.

  1. Após a indução de hipotermia colocando as crias sobre gelo, decapite a cria de rato do 1º ao 3º dia pós-natal e separe a cabeça do corpo.
  2. Coloque a cabeça em uma placa de 60 mm e fixe as laterais com pinças. Usando tesoura fina, dissecar cuidadosamente a pele na parte superior da cabeça.
  3. Faça uma incisão no vértice da cabeça usando uma tesoura fina para abrir cuidadosamente o crânio. Separe e remova suavemente as duas metades do crânio.
  4. Usando pinças, separe o cérebro pela base e transfira-o para uma placa de 60 mm contendo meio de dissecação.
  5. Posicione cada hemisfério com a superfície medial voltada para cima para expor as estruturas da linha média.
  6. Sob um microscópio estereoscópico, remova cuidadosamente os tecidos do mesencéfalo e do tronco encefálico, deixando os hemisférios intactos, contendo o córtex e o hipocampo.
  7. Use pinças finas para remover suavemente as meninges, idealmente como uma única peça. Verifique cuidadosamente a presença de meninges remanescentes escondidas nas fissuras e remova-as completamente.
  8. Transfira o tecido cerebral dissecado para uma cabine de fluxo laminar. Aspire o meio de dissecação utilizando uma pipeta de 1 mL e adicione meio de dissecação fresco.
  9. Pique finamente o tecido utilizando uma lâmina de bisturi estéril.
  10. Transfira o tecido picado para 5 mL de meio de dissociação em um tubo de 15 mL. Incube o tubo em um banho a 37ºbanho-maria a C por 15 min, agitando suavemente o tubo a cada 5 min para garantir uma adequada interação entre a enzima e o tecido.
  11. Após a incubação, deixe o tecido sedimentar no fundo do tubo. Aspire o sobrenadante e adicione 5 mL de meio de dissecação.
  12. Inverta o tubo 5 vezes para lavar o tecido. Deixe o tubo em repouso por 3 min para permitir que o tecido sedimente e repita o processo de lavagem três vezes utilizando meio de dissecação fresco.
  13. Após a lavagem final, remova o sobrenadante e adicione 2,5 mL de meio de dissectação e 2,5 mL de meio de manutenção.
  14. Triture o tecido passando a solução para cima e para baixo 10 a 15 vezes usando uma pipeta de 10 mL.
  15. Deixe o tubo em repouso por 3 min para permitir que o tecido se sedimente. Transfira o sobrenadante (contendo células) para um novo tubo cônico de 50 mL.
  16. Adicione 5 mL de meio MEM ao tubo original contendo o tecido sedimentado. Pipete de 10 a 15 vezes com uma pipeta de 10 mL até que a maioria dos fragmentos desapareça.
  17. Passe a suspensão celular através de uma estéril 40 µm filtro celular para um tubo cônico limpo de 50 mL contendo 5 mL de meio de manutenção.
  18. Centrifugue a suspensão celular filtrada a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  19. Remova o sobrenadante e, em seguida, solte suavemente o pellet celular batendo levemente no tubo. 
  20. Adicione 5 mL de meio MEM e pipete para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender o pellet. Mantenha a suspensão celular a 37ºbanho-maria a C durante a contagem de células
  21. Diluir 10 μL da suspensão celular com 90 µL do meio MEM. Misture bem usando um 200 µL ponta de pipeta
  22. Adicione 20 μL da suspensão celular diluída para 20 µL de azul de tripano. Contar as células utilizando um hemocitômetro.
  23. Plaque as células em recipientes de cultura da seguinte forma: para uma placa de 24 poços, semeie 2 × 10⁵ células por poço; para uma placa de 6 poços, semear 5 × 10⁵ células por poço; para uma placa de 6 cm, semear 1 × 10⁶ células por placa
  24. Coloque as placas ou as placas de Petri em uma incubadora de cultura de tecidos. Evite deixar as células à temperatura ambiente por períodos prolongados.
  25. Examine as células ao microscópio para garantir que aderiram ao substrato 4 h após o plaqueamento.
  26. Após 24 h do plaqueamento, substitua o meio de cultura por meio de manutenção fresco.
  27. Alimente o cultivo a cada 2–3 dias, substituindo metade do meio por meio de manutenção fresco.
  28. Após 7 dias, as células devem atingir cerca de 80% de confluência e estarão prontas para experimentos.
    OBSERVAÇÃO: Para garantir condições ideais para culturas de astrócitos, realize todos os passos em ambiente estéril, preferencialmente dentro de uma cabine de fluxo laminar, para evitar contaminação. Além disso, certifique-se de que todos os reagentes estejam pré-aquecidos a 37°C quando aplicável. Seja meticuloso ao remover as meninges, pois qualquer tecido meníngeo remanescente pode interferir com os cultivos. Além disso, evite deixar as células à temperatura ambiente por períodos prolongados durante o plaqueamento e a contagem, a fim de manter a viabilidade e a integridade celulares.

3. Produção de partículas lentivirais e transdução 

OBSERVAÇÃO: Uma visão geral esquemática é mostrada na Figura 2.

  1. Semeie células HEK293T em uma placa de Petri de 10 cm2 contendo meio de cultura fresco (Tabela 1).
  2. Cultive as células durante a noite em uma incubadora a 37 °C para atingir 50%–60% de confluência.
  3. Em 1 mL de Opti-MEM, adicione 20 µg do plasmídeo lentiviral que codifica GFAP ou suas variantes, 5,6 µg do vetor de empacotamento e 1,8 µg do vetor de envelope. 
  4. Adicione 45 µL do reagente de transfeção à solução contendo DNA.
  5. Misture suavemente e incube à temperatura ambiente por 15 min.
  6. Adicione diretamente a solução de transfeção às células HEK293T e incube em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 4 h.
  7. Aspire a solução de transfeção e substitua por meio de cultura fresco.  
  8. Continue a cultura das células por 2 dias.
  9. Colete o sobrenadante da cultura celular e substitua por meio de cultura fresco.
  10. No dia seguinte, colete novamente o sobrenadante da cultura celular e substitua por meio de cultura fresco.
  11. No dia seguinte, colete o sobrenadante final da cultura celular.
  12. Combine os sobrenadantes das etapas 3.9–3.11 em um tubo cônico de 50 mL.
  13. Filtre o sobrenadante combinado através de um filtro de 0,45 µm utilizando uma seringa de 60 mL para remover detritos.  
  14. Centrifugue o sobrenadante filtrado a 1.400 × g por 5 min à temperatura ambiente para remover células mortas.
  15. Transfira o sobrenadante clarificado para tubos de ultracentrífuga.
  16. Centrifugue a 100.000 × g por 70 min a 4 °C para formar um pellet com as partículas lentivirais.
  17. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet no fundo do tubo.
  18. Resuspenda o pellet em 600 µL de meio Opti-MEM pipetando suavemente para cima e para baixo.
  19. Divida as partículas lentivirais ressuspendidas em alíquotas de 50 µL e armazene-as a -80 °C até o uso. 
  20. Semeie astrócitos primários em uma placa de 6 poços e deixe-os atingir 50%–70% de confluência (Seção 2).
  21. Descongele as quantidades necessárias de partículas lentivirais em gelo.
  22. Adicione 50 µL de partículas lentivirais a cada poço, suplementado com 8 µg/mL de Polibreno.
  23. Agite suavemente a placa para garantir distribuição uniforme do vírus e do Polibreno. Incube as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 4–8 h.
  24. Aspire cuidadosamente o meio contendo o vírus para evitar perturbar as células.
  25. Substitua o meio por meio de cultura fresco e continue a cultura por 2–3 dias.
  26. Realize análises subsequentes nas células transduzidas utilizando microscopia de imunofluorescência para visualizar a formação da rede de filamentos intermediários, ou imunoblotagem para avaliar a expressão de GFAP.
    NOTA: Ao manipular partículas lentivirais, é fundamental utilizar equipamento de proteção individual (EPI) adequado para garantir a segurança. Além disso, para manter a integridade das partículas virais, evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

4. Microscopia de imunofluorescência 

  1. Aspire suavemente o meio de cultura dos poços contendo lamínulas com células aderidas. Evite perturbar as células.
  2. Fixe as células adicionando uma das seguintes soluções fixadoras: para astrócitos primários, use paraformaldeído a 3,2% (p/v); para culturas de astrócitos-neurônios, use paraformaldeído a 3,2% (p/v) e sacarose a 4% (p/v).
  3. Incube as lamínulas na solução fixadora por 15 min à temperatura ambiente. A menos que indicado em contrário, realize todos os passos subsequentes à temperatura ambiente. 
  4. Lave as células fixadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o fixador.
  5. Permeabilize as células incubando-as em Triton X-100 a 0,2% (v/v) preparado em tampão bloqueador (soro de cabra normal a 5% (v/v) em PBS) por 15 min. 
  6. Lave as células permeabilizadas três vezes com PBS.
  7. Prepare a solução de anticorpo primário diluindo o anticorpo no tampão bloqueador de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante.
  8. Incube as lamínulas na solução de anticorpo primário por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
  9. Lave as lamínulas três vezes com PBS para remover o anticorpo primário não ligado.
  10. Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo anticorpos secundários conjugados a fluoróforos de cabra anti-murino e cabra anti-coelho no tampão bloqueador em uma diluição de 1:500.  
  11. Incube as lamínulas na solução de anticorpo secundário por 1 h à temperatura ambiente.
  12. Lave as lamínulas três vezes com PBS para remover o anticorpo secundário não ligado.
  13. Transfira cuidadosamente as lamínulas para lâminas de vidro usando pinças.
  14. Monte as lamínulas com meio de montagem para preservar a fluorescência.
  15. Selar suavemente as bordas da lamínula com esmalte incolor para evitar movimentação e evaporação.
  16. Deixe o esmalte secar completamente antes de prosseguir para a imagem.
  17. As lâminas preparadas estão prontas para imagem usando microscopia de imunofluorescência ou microscopia confocal.
    NOTA: Para garantir o sucesso dos experimentos, prepare todos os reagentes, como PBS, tampão bloqueador e anticorpos, frescos e mantenha a esterilidade. Manipule as lamínulas com cuidado para evitar danos às células ou arranhões na superfície de vidro. Proteja as amostras da luz durante a incubação com anticorpos e após o montagem para evitar o desbotamento dos sinais fluorescentes. Além disso, otimize as concentrações dos anticorpos e os tempos de incubação de acordo com a configuração experimental específica.

5. Western blot

  1. Lave os astrócitos duas vezes com PBS para remover o meio residual e detritos.
  2. Coloque a placa ou a cultura em gelo para minimizar a degradação proteica. Trabalhando um poço de cada vez, aspire completamente o PBS.
  3. Adicione tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) gelado contendo inibidores de protease e fosfatase. Para uma placa de 6 poços, adicione 250 µL por poço; para uma placa de 6 cm, adicione 500 µL por placa.
  4. Use um raspador celular para remover completamente todos os astrócitos no tampão RIPA (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% (p/v) NP-40, 5 mM ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 0,5% (p/v) desoxicolato de sódio e 0,1% (p/v) SDS, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoreto [PMSF]).
  5. Transfira as células raspadas para um homogeneizador Dounce de 1 mL colocado em gelo. Homogeneíze as células moendo-as suavemente com o pistilo.
  6. Incube os lisados celulares homogeneizados em gelo por 10 min para garantir lise completa. Reserve 20 µL dos lisados totais para determinar a concentração proteica por ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
  7. Centrifugue os lisados celulares a 13.500 × g a 4ºC por 10 min para formar um pellet de proteínas insolúveis.
  8. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo limpo. Reserve 20 µL do sobrenadante para determinar a concentração proteica por ensaio BCA.
  9. Concentre o sobrenadante realizando precipitação com metanol/clorofórmio.
  10. Resuspenda o precipitado resultante em 0,1 mL de tampão amostra de Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (p/v) SDS, 12,5% (v/v) glicerol, 0,01% (p/v) azul de bromofenol, 355 mM β-mercaptoetanol).
  11. Resuspenda o pellet em tampão amostra de Laemmli e disperse-o por sonicação. 
  12. Realize três ciclos de sonicação com pulsos de 0,5 s a 10% de potência. Mantenha a ponta da sonda voltada para o fundo do tubo para evitar formação de espuma.
  13. Realize um ensaio de proteína por ácido bicinconínico (BCA) no sobrenadante RIPA e nos lisados celulares totais. 
  14. Carregue as amostras proteicas em um gel de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) a 12% ou 15%. Execute o gel a uma voltagem constante de 200 V por 45 min.
  15. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando um sistema de transferência úmida. Siga as instruções do fabricante e transfira a 100 V por 70 min.
  16. Coloque a membrana em albumina sérica bovina (BSA) a 5% (p/v) dissolvida em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% (p/v) Tween-20 (TBST). Bloqueie por pelo menos 1 h à temperatura ambiente com agitação suave.
  17. Dilua os anticorpos primários em TBST de acordo com as instruções do fabricante. Incube a membrana na solução de anticorpo primário durante a noite a 4ºC com agitação suave.
  18. Lave a membrana três vezes com TBST, cada lavagem durando 5 min.
  19. Dilua os anticorpos secundários conjugados com fluoróforo ou peroxidase do rabo (HRP) em TBST em uma diluição de 1:500 (ou conforme especificado pelo fabricante).
  20. Incube a membrana na solução de anticorpo secundário por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave.
  21. Lave a membrana três vezes com TBST, cada lavagem durando 5 min.
  22. Desenvolva a membrana utilizando fluorescência ou quimioluminescência aumentada (ECL) de acordo com as instruções do fabricante.
  23. Visualize as bandas proteicas utilizando um sistema de imagem.
    NOTA: Para prevenir a degradação proteica, realize todos os passos em gelo ou a 4ºC, exceto os passos de incubação e bloqueio com anticorpos. Certifique-se de que todos os tampões, reagentes e equipamentos estejam pré-resfriados antes do uso para manter temperaturas baixas durante todo o processo. Evite sobrecarregar o gel para prevenir manchas, e otimize as concentrações de anticorpos e tempos de incubação conforme necessário para o experimento específico.

6. Preparação de neurônios primários para cocultura

  1. Eutanizar a rata prenhe usando dióxido de carbono como anestésico inalatório. Dissecar o útero e colocá-lo em uma placa de Petri estéril.
  2. Remover os cérebros dos fetos e colocá-los em uma placa de 6 cm contendo solução de dissecação. Garantir que o tecido permaneça submerso na solução o tempo todo para evitar ressecamento.
  3. Dissecar os córtices e remover as meninges conforme descrito (passo 2.7).
  4. Transferir o tecido dissecado para uma cabine de fluxo laminar.
  5. Aspirar a solução de dissecação usando uma pipeta de 1 mL e adicionar solução de dissecação fresca à placa.  
  6. Minuciar o tecido cerebral em pedaços pequenos usando uma lâmina de bisturi estéril.
  7. Transferir o tecido minucado para 5 mL de meio de dissociação neuronal (Tabela 1) pré-aquecido a 37 ºC em um tubo de 15 mL.
  8. Incubar o tubo em banho-maria a 37 ºC por 30 min, agitando suavemente o tubo a cada 5 min para garantir adequada interação enzima-tecido. 
  9. Retirar o tubo do banho-maria e deixar o tecido sedimentar no fundo do tubo. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma ponteira de pipeta de 1 mL sem perturbar o tecido.
  10. Adicionar 5 mL de solução de dissecação pré-aquecida ao tubo e invertê-lo 5 vezes para lavar o tecido. Deixar o tubo em repouso por 3 min para permitir a sedimentação do tecido, depois repetir o processo de lavagem três vezes, utilizando sempre solução de dissecação fresca.
  11. Após a lavagem final, remover o sobrenadante e adicionar 2,5 mL de solução de dissecação e 2,5 mL de meio de placa.
  12. Triturar o tecido pipetando a solução para cima e para baixo 10–15 vezes usando uma pipeta de 10 mL.
  13. Deixar o tubo em repouso por 3 min para permitir a sedimentação do tecido. Transferir o sobrenadante (contendo células) para um novo tubo cônico de 50 mL.
  14. Adicionar 5 mL de meio de placa ao tubo original contendo o tecido sedimentado. 
  15. Triturar novamente o tecido 10–15 vezes usando uma pipeta de 10 mL até que a maioria dos fragmentos desapareça.
  16. Passar a suspensão celular por uma peneira celular estéril de 40 µm para um tubo cônico limpo de 50 mL contendo 5 mL de meio de placa.
  17. Centrifugar a suspensão celular filtrada a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  18. Remover o sobrenadante e, em seguida, soltar suavemente o pellet celular batendo levemente no tubo. Adicionar 5 mL de meio de placa pré-aquecido e pipetar para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender o pellet.
  19. Contar as células conforme descrito anteriormente (passos 2.21 e 2.22). Manter a suspensão celular em banho-maria a 37 °C durante a contagem celular.
  20. Plaquear os neurônios diretamente sobre os astrócitos primários em recipientes de cultura da seguinte forma: para uma placa de 24 poços, semear 1,45 × 105 células por poço; para uma placa de 6 poços, semear 5 × 105 células por poço; para uma placa de 6 cm, semear 1 × 106 células por poço.
  21. Colocar as placas ou as placas de cultura em um incubador de cultura celular ajustado a 37 ºC com 5% de CO₂. Evitar deixar as células à temperatura ambiente por períodos prolongados para manter a viabilidade.
  22. Substituir o meio de placa por meio de manutenção neuronal 4 h após o plaqueamento.
  23. Substituir metade do meio por meio de manutenção neuronal fresco a cada 3–4 dias.
    NOTA: Os neurônios em cocultura estarão prontos para experimentos após 7–10 dias in vitro (DIV).

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Resultados

Uma visão morfológica das culturas primárias de astrócitos em diferentes momentos após o isolamento é apresentada na Figura 3. Após a semeadura da suspensão celular cortical, alguns astrócitos aderem à superfície da placa de cultura nas primeiras 24 h (Figura 3A). Durante os primeiros 3 a 5 dias, as culturas contêm debris celulares e neurônios em degeneração (Figura 3B), já que o meio de cultura é otimizado para favorecer a sobreviv...

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Discussão

Culturas primárias de astrócitos avançaram significativamente nossa compreensão dos papéis dos astrócitos na saúde e na doença. Com base no trabalho fundamental de McCarthy e de Vellis21, essas culturas são fundamentais para o estudo da Dx A, pois permitem a exploração detalhada de processos específicos dos astrócitos, particularmente os efeitos das mutações da Dx A na montagem da GFAP e na formação de agregados.

O sucesso no isolamento e cultivo de astrócitos primários...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Tracy Hagemann (Centro Waisman, Universidade de Wisconsin-Madison) por fornecer os ratos knock-in R237H. Este trabalho foi apoiado por concessões do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (111-2320-B-007-008 e 112-2320-B-007-006 para N.-H. L. e M.-D.P.). Os autores agradecem o apoio do núcleo de imagem confocal da Universidade Nacional Tsing Hua, Taiwan, que é financiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (NSTC-114-2740-M-007-001). Agradecemos também ao Centro de Instrumentação da Universidade Nacional Tsing Hua pelo acesso ao microscópio eletrônico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 M HEPES, pH 7,4 Gibco15630-080
100× penicilina-estreptomicina  Gibco15140-122
10× Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS)Gibco14180-046
2,5% TripsinaGibco15090046
Solução de acrilamida/bis 30%, 37,5:1Biorad1610158
anticorpo anti-GFAPCell Signaling Technology12389
anticorpo anti-GFAP humanoBiolegend837202Clone SMI21
anticorpo anti-panGFAPAgilentGA524
anticorpo anti-ubiquitinaMilliporeST 1200Clone FK2
anticorpo anti-vimentinaSigma-AldrichV6389Clone V9
anti-β anticorpo anti-III tubulinaBiolegend801201
suplemento B27Gibco17504044
Cloreto de cálcio (CaCl2)Arcos34961
Reagentes relacionados ao cultivo celular
Sistema de Imagem ChemiDocBioRadNA
Corante azul de CoomassieUSB32826
CisteínaSigma-AldrichC1276
Ditiotreitol (DTT)URDTT
DNase I Sigma-AldrichD5025
homogeneizador DounceWheaton
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CM
Kit de preparação de DNA plasmidial livre de endotoxinas Qiagen12943
Reagente quimioluminescente aprimorado (ECL)PerkinElmerNEL 105001
Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)USB15699
soro bovino fetal  GibcoA5209401
GlicoseSigma-AldrichG8270
GlutaMaxGibco35050-061
Meio mínimo essencial (MEM)Corning10-010-CVR
NaClHoneywell31434S
Meio NeurobasalGibco21103049
Optima XE-90 UltracentrífugaBeckmanNA
PapaínaWorthingtonLS003126
Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)ACROS ORGANICS215740050
PolietileniminaSigma-AldrichP3143
Polilisina-LSigma-AldrichP6516
Cloreto de potássio (KCl)Honeywell12636
anticorpo anti-actina rodaminaBioRad12004164
Dodecil sulfato de sódio (SDS)USB75819
Piruvato de sódioGibco11360070
StarBright Blue 520 anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo Biorad12005867
StarBright Blue 700 anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG BioRad12004161
SacaroseSigma-AldrichS5391
Rotor SW-28BeckmanNA
Reagente de transfeção TansIT-LT1MirusMR-MIR-2300
TEMEDUSB76320
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)USB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
β-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148

Referências

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