Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.
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Artigo de método
Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial.
Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático.
Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.
Protocolo
1. Remoção do embrião e dissecção da placenta
- Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes.
- Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados - no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano
- Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura.
- Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio.
- Com uma pinça, pegue o cornos uterinos e recolhê-las usando uma tesoura em cada extremidade distal. Coloque o cornos uterinos em uma placa de petri preenchida com PBS e colocar no gelo. Além disso, ....
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Discussão
Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.
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Materiais
Lista de materiais:
A glicose 100mM
10mM NaN3
15 ml tubos cônicos (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G e 25-G agulhas (BD)
Solução de sacarose 30%
Pratos Petri 35 milímetros (BD)
Paraformaldeído 4%
50 - m filtros celular (Celltrics)
5 ml seringas (BD)
Fosfatase alcalina Substrato Kit I (Red Vector, Vector)
Fosfatase alcalina Substrato Kit III (Vector Azul, Vector)
Solução (Penicilina / Estreptomicina, P / S) de antibióticos
Colagenase tipo I (Sigma)
Moldes Vinyl Cryomold descartáveis amostras (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Citoqueratina anticorpo primário (DakoCytomation)
Pinça de dissecção, aço inoxidável ou titânio, número 5 ou 55
Drierite
De soro fetal bovino (FBS)
Plastic Fisherbrand Microscope Slides Mailer (Fisher)
1000u/ml glicose oxidase
Levamisole (Vector)
Montagem de mídia, meio aquoso baseado em montagem (VectamountTM AQ)
Normais soro de cavalo (Vector)
Temperatura ideal de corte (OCT, Tissue-Tek)
Peroxidase Substrato Kit DAB (Vector)
Tampão fosfato salino (PBS) com Cálcio / Magnésio (w Ca2 + / Mg2 +)
Tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio / magnésio (w / o Ca2 + / Mg2 +)
Box Deslize plástico (possui 100 slides)
Tubos de plástico (PVC Nalgene 180 Autoclavável não-tóxico)
Test Tube polipropileno de fundo redondo, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solução (Amresco)
Produtos Research International Corp Pap Super Pen HT Markers * Slide (2,5 mm, Fisher)
Da cultura de tecidos tratados em forma de U (de fundo redondo) placas de 96 poços ou 24 poços (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Kit Amplification tiramida (Invitrogen)
Vectastain ABC Fosfatase Alcalina Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Padrão Elite Kit (Vector)
Referências
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A.
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Reimpressões e permissões
