Isolamento de neutrófilos Protocolo

Resumo

Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.

Resumo

Neutrófilos granulócitos polimorfonucleares (PMN) são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória. Devido ao seu papel fundamental na inflamação, as funções de neutrófilos, como locomoção, produção de citocinas, fagocitose e combate de células tumorais são amplamente estudados. Para caracterizar as funções específicas de neutrófilos, um método limpo, rápido e confiável de separá-los de outras células sanguíneas é desejável para os estudos in vitro, especialmente desde que os neutrófilos têm vida curta e deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. Aqui, nós demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando a mídia separação comercialmente disponível que é uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspenso em tampão de concentração desejada. Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%.

Protocolo

Isolamento de neutrófilos Protocolo

1. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente.
2. Coletar 5,0 ml de meios de isolamento de neutrófilos no tubo de centrifugação. Cuidadosamente camada de 5,0 ml de sangue sobre a mídia separação. Realizar esta etapa lenta e cuidadosamente, e com a ponta da pipeta perto da superfície da mídia para evitar a mistura do sangue e da mídia.
3. Centrifugar a 500 RCF por 35 min a 20-25 ° C. O sangue deve separar em 6 bandas distintas: plasma, monócitos, meios de isolamento, neutrófilos, media mais de isolamento, e os glóbulos vermelhos pellet (Figura 1). Se essas bandas não são claras, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido.
4. Remova cuidadosamente os três camadas (plasma, monócitos e meios de isolamento), utilizando uma pipeta. Elimine essas camadas.
5. Pipeta com cuidado a camada de neutrófilos e de todos os meios de isolamento sob o neutrófilos. Coloque a solução em um tubo de ensaio limpo.
6. Diluir a solução de neutrófilos para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg ² + Ca ^2. Inverter o tubo várias vezes para suspender as células.
7. Centrifugar a solução de neutrófilos em 350 RCF por 10 minutos. A pelota vermelha deve estar presente no fundo do tubo, contendo neutrófilos e residual glóbulos vermelhos (hemácias). Remover o sobrenadante com uma pipeta com cuidado para que a pelota não é perturbado.
8. Para lisar as hemácias residual, adicionar 2 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo. Para ressuspender o sedimento, vortex do frasco com um ajuste de 3-4. Evitar o aumento da configuração vórtice acima de 4, já que isso pode causar o neutrófilos para ativar. Pode ser necessário vortex por alguns segundos, ou a "pulso" do vórtice para dissolver o sedimento.
9. Centrifugar o tubo a 250 rcf durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita o processo de lise, se necessário.
10. Adicionar 500 mL HBSS sem Ca ² + / Mg ² + para cada tubo. Mais uma vez, vórtice para ressuspender o sedimento em uma configuração de 3-4. Diluir para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg ² + Ca ^2.
11. Centrifugar os tubos a 250 rcf durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e descartar.
12. Ressuspender o sedimento em 250 mL HBSS / Solução HSA (2% HSA). Células podem então ser contados e ajustados a concentração desejada.

Discussão

A densidade método de separação de gradiente é usado para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. Este método é baseado no método de separação de leucócitos mononucleares por Boyum (1968) que foi modificado para a separação de neutrófilos por Ferrante e Thong (1980).

Após a coleta de um doador, o sangue total pode ser anticoagulados com EDTA, citrato ou heparina. Uma vez que eles são de curta duração, os neutrófilos deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linfócito Poly(R)	Reagente	Cedarlane Labs		PolymorphprepTM pode ser usado como uma alternativa
Hank’Solução Salina Balanceada sem Cloreto de Cálcio	Reagente	Invitrogen
Albumina Sérica Humana	Reagente	ZLB Bioplasma
Tampão de Lise de Células Vermelhas	Reagente	Grupo Roche
Centrifugar	Ferramenta
Vortexer	Ferramenta
Pipetas Pasteur e bulbo	Ferramenta
PolymorphprepTM	Reagente	Axis-Shield		Reagente alternativo ao Linfócito-Poli (R)
Filtro de seringa	Outro	EMD Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, esterilizável por gama
Hank’Solução Salina Balanceada com Cloreto de Cálcio	Reagente	Invitrogen