Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.
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Artigo de método
De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Usamos a técnica de célula inteira patch clamp para estudar os circuitos sinápticos que está por trás de processamento de informações visuais na retina. Neste vídeo, que irá guiá-lo através do processo de realização de célula inteira gravações de luz correntes evocados de células individuais na preparação fatia da retina. Usamos o tigre aquáticos salamandra como modelo animal. Começamos por descrever a dissecação do olho e mostrar como as fatias são montados para as gravações eletrofisiológicas. Uma vez que a fatia é colocada na câmara de gravação, que demonstram como executar de célula inteira gravações braçadeira de tensão. Em seguida, projeto de estímulos visuais sobre os fotorreceptores na fatia de obter luz evocou respostas atual. Durante a gravação que perfundir a fatia com agentes farmacológicos, no qual um sistema de perfusão de 8 canais nos permite alternar rapidamente entre diferentes agentes. A preparação fatia da retina é amplamente usado para gravações de patch clamp na retina, em particular para estudar ou células amácrinas bipolar, que não são acessíveis em uma preparação de todo o monte.
Protocolo
Soluções
- Solução intracelular de células ganglionares (em mM): 100 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH
- Solução intracelular de células bipolares (em mM): 90 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH
- Solução de Ringer extracelular (em mM): 112 NaCl, Glicose 5, 5 HEPES, 2 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, ajustada para pH = 7,75 com NaOH. Oxigenação da solução, não é necessário.
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Discussão
Benefícios:
- Todos os tipos de células são acessíveis
- A fácil identificação de tipos de células, em particular se um corante fluorescente é adicionado à solução do eletrodo
- Agentes farmacológicos pode chegar facilmente a células-alvo
- A técnica de patch clamp permite investigar o papel dos canais iônicos em cálculos diferentes da retina. A mesma informação não pode ser obtida através de gravações extracelluar espiga ou gravações com eletrodos afiada.
- Esta técnica pod.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | Amplificador de Clamp de Patch | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Microsscópio de Dissecação | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | Microsscópio Upright | Olympus Corporation | Equipado com objetivas de imersão em água de 40x e 10x, filtros fluorescentes e lâmpada de mercúrio | |
| P-97 | Puxador de Micropipetas | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | Injetor de imagem para microscópio | MBF Bioscience | ||
| Sistema de perfusão de 8 canais | Microperfusão | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | Processador Digital de Vídeo | Cambridge Research Systems | ||
| Oculares de Infravermelho | Outro | ITT Visual Information Solutions | ||
| Placas adesivas de silicone | Outro | Molecular Probes, Life Technologies | diâmetro de 20 mm, profundidade de 1,0 mm | |
| Filtros de Membrana | Filtro | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Capilares de Vidro de Borossilicato | Vidro para Eletrodo | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Filtros de Seringa | Filtro | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | Filtros de 4 mm, membrana de Nylon .2um, carcaça de polipropileno |
| Câmera de infravermelho | Câmera acoplada ao microsscópio | Sony Corporation | SPT-M324 | Câmera de vídeo Extrawave HAD, B7W |
| Picrotoxina | Reagente | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Estricnina | Reagente | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Sal sódico do ácido imidazol-4-acético | Reagente | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Salamandras tigre larvais | Animal | Charles E. Sullivan |
Referências
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B.
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Reimpressões e permissões
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