Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

Resumo

Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.

Resumo

No embrião de rato, hematopoiese precoce ocorre simultaneamente em múltiplos órgãos, que inclui o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região. Estas regiões são fundamentais na definição do sistema sanguíneo nos embriões e leva ao movimento eventual de células-tronco no fígado fetal e, em seguida, o desenvolvimento de células-tronco adultas na medula óssea. Início de células-tronco hematopoéticas podem ser isolados a partir desses órgãos através da microdissecção do embrião seguido de triagem de citometria de fluxo para obter uma população mais puro. Ainda não está claro como estas populações de células-tronco contribuem para a piscina fetal e células-tronco adultas. Além disso, nosso laboratório investiga como as células-tronco no início funcionalmente diferem fetal e adulto de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, classifica o nosso laboratório de diferentes populações de células-tronco hematopoéticas e testar seu papel funcional no contexto de uma variedade de modelos genéticos. Neste vídeo, demonstramos o processo de micro-dissecção que utilizamos com freqüência e também mostrar os resultados de um plotfter FACS típico isolar estas populações raro, é possível executar uma variedade de testes funcionais, incluindo: testes de colônia e transplantes de medula óssea.

Protocolo

Dissecção e isolamento das primeiras células-tronco hematopoéticas de camundongos saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região

1. Antes de começar, é importante ter todos os reagentes e as ferramentas necessárias para o procedimento:
   
   • Tesoura
   • Fórceps, tamanho 4, e grau cirúrgico com ponta dobrada fórceps, tamanho 5 / 45 (opcional)
   • 30 agulhas com seringa
   • 35mm e 100 milímetros placas de Petri
   • PBS com 10% e 20% de soro fetal bovino
   • e, finalmente, colagenase
2. Para começar a dissecção, precisamos colher os cornos uterinos de uma fêmea grávida em 10,5 concepção pós dias.
3. Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados. Usamos asfixia de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical.
4. Abdômen da fêmea está molhado com etanol e da pele é aberto com uma tesoura.
5. Segurando a pele com uma pinça, cortes adicionais são feitas para abrir o peritônio.
6. O abdômen é aberto e os cornos uterinos podem ser visualizados. Utilizando uma pinça para segurar os cornos uterinos, corte cada extremidade distal e do centro de consumo tanto chifres.
7. Cornos uterinos são então colocados em uma placa de Petri contendo PBS frio com 10% de FBS de remoção dos tecidos uterinos.
8. Usando tamanho 4 pinças e trabalhando sob o microscópio, remova cuidadosamente a partir de tecido endometrial em torno de cada concepto embrião, tomando cuidado para não perfurar a placenta.
9. Depois de retirados, os embriões são colocados em um prato de doce com frio PBS e FBS 10%.
10. Remova cuidadosamente o tecido placentário para revelar o embrião envolto no saco vitelino, usando as pinças para cortar o embrião envolto saco vitelino longe da placenta em sua conjuntura. O saco vitelino contendo artérias vitelínico, e uma porção do cordão umbilical, pode ser gentilmente brincou longe do embrião e reserve na geladeira por dissociação.
11. O embrião é transferido para uma placa de Petri pequena, com níveis mínimos de PBS com FBS 10% - apenas o suficiente para molhar o embrião, mas não muito. Níveis ótimos manter o embrião estacionária enquanto a placa está lentamente agitada, mantendo-se o embrião firmemente no lugar durante a dissecção.
12. Mude para o 30 agulhas, que são usados ​​para remover as partes superiores e inferiores do embrião, cortando acima dos membros anteriores e abaixo dos membros posteriores. Tornando-se familiarizado com o uso das agulhas como instrumentos de corte pode ter alguma prática. Um método de uso repetido de pequenos cortes, atravessando as agulhas vão dissecar o tecido, com a agulha na mão dominante para agir como um guia de corte para a agulha que está na mão não-dominante.
13. Remover a parte dorsal do embrião. Este é o tecido que contém os somitos. Gentilmente cortar o tecido dorsal mais mantendo-se a uma distância suficiente da aorta (linha vermelha) para evitar qualquer Knicks. Corte da aorta resultaria em perda de sangue e pela incapacidade de visualizar facilmente a sua localização. Mais uma vez, fazendo pequenos cortes com as agulhas é vital para manter um local de corte preciso.
14. Empurrar o tecido extra para fora da vista e vire o embrião ao redor para cortar o tecido ventral, mais uma vez o corte o mais próximo da aorta quanto possível, sem knicking-lo. Cortes feitos muito longe de uma excelente localização resultaria em tecidos abdominal estar presente, o que pode ser removido uma vez que a AGM é isolado.
15. Posição do embrião com o lado dorsal para baixo ou as costas contra a placa. Suavemente splay o embrião aberto, empurrando os lados para baixo e visualizar a localização dos cumes gonadal. Estes estão localizados um pouco fora do centro, como tubo de estruturas semelhantes em ambos os lados da aorta.
16. Completar a dissecção, removendo o excesso de tecidos lado utilizando as técnicas de corte como antes. Uma vez que o tecido do lado do embrião é removido, então o embrião é virada de cabeça para baixo para remover o tecido lado restante.
17. Neste ponto, a AGM é inspecionado para qualquer excesso de tecido que pode ser removida facilmente com as agulhas sem lesão na aorta ou gônadas. Remover, tanto quanto o excesso resultados possíveis em melhor isolamento da população de células-tronco, uma vez que dependem de apenas uma célula de alguns marcadores de superfície para a purificação.
18. Usando a pinça de ponta curvada, gentilmente recolher cada AGM e coloque no frio PBS com FBS 10% até que esteja pronto para a dissociação.

Dissociação e Análise FACS

1. Para dissociar o tecido, sacos primeiro lugar gema e AGMs em tubos separados.
2. Girar rapidamente para tecidos pellet e descartar PBS com 10% de FBS.
3. Ressuspender tecidos colagenase 0,25% em PBS com FBS 20%, com volume suficiente para cobrir adequadamente os tecidos.
4. Incubar os tecidos a 37 graus. 25-30mins para AGMs e 35-40mins de gema de sacos.
5. No final da incubação, gentilmente pipeta tecidos para cima e para baixo para dissociação em suspensões única célula.
6. Lavar os tecidos com excesso de PBS wiº 10% FBS, agregar as células e ressuspender em fresco PBS estéril com 10% de FBS.
7. Para a análise FACS, as células são coradas de acordo com recomendações do fabricante. Nós usamos um FACSAria da BD Biosciences para executar citometria de fluxo. Devido ao tamanho e fragilidade das células embrionárias, a abertura de triagem é ajustado para um diâmetro maior do que para adultos células hematopoiéticas, que também estudo no laboratório. Da mesma forma, a pressão é ajustado para ser menor do que as condições exigidas pelo adulto células hematopoiéticas. Por exemplo, a triagem no FACSAria, o tamanho do bico seria 100 microns ea pressão espécie seria de 30 psi.
8. Para as análises de células-tronco, células positivas triple expressando a cKit marcadores, CD34, CD41 e são isoladas e classificadas a partir do saco vitelino e positivos duplo (cKit, CD34) são isolados a partir da AGM via FACS. Um gráfico típico ficaria assim: cKit células positivas são analisadas para CD34 e CD41 em simultâneo ou individualmente. Normalmente, células apresentam uma gradação de positividade para cada marcador com a população de células-tronco encontradas como um subconjunto das populações positivo. Estes gráficos mostram-nos que temos conseguido um bom rendimento celular com 100-300 células por saco vitelino e AGM por.