Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.
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Artigo de método
Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção
Neste artigo
Resumo
Resumo
Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o 1 gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais 2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal 3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.
Protocolo
Construção expressão Plasmid
Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis.
Experimental Plasmid
- Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por 4 a clonagem rec....
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Discussão
Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de:
- Injectar directamente no centro da gônada
- Não injetar muito líquido
- Trabalhar com rapidez para evitar dessecação.
Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal.
A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como:
- Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transformação
- M.......
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapuro | Invitrogen | 15510-027 | |
| Óleo de Halocarbono, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, França | ||
| Cobertura de vidro 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| Cobertura de vidro 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Cobertura de vidro 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| Capilar de 100 µl | VWR international | 53432-921 | ||
| Capilar de Vidro para Agulhas | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Puxador de Agulhas | Ferramenta | Narishige International | Modelo PP-830 | |
| Sistema microINJECTOR | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | Escopo, Platina, Manipulador | |
| Dissecção, com Fluorescência | Microscópio | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecção | Microscópio | Nikon Instruments | SMZ645 |
Referências
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans:....
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Reimpressões e permissões
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