Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Resumo

Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

Resumo

Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o ¹ gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais ^2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal ^3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.

Protocolo

Construção expressão Plasmid

Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis.

Experimental Plasmid

1. Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por ⁴ a clonagem ^rec....

Discussão

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de:
- Injectar directamente no centro da gônada
- Não injetar muito líquido
- Trabalhar com rapidez para evitar dessecação.

Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal.

A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como:
- Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transformação
- M.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, França
Tampa de Vidro 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Tampa de Vidro 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Tampa de Vidro 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capilar		VWR international	53432-921
Capilar de Vidro para Agulhas	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Ferramenta Extrator de Agulha		Narishige International	Modelo PP-830
Sistema		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Escopo, Palco, Manipulador
de Dissecação, com Microscópio de Fluorescência		Nikon Instruments	SMZ800
Microscópio	Dissecação	Nikon Instruments	SMZ645