Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

Resumo

Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar neurônio dopaminérgico neurodegeneração como um modelo para a doença de Parkinson. Além disso, as telas genéticos são usados ​​para identificar os fatores que quer aumentar a degeneração ou neuroprotetor.

Resumo

Melhorias para o diagnóstico e tratamento da doença de Parkinson (DP) são dependentes de conhecimentos sobre os fatores que tornam a susceptibilidade populações em risco. No processo de tentar identificar novos fatores genéticos associados com a DP, os cientistas têm gerado muitas listas de genes candidatos, polimorfismos, e proteínas, que representam avanços importantes, mas estas ligações permanecem mecanicamente indefinido. Nosso trabalho estará voltado para a redução significativa tais listas, explorando as vantagens de um sistema simples de animais modelo. Enquanto os seres humanos têm bilhões de neurônios, a lombriga microscópica Caenorhabditis elegans tem precisamente 302, dos quais apenas oito produzir dopamina (DA) em hemaphrodites. Expressão de um gene humano que codifica a proteína PD-associados, alfa-sinucleína, em C. elegans resultados DA neurônios na dose e idade-dependente neurodegeneração.

Worms expressar humana alfa-sinucleína em neurônios DA são isogênicos e expressar tanto GFP e humano alfa-sinucleína sob o promotor transportador DA (PDAt-1). A presença de GFP serve como um marcador facilmente visualizado por seguir neurodegeneração DA nesses animais. Inicialmente demonstrou que alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA poderia ser resgatado nestes animais por torsinA, uma proteína com atividade chaperone molecular ^1. Além disso, o candidato relacionados com a DP genes identificados em nosso laboratório através de esforços em larga escala de triagem RNAi usando um ensaio misfolding alfa-sinucleína foram, então, sobre-expressa em C. elegans DA neurônios. Determinou-se que cinco dos sete genes testados representada moduladores candidato significativa de PD como eles resgatados alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA ^2. Além disso, o Lab Lindquist (esta questão de Jove) realizou telas de fermento em que a alfa-sinucleína dependentes de toxicidade é usado como uma leitura de genes que podem aumentar ou suprimir citotoxicidade. Nós posteriormente examinou os genes candidatos fermento em nossa C. elegans ensaio neurodegeneração alfa-sinucleína induzida e validado com sucesso muitos destes ^{três metas, 4.}

Nossa metodologia envolve a geração de um elegans DA C. vetor de expressão neurônio-específicos usando a clonagem de cDNAs recombinational gene candidato sob o controle do PDAt-1 promotor. Estes plasmídeos são então microinjeção no tipo selvagem (N2) worms, juntamente com um marcador selecionável para transformação de sucesso. Múltiplas estáveis ​​linhagens transgênicas de produzir a proteína nos neurônios DA candidato são obtidas de forma independente e depois cruzou para a cepa alfa-sinucleína degenerativas e avaliados quanto à neurodegeneração, tanto o animal eo nível de neurônio individual, ao longo do envelhecimento.

Protocolo

A. Construção Expressão Plasmid

Dois plasmídeos são necessários: um para expressão tecido específico do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionável (embora o marcador plasmídeo é geralmente disponível a partir de dentro da comunidade de pesquisa).

Experimental Plasmid

1. Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, neste caso, o transportador de DA (PDAt-1) promotor é usado. Esta expressão plasmídeo foi criado como um gateway Invitrogen sistema compatível com vector de destino (pDEST-DAT-1) para permitir a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por clonagem recombinational ^1.
2. O cDNA do gene de interesse é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no vetor doador pDONR201 para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli estirpe DH5α. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinado na pDEST-DAT-1 vector de destino para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. ^5.

Marcador selecionável Plasmid

Um marcador de transgênicos plasmídeo consiste de um vetor com um promotor dirigindo a expressão de uma proteína fluorescente em um tecido óbvio. Neste procedimento, o promotor unc-54 drives expressão da proteína cereja no músculo do corpo de parede (pon-54:: cereja).

B. A geração de transgênicos C. elegans através de microinjeção

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C. Genética cruzes para DA Análise de neurodegeneração

1. Worms são cultivadas utilizando procedimentos padrão ^6.
2. Coloque 10 PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: machos GFP ^{1, 2} em uma placa de acasalamento com 04/03 L4 hermafroditas estágio transgênicos (expressando PDAt-1:: gene X e punção-54:: cereja) . Esta deve ser realizada individualmente para cada uma das três linhas separadas estável criado. Depois de dois dias, retire os machos.
3. Inspecionar a geração F1, se há descendência masculina diversas, o acasalamento foi bem sucedida.
4. Clone com 5 hermafrodita L4 animais de cada cruz que apresentam ambos os PDAt-1:: GFP marcador fluorescente (herdadas do pai do sexo masculino) e os pon-54:: cereja fluorescentes corpo marcador músculo da parede (herdadas do pai hermafrodita). Os animais precisam ser clonado no estágio L4 para garantir que eles ainda não tenham acasalado com animais machos presentes na placa. Permitir-lhes a auto-cross e produzir progênie F2.
5. Animais F2 produzidos no passo 3 são clonados para fora. Especificamente, a transferência ~ 5-10 animais que apresentam ambos os marcadores fluorescentes para os seus próprios pratos individuais. Tela da geração F3 para placas onde 100% dos animais expressam GFP em DA neurônios e alguns dos animais são expressas cereja em células do corpo muscular da parede. Estes animais serão homozigotos para o PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: gene GFP estavelmente enquanto transmitindo o transgene recém-criado (gene X).

D. dopaminérgicos Neuron Análise

1. Prepare um prato de doce para cada uma das três linhas criadas acima, bem como a PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP sozinho tensão. Permitir-lhes a crescer até a idade adulta.
2. Transferência de 30-40 adultos transgênicos de cada linha em um prato doce. Lhes permitem colocar os embriões durante 4 horas a 20 º C.
3. Remove os adultos. Permitir que os embriões a desenvolver por 3-4 dias a 20 º C até atingirem o estágio L4.
4. Escolha ~ 100 transgênicos L4 animais a uma placa contendo 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-deoxiuridina (FUDR). Este nucleotídeo desenvolvimento blocos analógicos de próxima geração através da inibição da síntese de DNA, impedindo assim a descendência de esmagadora dos animais experimentais ^7. Proteger as placas FUDR da luz, uma vez que é sensível à luz.
5. Animais adultos serão analisados ​​em vários dias seguintes postura de ovos. Os dias apropriados de análise são determinados empiricamente. Por exemplo, nós determinamos que 77%, 87% e 90% do PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP animais apresentam neurônios degenerados DA nos dias 6, 7 e 10 pós-desenvolvimento, respectivamente. Portanto, se nós prevemos que o transgene de interesse pode aumentar neurodegeneração, vamos analisar no dia 6 e / ou 7. Da mesma forma, transgenes que poderia suprimir neurodegeneração serão analisados ​​nos dias 7 e 10.
6. Fazer 4 almofadas frescas agarose (ao contrário do agar microinjeção almofadas, elas são usadas frescas e não estão autorizados a secar). Definiu dois lâminas de microscópio que possuem um pedaço de fita entre eles; a fita serve como espaçador para blocos equivalente de espessura. Lay terzodeslize entre eles no banco (eles estão posicionados lado a lado três). Coloque uma gota de agarose derretida no slide centro e rapidamente estava outro slide em cima do agarose, perpendicular e em todos os três slides. Fazer várias almofadas adicionais, deixando os dois slides juntos até o bloco está pronto para uso.
7. Para analisar os neurônios verme DA, coloque uma gota 6 mL de 3 mM levamisole (um anestésico) em uma tampa de vidro 22 x 30 mm. Escolha 40 animais adultos (10 extras além da 30 a ser marcado) para a queda, então inverter a tampa de vidro sobre o bloco de agarose. Repita o procedimento para cada uma das outras linhas.
8. Pontuação 30 animais por linha para a presença de cada CEP e neurônio ADE usando um microscópio composto com epifluorescência e um cubo de filtro que permite a visualização de FITC ou GFP. Usamos um Dotar GFP HYQ filtro cubo (Tecnologia Chroma). Registro de dados na folha de pontuação em anexo. Do tipo selvagem animais reterá a fluorescência da GFP completa em todos os CEP 4 e 2 neurônios ADE. Animais individuais apresentando perda de neurônios DA são marcados como não-WT ou "degenerando". Da mesma forma, o grau de degeneração pode ser marcado pela contagem do total de neurônios perdidos em cada animal, bem como da população.
9. Repetir a análise mais 2 vezes (30 animais a mais por linha por julgamento). O número total de vermes exibindo neurônios do tipo selvagem DA das três rodadas de análises é média. Análise estatística para a neuroproteção é então realizada usando o teste t de Student (p <0,05) para comparar worms controle (PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP) com cepas que o excesso de expressar genes candidatos em neurônios DA .

Discussão

A perda idade-dependentes de neurônios de dopamina é um marco clínico da doença de Parkinson e tem sido associada com a acumulação ou misfolding de uma proteína chamada alfa-sinucleína. Aqui demonstramos como rótulo, através de um transgene fluorescente, a neurônios dopaminérgicos da C. elegans e imitar a neurodegeneração visto na doença de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína nestas células.

Este vídeo mostra a metodologia para a travessia de crescimento, genética, montagem e pontuação de nematóides transgênic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Ultrapuro	Invitrogen	15510-027
Vidro de cobertura 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Lâminas para microscópio	Simples, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Microscópio estereoscópico com fluorescência	Microscópio	Nikon Instruments	SMZ800
Microscópio estereoscópico	Microscópio	Nikon Instruments	SMZ645
Microscópio epifluorescente	Microscópio	Nikon Instruments	Modelo E-800
Cubo de filtro, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.