Este vídeo descreve a manipulação de neurônios cultivados usando laser pinças in vitro.
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Artigo de método
Usando uma pinça Laser Para Manipulação neurônios isolados In Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo e vídeo, descrevemos os protocolos utilizados em nosso laboratório para estudar as preferências de segmentação dos processos celulares regeneração de neurônios da retina adulta in vitro. Procedimentos para a preparação de culturas de células da retina começam com a dissecção digestão, e trituração da retina, e terminam com o chapeamento de isoladas as células da retina em pratos feitos especialmente para uso com laser pinças. Estes pratos são divididos em meia célula adesiva e meia repelente celular. O lado adesivo célula é revestida com uma camada de Sal-1 anticorpos, que fornecem um substrato sobre o qual nossas células crescer. Outros substratos adesivo pode ser usado para outros tipos celulares. O lado repelente célula é revestida com uma fina camada de poly-HEMA. As células banhado no lado poli-HEMA do prato são capturados com a pinça a laser, transportado e depois colocado adjacente a uma célula na-1 Sal lado para criar um par. Formação de grupos de células de qualquer tamanho deve ser possível com esta técnica. "Micromanipulação Laser-pinças controlada" significa que o pesquisador pode escolher quais as células a se mover, e a distância desejada entre as células podem ser padronizadas. Porque o feixe de laser atravessa as superfícies transparentes da placa de cultura, seleção e colocação de células são feitas em um ambiente fechado estéril. As células podem ser monitorados por vídeo em tempo-lapso e usado com qualquer técnica de células biológicas necessárias. Esta técnica pode ajudar as investigações de interações célula-célula.
Protocolo
Pinça óptica para manipulação de células isoladas em cultura
Forças aprisionamento de pinças ópticas são gerados a partir do impulso de luz (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Embora estas forças facilmente armadilha células em suspensão, eles não são capazes de mover as células que aderem a uma superfície. Portanto, para reduzir a adesão ao prato de cultura no ponto onde as células estão presos, a lamela é revestido com poli-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), um composto não tóxico com célula repelente propriedades anteriormente empregados para estudos de adesão em células endoteliais (Folkman ....
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Discussão
A luz tem força, e quando um raio de luz é refratada ao passar através de uma célula, uma força é necessária para mudar a direção do momentum. Por causa da lei da conservação do momento, uma força na direção oposta deve, por sua vez, reagem de volta em uma célula. Ashkin (1991) mostrou que a força gerada por um feixe de laser focalizado por uma lente objetiva do microscópio irá mover uma célula para o centro do foco. Mesmo que um feixe de laser gera apenas uma piconewtons alguns de força, essa força é suficiente para puxar uma célula atravé.......
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Agradecimentos
Pesquisa foi suportada pelo NIH Grants EY012031 e EY0182175 ea FM Kirby Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cobertura circular de 25 mm, número 1 | VWR international | 48380 080 | |
| Polímero de 2-hidroxietilmetacrilato (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolver em etanol a 95% |
| Anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo | Chemicon International | AP181 | 1 mg em 1 ml, diluir 10 vezes para uso |
| Supernatante Sal-1 contendo anticorpo de camundongo anti-salamandra | fornecido gentilmente pelo Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| Pipetas descartáveis de 5 ml com diâmetro interno de 3 mm, em pirex | Corning | 7078A-5 | |
| Placas de cultura celular de 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | |
| Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Pinças ópticas-microferramenta ou pinças a laser | Cell Robotics Inc. | ||
| Laser de diodo contínuo de 1 W com comprimento de onda de 980 nm | Cell Robotics Inc. | ||
| Microscópio invertido Axiovert 100 de luz visível | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lente objetiva plan neofluor de imersão a óleo 40x | Carl Zeiss, Inc. | Abertura numérica (N.A. 1,3) | |
| Câmera CCD preto e branco | Sony Corporation | ||
| Computador e joystick com software | Cell Robotics Inc. | para controlar uma platina motorizada |
Referências
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod....
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Reimpressões e permissões
