Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

Cultura de células

1. Culturas estoque de rim embrionário humano 293 (HEK293), as células são cultivadas em 10 cm de placas de cultura em 'A médio ", consistindo de Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com um coquetel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina e 100 mg por ml de sulfato de estreptomicina) e 10% de soro fetal bovino (FBS).
2. Para configurar as células de um experimento, o meio é sugada, e as células são lavadas duas vezes com 5 ml de solução tampão fosfato (PBS).
3. O PBS é então removido e substituído por 0,6 ml de uma solução contendo tripsina 0,25%.
4. O prato é incubada a 37 ˚ C por cerca de 2 min até que as células começaram a destacar.
5. 5,5 ml de meio de A é adicionado para neutralizar o tripsina e as células são contadas com um hemocitômetro.
6. Células são diluídos para 320 mil células por ml e dispensados ​​em 0,1 ml por poço em um polilisina revestido de 96 poços placa de cultura.
7. Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs.

Transfections

1. Na preparação para transfections, deve-se considerar quantas repetições devem ser executadas por condições experimentais e que quantidades de plasmídeo será transfectadas. Nós rotineiramente todas as condições em triplicado e transfecção de um total de 50 a 100 ng de DNA plasmidial por poço. Mistura plasmídeo deve incluir pelo menos um repórter construir expressar firefly luciferase e um controle luciferase Renilla plasmídeo expressando a partir de um promotor constitutivo.
2. Soluções plasmídeo são pipetados em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e suplementado com 10 ml por amostra de DMEM sem soro e antibiótico-livre. Por exemplo, se 20 poços estão cada ser transfectadas com 50 mg de DNA, adicionar 200 mL de DMEM 1 mg de DNA.
3. Para a solução de DMEM / DNA adicionar 3 mL «Trânsito 293 reagente" (Mirus) por mg de DNA. Mix pipetando cima e para baixo e deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min.
4. Durante este período, remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 90 mL de meio fresco A.
5. A cada poço adicionar 10 ml de DMEM / DNA / trânsito 293 mistura.
6. Coloque o prato em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ˚ C com uma atmosfera contendo CO2 e crescer 8,8% por 24 hrs.

Fagocitose

1. Preparar suspensões contendo B médio (uma mistura 1:1 de DMEM e médias Ham F12 além de antibióticos e 10% FBS) acrescida de 0,75 mícrons esferas de látex em zero a 1 mg por ml.
2. Remova a mídia da 96 poços placa de cultura e substituir com 0,1 ml de suspensões talão no meio B.
3. Girar a placa de 2 min a 1000 x g.
4. As células são cultivadas em seguida, a 37 ˚ C por 6-16 horas. Dependendo das condições eo promotor usado para acionar luciferase, a expressão do gene repórter aumento pode ser detectado após 1 a 3 horas.
5. Mesmo em casos pode ser necessário para incubar as células com grânulos de 30 a 60 min, em seguida, fazer duas lavagens com PBS para remover contas sem personalidade jurídica, e adicionar novas mídias antes incubando as células por períodos adicionais de tempo.

Dual-GloTM ensaio de luciferase

1. Nota: o nosso protocolo para a utilização deste kit difere em alguns aspectos do que o recomendado pelo fabricante. Ele foi modificado para reduzir a quantidade de reagentes necessários por amostra.
2. Prepare uma solução de 1 M DTT, divida em várias pequenas alíquotas e armazenar a -20 ˚ C.
3. Preparar um tampão de lise contendo 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glicerol, e 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes do uso da alíquota, o montante necessário para a experiência e adicionar 1 ml por ml de 1 M DTT mais coquetel inibidor de protease para uma concentração final de 0,5 a 1x. Não reutilizar os restos de solução de TDT.
4. Ao usar o kit Dual-GloTM pela primeira vez, prepare o reagente (vagalume) luciferase, transferindo todo o conteúdo de um frasco de Dual-GloTM buffer luciferase (fornecido com o kit) para uma garrafa de Dual-GloTM substrato luciferase (desde com o kit). Divide o reagente não utilizado luciferase em 10 ml alíquotas e armazenar a -20 ˚ C.
5. Remova a placa de 96 poços da cultura de tecidos incubadora e colocá-lo no gelo. Remova a mídia por aspiração, adicionar 40 mL por poço de tampão de lise, e em seguida deixar a placa em gelo por 30 min.
6. Em uma branca, opaca de 96 poços da placa (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alíquota 15 mL por poço de Reagente luciferase, em seguida, adicionar 15 mL de lisado de células.
7. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 min e depois ler a luminescência em um leitor de microplacas.
8. Imediatamente antes do uso, prepare uma quantidade adequada de solução de substrato Renilla luciferase, adicionando uma parte Dual-GloTM Stop & Glo ®; Reagente (fornecido com o kit) para 100 partes Dual-GloTM Stop & Glo ® Buffer (fornecido com o kit).
9. A cada poço adicionar 15 mL por poço da solução de substrato Renilla luciferase, incubar em temperatura ambiente por 10 min e depois medir a luminescência novamente.