Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Resumo

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Resumo

Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.

Protocolo

Preparação de reagentes

1. Revestimento de colágeno: colágeno casaco p35 placas de cultura de tecidos e coloque em um forno a 37 ° C por 2 dias antes da lubrificação os divisores. A concentração final de colágeno deve ser a 0,71 mg / ml diluída em HCl 0,001 N. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura por placa.
2. Carregadores de graxa: A fim de preencher o carregador de graxa, uma seringa de 60mL primeiro deve ser preenchido com Corning graxa de vácuo. Use a seringa para encher o carregador de graxa, envolvê-la em papel alumínio e depois autoclave por 45 minutos.
3. Teflon divisores: os divisores podem ser reutilizados de....

Discussão

Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo neurônios simpát.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
colágeno	Reagente	BD Biosciences	354249
metilcelulose N2 400CPS	Reagente	Sel-Win Chemicals
divisor de teflon	Outro	Tyler Research	CAMP10	muitos outros tipos de divisores estão disponíveis
rastelo de pinos	Ferramenta	Tyler Research	Camp-PR
carregador de graxa	Ferramenta	Tyler Research	Camp-GLSS
DMEM	Reagente	Fisher Scientific	MT10017CV
NGF	Reagente	PeproTech Inc	450-01
BDNF	Reagente	PeproTech Inc	450-02
graxa de alto vácuo	Reagente	Fisher Scientific	14-635-5D
AraC	Reagente	Sigma-Aldrich	C-1768
adaptador luer de 23 gauge	Ferramenta	Fisher Scientific	427565
hemostatos em ângulo de 90°	Ferramenta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-7035