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I. Visão geral esquemática:
Este vídeo demonstra as diferentes etapas imunohistoquímica montar todo em embrião de galinha. Primeiro, o embrião é fixado em PFA [IHC1]. Então, a atividade da peroxidase endógena se apaga [IHC2]. O embrião é, então, incubadas em anticorpo primário [IHC3]. Depois de várias lavagens, o embrião é incubado em anticorpo secundário [IHC4]; Reação de cor é revelada usando DAB [IHC5] e coloração de anticorpos parece laranja [IHC6].
Parte 1: Corrigindo os embriões
- Para executar imunohistoquímica montagem toda em embriões de galinha, primeiro abra um ovo tocando no shell com uma pinça e retirar pedaços da casca.
- Remova a albumina espessa com uma pinça, e incline o saco vitelino com uma pinça grossa para que o embrião voltado para cima.
- Com uma tesoura fina, corte um quadrado de saco vitelino em torno do embrião. Remover o embrião da gema com uma colher e coloque em um prato contendo PBS.
- Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente as membranas e gema ea transferência do embrião para um prato de doce contendo PBS.
- Pin o embrião para baixo com uma pinça e pinos de insetos, e aspire a PBS. Substituir isto por PFA 4% em PBS, e permitir que o embrião se fixar 1h em temperatura ambiente.
Parte 2: embriões Preparando-se para a etapa de anticorpos
- Para minimizar a contaminação microbiana potencial, use DDH 2 O em todos os passos seguintes.
- Depois que o embrião é fixo, aspire a solução fixadora e descartar adequadamente os resíduos químicos. Encha o prato com PBS.
- em seguida, usando uma faca de microdissecção, corte um quadrado em torno do embrião para remover membranas extra-embrionário. Remova os pinos de inseto com uma pinça.
- Depois dos pinos terem sido removidos, usar um blunt end Pasteur pipeta para transferir o embrião para um frasco de cintilação contendo com PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Lave o embrião com PBT, 3 vezes por 10 minutos cada.
- Remover PBT do frasco de cintilação, e substituir com PBTx contendo 0,3% de H 2 O 2, a fim de inativar peroxidase endógena potencial.
- Incubar por 2 horas em temperatura ambiente em nutator.
- Lavar embrião com PBT, 3 vezes por 10 minutos cada, em seguida, 3 vezes por 30 minutos cada.
Parte 3: a incubação de anticorpos
- Para manchar o embrião com anticorpo, comece por lavar o embrião de uma hora em tampão de bloqueio ou 1% BSA / NGS 1% / PBT (usamos NGS porque o anticorpo secundário é gerado em cabra). Incubar no nutator durante uma hora a RT.
- Diluir o anticorpo primário 1:1 em tampão de bloqueio, e embrião incubar nesta solução por 2 dias a 4 ° C em nutator. Fator de diluição primária de anticorpos depende da escolha do anticorpo primário. Aqui, usamos um anticorpo do Desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank, que é fornecido como sobrenadante. Nós diluir 1:1 em tampão de bloqueio.
- Em seguida, realizar 3 lavagens de 10 minutos em PBT, seguido por 3 lavagens de 1 hora em PBT.
- Após a lavagem, diluir o anticorpo secundário 1:2.500 em tampão de bloqueio (neste caso cabra conjugado peroxidase-anti-rato IgG (H + L), e embrião incubar nesta solução S / N, 4 ° C em nutator.
- Realizar 3 lavagens de 10 minutos em PBT, seguido por 3 lavagens de 1 hora em PBT.
Parte 3: Reação de cor
- Para desenvolver a reação de cor do embrião manchada, primeiro realizar duas lavagens de 20 minutos em tampão Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4).
- Enquanto isso, dissolver substrato DAB (3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina) em tampão Tris em 500μg/ml sob capela; manter solução no escuro, sobre o gelo.
- Remover o tampão de lavagem última Tris do embrião frasco contendo solução e substituir com DAB 5ml a partir do passo 3.2. Manter no escuro sobre nutator por 20 mn. Dispor de Eppendorf ponta em balde contendo uma solução de lixívia a 10%, a fim de descontaminar DAB.
- Enquanto isso, prepare um estoque de 0,3% H 2 O 2 em dH 2 O no gelo.
- Adicionar 50μl de ações H 2 O 2 para o frasco contendo embriões em DAB. Manter-se na escuridão. Depois de 1-2 minutos, monitor reação sob microscópio.
Parte 4: processamento de embriões para a fotografia e histologia
- Quando a reação de cor é completa, dispor de DAB em balde de lixívia. Substitua a água da torneira com 5 ml.
- Executar duas lavagens de 10 minutos em PBS.
- Ao processo para a fotografia e secção de cera, desidratar em série etanólica (25%, 50%, 75% e 100%) por 10 minutos cada.
- Substituir o etanol, com 0,5 - 1 ml de óleo de cedro madeira (isto fará com que o embrião translúcido). Processo para a fotografia em cedro óleo de madeira.
- Após a fotografia, o retorno do embrião para o frasco e substituir o óleo de madeira de cedro com etanol 100%. Repita o passo etanol.
- Substituir ethanol com 5% FCF verde rápido em etanol 100% e incubar por 3 minutos (este passo fará embriões visível para histologia). Substituir rápido FCF solução verde com 100% de etanol e processo para histologia.
Resultados representativos:
Nos exemplos abaixo, os embriões são dissecados em estágios HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); embriões mostram expressão de PAX 7 em emergentes crestas neural bem como em somitos e tubo neural (A, B); Em (C), notocorda é rotulado com 15.3B9 (Não-1) (anticorpos fornecidos pelo Banco de Desenvolvimento de Estudos Hibridoma).