Este vídeo demonstra toda montagem imuno-histoquímica, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de um antígeno pode ser visualizada em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Tom Jessell.
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Artigo de método
Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho
Neste artigo
Resumo
Resumo
O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a expressão de anticorpos no desenvolvimento do cérebro do tubo, neural e somito. Este vídeo demonstra as diferentes etapas no todo-mount coloração anticorpos, por meio HRP conjugados anticorpos secundários; Primeiro, o embrião é dissecada do ovo e fixados em paraformaldeído. Peroxidase, segundo endógena é inativada; O embrião é, então, expostas ao anticorpo primário. Depois de várias lavagens, o embrião é incubada com anticorpo secundário conjugado com HRP. Atividade da peroxidase é revelada através de reação com o substrato diaminobenzidina. Finalmente, o embrião é fixo e processados para a fotografia e corte. A vantagem deste método sobre o uso de anticorpos fluorescentes é que os embriões podem ser processados para o seccionamento de cera, possibilitando o estudo de locais de antígeno em seção transversal. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Jessell Tom
Protocolo
I. Visão geral esquemática:
Este vídeo demonstra as diferentes etapas imunohistoquímica montar todo em embrião de galinha. Primeiro, o embrião é fixado em PFA [IHC1]. Então, a atividade da peroxidase endógena se apaga [IHC2]. O embrião é, então, incubadas em anticorpo primário [IHC3]. Depois de várias lavagens, o embrião é incubado em anticorpo secundário [IHC4]; Reação de cor é revelada usando DAB [IHC5] e coloração de anticorpos parece laranja [IHC6].
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Discussão
Este vídeo demonstra as diferentes etapas na realização de todo-mount coloração de anticorpos em embriões de galinha jovens. Este protocolo é essencialmente utilizado para a caracterização espacial e temporal de anticorpos romance em pinto 2,3, bem como para o uso de marcadores antigênicos conhecidos para determinar malformações embrionárias seguintes insulto 4.
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Agradecimentos
Os anticorpos monoclonais (15.3B9, Pax7), desenvolvido por (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) foram obtidos do Banco de Desenvolvimento Hibridoma Estudos desenvolvidos sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas , Iowa. DP é destinatário de Ruth Award Kirschstein DA021977 1F32-01A1 do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Ovos | Charles River Laboratories | Premium Fértil | Fertilizados, HH4 (16 h) | |
| Stereomicroscópio | Microscópio | Leica Microsystems | MZ9.5 ou similar | |
| Incubadora Automática Marsh | Outro | Lyon | RX | |
| Pinça Curva (1) | Ferramenta | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Pinça (2) | Ferramenta | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Tesoura fina | Ferramenta | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Placas de plástico | Ferramenta | Falcon BD | 353001 | |
| Bomba de borracha | Ferramenta | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pipeta capilar de Pasteur | Ferramenta | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | borda arredondada sob chama |
| Faca de microdissecção | Ferramenta | Fine Science Tools | 10056-12 | Usada para cortar o embrião das membranas circundantes após fixação |
| Agente de cura e base de elastômero de silicone Sylgard 184 | Reagente | Dow Corning | 0001986475 | Misturar 1 parte de agente de cura com 9 partes de base; manter O/N a 37 °C |
| PFA 16% | Reagente | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| H2O2 30% | Reagente | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagente | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Anticorpos Primários | Reagente | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | Para estes anticorpos, os pesquisadores utilizaram doadores de camundongo |
| Anticorpo secundário conjugado com peroxidase: Anti-IgG de cabra anti-murino (H+L) | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidina tetra-hidrocloridrato | Reagente | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Armazenar a -20 °C; deixar o frasco aquecer até a temperatura ambiente antes do uso. |
| Óleo de madeira de cedro | Reagente | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Verde rápido FCF | Reagente | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Alfinetes minutens, diâmetro 0,2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
Referências
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E.
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Reimpressões e permissões
