$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pipetas puxando
Usando um filamento como um extrator Sutter P-97 Flaming Puller microeletrodos / Brown, puxe um conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas.
- Selecione seu vidro. Usamos borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Armazenar o vidro com cuidado para que ele permaneça limpo e livre de poeira.
- Conceber um programa de puxar. O principal objetivo é uma dica de abertura aproximadamente o tamanho desejado, que dependerá da aplicação. P-97 Sutter Cookbook Pipetar 2 é uma excelente referência.
- Observe o seu pipetas sob um microscópio para determinar o diâmetro de abertura e suavidade. Descartar áspera, dicas irregular, ou irregular. Para a gravação normal patch-clamp, uma abertura que é de 2-4 mM todo é melhor. A ponta romba leva a menor resistência para o diâmetro mesma abertura, que é o preferido. Forma e tamanho pode ser modificado durante o polimento, abaixo.
Polimento pipetas pressão
- Anexar um suporte para uma pipeta, comprimido limpo linha de ar. Usando um regulador, definir a linha de ar comprimido a pressão para ~ 40 PSI. Conecte a linha de ar comprimido para uma válvula de controle de 4 vias que permitirá que a pressão titular pipeta a ser ligado e desligado. Conectar um titular pipeta para a válvula de controle com um comprimento de ⅛ em Tygon ® tubulação.
- Use um equipamento de polimento (microforge) com um suporte de pipeta de alta pressão, uma bobina de polimento controlada por um pé-pedal, um microscópio equipado com uma ampliação baixa e alta, longa distância de trabalho (idealmente, 10x e 100x) ar objetivos. É fundamental ser capaz de observar a abertura da pipeta durante o protocolo.
- Opcional: Brasão da pipeta com um isolador hidrofóbicos para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído (consulte "pipetas Puxando" para esta técnica).
- Verifique se a válvula de pressão está na posição off. Coloque uma pipeta no suporte de pipetas e aperte o encaixe para os dedos.
Nota de segurança: Se a pipeta é mantido firmemente no suporte pipeta, a pressão do ar fará com que a pipeta para ser ejetado do titular da pipeta.
- Coloque a pipeta e titular no microforge. Titular posição da pipeta para o palco microscópio para que tanto a ponta da bobina e polimento são visíveis em potência (10x) baixa na microforge. Traga a ponta ~ 75 microns do filamento. Tenha em mente que o filamento se expande quando aquecida.
- Mude para a alta potência objetivas (100x). Tanto a ponta da pipeta e da bobina de polimento deve estar em foco e no campo de visão. Se não, ajuste a altura da bobina de polimento. (Posição A pipeta não pode ser ajustado). A ponta da pipeta e bobina de polimento deve ser perto de lados opostos do campo de visão. Evite posicionar a bobina muito perto da ponta da pipeta porque vai expandir, uma vez que aquece e chocar-se com a pipeta.
- Gire a válvula para direcionar o ar pressurizado para a pipeta, e aquecer a ponta da pipeta até o cone atrás da ponta começa a balão para fora.
- Parar o aquecimento antes da ponta balões também extensivamente. A experimentação é necessária para determinar a distância apropriada, calor e tempo para a forma desejada.
- Opcional: Reduza o diâmetro de abertura ponta a ponta por polimento, na ausência de pressão. As etapas 7 e 8 pode repetir para ajustar tanto a forma e as dimensões da ponta da pipeta.
- Desligue a pressão e ao mesmo tempo apontando a ponta da pipeta para uma direção segura, retire a pipeta e colocá-lo em uma caixa de armazenamento limpa onde será protegido de poeira.
Nota de segurança: Se a pressão do ar não é desligado, a pipeta pode ser expulso do titular pipeta durante a remoção.
Notas sobre a microforge
Nós usamos um microforge montado a partir de off-the-shelf componentes disponíveis comercialmente. (Você também pode comprar um kit de pressão de polimento de algumas empresas, por exemplo, ALA Ciência, GlassWorx). Independentemente do microforge, é essencial ter ótica que são bons o suficiente para ver a abertura da ponta, que é muitas vezes apenas alguns mM de diâmetro. Nós usamos uma lente de longa distância de trabalho 100x para esta finalidade. Além disso, o revestimento da bobina polimento com alta temperatura de fusão de vidro, a fim de minimizar a deposição de metal vaporizado sobre as pipetas.
Parte 3: Resultados Previstos
Polimento pressão moderada pode reduzir a resistência de uma pipeta sem uma alteração significativa na abertura de diâmetro. Se desejar, este protocolo pode ser usado para fazer pipetas com sub-micron aberturas e resistências entre 5-10MΩ.