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Biocombustíveis: Produzindo Etanol a partir de Material Celulósico

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Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

1.3: Using GIS to Investigate Urban Forestry

1.15: Analysis of Earthworm Populations in Soil

53,066 Views

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07:34 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratórios de Margaret Workman e Kimberly Frye – Universidade Depaul

Neste experimento, o material celulósico (como talos de milho, folhas, gramíneas, etc.) será usado como matéria-prima para a produção de etanol. O material celulósico é primeiro pré-tratado (moído e aquecido), digerido com enzimas e, em seguida, fermentado com levedura. A produção de etanol é monitorada usando uma sonda de etanol. O experimento pode ser estendido para otimizar a produção de etanol, variando a matéria-prima utilizada, condições de pré-tratamento, variação enzimática, variação de levedura, etc. Um método alternativo de monitoramento da reação é medir o dióxido de carbono produzido (usando um sensor de gás) em vez do etanol. Como alternativa de baixa tecnologia, os medidores de glicose (encontrados em qualquer farmácia) podem ser usados para monitorar a glicose durante o processo, se uma sonda de etanol ou um sensor de gás carbônico não estiver disponível.

Com uma ênfase maior na “aprendizagem baseada em inquéritos”, as sondas científicas estão se tornando mais populares. Dispositivos portáteis como o Vernier Lab Quest usado em conjunto com uma variedade de sondas (como as de condutividade, oxigênio dissolvido, tensão e muito mais) permitem menos foco na coleta de dados e/ou na criação de gráficos e mais na análise dos dados e na criação de previsões. Outra vantagem é que estes são pequenos e leves e podem ser levados para o campo para medições.

Principles

Os Estados Unidos querem se desmamar dos combustíveis fósseis, especialmente o petróleo usado na gasolina. As mudanças climáticas globais, a dependência de países estrangeiros e o aumento da instabilidade política em todo o mundo são apenas algumas das razões. Uma maneira possível de diminuir a dependência do petróleo como combustível de transporte é usando mais etanol. Atualmente, a gasolina comum contém aproximadamente 10% de etanol como aditivo. Veículos especiais de combustível flex podem usar gasolina E85, que é 85% etanol. ¹

No Brasil, o etanol é feito usando a cana-de-açúcar como matéria-prima. O principal produto da cana-de-açúcar é a sacarose, que é um disscarido de glicose e frutose. A maioria das espécies de leveduras tem a enzima sucrase e são capazes de cortar a glicose – ligação frutose. A sacarose (C₁₂H₂₂O₁₁) é fermentada por levedura para produzir etanol e dióxido de carbono. A reação química geral é mostrada na Equação 1. ^2,3

No entanto, nos EUA, o etanol é feito de milho. O milho armazena carboidratos como um polissacarídeo chamado amido. Isso requer mais esforço do que fazer etanol de cana-de-açúcar porque a levedura não pode cortar os laços em amido. Para fazer etanol a partir do milho, primeiro os grãos de milho precisam ser moídos, em seguida, o milho moído tratado com enzimas para converter o amido no milho em glicose. Após esta etapa, o processo continua como no método da cana acima, utilizando levedura para fermentar a glicose em etanol e dióxido de carbono. A reação química é mostrada na Equação 2. ²

No entanto, a produção de etanol a partir do milho é problemática. Por um lado, tira um pouco de milho da oferta de alimentos, especialmente a ração para o gado, elevando assim os preços. É também intensivo em energia e fertilizantes para produzir milho, diminuindo sua conveniência como alternativa de combustível de transporte ao petróleo. Portanto, os cientistas estão cada vez mais se voltando para material celulósico para fazer etanol. Esses materiais incluem madeira, gramíneas e partes não comestíveis de plantas. Estes são mais desejáveis, pois não afetam o fornecimento de alimentos. No entanto, para liberar a glicose do material celulósico, muito mais esforço é necessário, pois a glicose do material celulósico está ligada à celulose, que é então embrulhada com hemicelluloses e lignina. Primeiro, a celulose precisa ser extraída das hemicelluloses e ligações de lignina. Isso é feito através de um pré-tratamento de moagem e hidrólise ácida. Em seguida, a celulose é tratada com enzimas para dividi-la em seu componente glicose. Finalmente, a glicose pode ser fermentada com levedura para produzir etanol e água. O processo pode ser resumido como mostrado na Equação 3.

Atualmente, isso é muito intensivo em energia para torná-lo um método prático para a produção de etanol em larga escala. No entanto, pesquisas estão em andamento para melhorar o processo. ^2,3

Procedure

1. Preparação da amostra

Selecione o material celulósico para ser usado como matéria-prima. Podem ser talos de milho, gramíneas, folhas, roupas de cama de estimação ou papel.
Usando um moedor de moinho de esferas (ou moedor de café se o moedor de moinho de esfera não estiver disponível), triture matéria-prima em um pó fino sem grandes pedaços restantes.
Meça 1,0 g de matéria-prima e coloque em um tubo centrífuga de 50 mL. Rotule o tubo com a matéria-prima escolhida.
Rotule um segundo tubo de centrífuga de 50 mL como “Controle”. Não coloque nenhuma matéria-prima neste tubo.

2. Pré-tratamento

Configure um béquer de 500 mL com aproximadamente 400 mL de água em uma placa quente e aqueça para ferver suavemente.
Adicione 25 mL de água destilada aos tubos de 2 centrífugas. Redemoinho para misturar. Coloque a tampa nos tubos de centrífugas soltos.
Coloque os tubos de centrífugas no béquer cheios de água fervente suavemente. Certifique-se de que a água do banho de água não vaze nos tubos. Deixe ferver por 30 min.
Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente.

3. Digestão Enzimática

Adicione 1 mL de enzima de célulase aos dois tubos.
Coloque tubos em uma incubadora a 50 °C por 24 h.
Deixe os tubos esfriarem à temperatura ambiente.

4. Fermentação

Adicione 1,0 g de levedura ativa (levedura regular do supermercado está ok) a cada um dos tubos de centrífugas. Redemoinho para misturar.
Coloque uma câmara de ar em cima do tubo de centrífuga. A câmara de ar permite que o CO₂ escape, mantendo a pressão baixa no tubo centrífuga.
Coloque os tubos de centrífugas em um rack e coloque em uma incubadora a 37 °C por 24 h.
Utilizando um sensor de etanol, meça a concentração de etanol no tubo de controle(Figura 1). Os sensores de etanol podem ser adquiridos através da Vernier ou pasco por aproximadamente US$ 100 cada.

Figura 1. Sonda de etanol medindo a concentração de etanol no tubo de controle.
Utilizando um sensor de etanol, meça a concentração de etanol no tubo amostral(Figura 2).

Figura 2. Tablet portátil exibindo % de etanol.

Biocombustíveis são combustíveis derivados de matéria biológica, como plantas. Os biocombustíveis servem como uma alternativa aos combustíveis fósseis, pois podem ser provenientes de culturas em muitas partes do mundo. Além disso, são queimadas mais limpas, reduzindo assim as emissões de gases de efeito estufa.

Um dos biocombustíveis mais utilizados é o etanol derivado da biomassa vegetal, tipicamente cana-de-açúcar e milho. Nos EUA, a maior parte do biocombustível de etanol é produzida a partir do milho.

O uso de culturas de milho como matéria-prima é controverso, pois o milho é intensivo em energia para crescer, usa uma grande quantidade de fertilizantes, e seu uso como matéria-prima remove uma grande quantidade de milho do suprimento de alimentos, especialmente a ração para o gado. Como resultado, o uso de outros materiais vegetais, ou materiais lignocelulósicos, como grama, folhas, papel e partes não comestíveis das culturas está aumentando.

Este vídeo abordará o básico do etanol derivado do material lignocelulósico e demonstrará a produção de etanol a partir de matérias-primas lignocelulósicas em laboratório.

A biomassa lignocelulósica refere-se à matéria vegetal com paredes celulares lenhosas. Esse tipo de matéria vegetal é uma das matérias-primas mais abundantes disponíveis, pois é frequentemente um produto de resíduos da agricultura e da fabricação.

As paredes celulares são compostas do polímero altamente cruzado, lignina, e dois carboidratos complexos, hemicellulose e celulose. A celulose é a principal fonte de açúcares fermentáveis, como a glicose, mas deve ser primeiramente separada dos componentes de lignina e hemiccelulose.

O primeiro passo no processamento do material lignocelulósico é moer finamente a matéria seca da planta em pó. A matéria-prima do solo então passa por um pré-tratamento para quebrar a barreira da lignina e hemicellulose na parede celular, e permitir o acesso à celulose.

Em seguida, a celulose é tratada com enzimas hidrolíticas, como celulase e hemicellulase. A hidrólise enzimática divide a celulose em glicose. Finalmente, a glicose é fermentada com levedura para produzir etanol.

O experimento a seguir demonstra este método passo-a-passo de produção de etanol a partir da biomassa celulósica através da remoção de lignina e hemicellulose, seguido pelo tratamento enzimático da celulose, e a fermentação da glicose para produzir etanol.

Neste experimento, o etanol será produzido a partir de milho, folhas e talos de plantas de milho. Usando um moedor de moinho de esferas, triture a matéria-prima em um pó fino e certifique-se de que não restam pedaços grandes.

Pesar 1 g de matéria-prima, colocá-lo em um tubo de centrífugas de 50 mL e rotulá-lo. Rotule um segundo tubo como a amostra de controle e não adicione nenhuma matéria-prima. Para pré-tratamento das amostras, configure um béquer de 500 mL com aproximadamente 400 mL de água, e leve-o para uma fervura suave.

Adicione 25 mL de água destilada aos dois tubos de centrífugas preparados e tampa-os livremente. Gire os tubos para misturar. Coloque os tubos na água fervente e certifique-se de que a água do banho não vaze nos tubos. Deixe ferver por 30 minutos, depois remova e deixe esfriar até a temperatura ambiente.

Uma vez que os tubos tenham esfriado, adicione 1 mL de enzima de celulase a ambos os tubos. Coloque os tubos em uma incubadora por 24 h. Depois de 24 horas, remova os tubos e deixe esfriar até a temperatura ambiente. O etanol é produzido a partir do material celulósico digerido através da fermentação por levedura. Para iniciar este processo, adicione 1 g de levedura ativa a cada um dos tubos de centrífugas e gire para misturar.

Coloque uma câmara de ar nos tubos de centrífuga. A câmara de ar permite que o dióxido de carbono gerado durante a fermentação escape para que a pressão não se acumule no tubo. Coloque os tubos de centrífugas em um rack e coloque em uma incubadora a 37 °C. Uma vez que a fermentação esteja completa, use um sensor de etanol para medir a concentração de etanol nos tubos de controle e amostra.

Para tornar os biocombustíveis uma fonte de energia competitiva, algumas perguntas sobre a estrutura e o desempenho das matérias-primas devem ser respondidas.

É importante entender a distribuição da lignina em diversas plantas, para que sua remoção possa ser realizada de forma eficiente. Neste exemplo, a distribuição de lignina nas paredes das células vegetais foi analisada cortando camadas finas de uma haste vegetal. As fatias finas foram então imagens usando microscopia confocal com luz laser de 532 nm para criar imagens tridimensionais do caule da planta.

O teor de lignina foi determinado usando espectroscopia de Raman. Combinando as imagens confocal e o espectro de Raman, um mapa tridimensional de distribuição de lignina foi gerado.

Para maximizar a quantidade de bioetanol derivada das matérias-primas das plantas, os tipos de matérias-primas devem ser comparados. Neste exemplo, o etanol foi produzido a partir de papelão, e comparado com o milho stover. O papelão foi preparado como mostrado anteriormente, onde o papelão moído foi submetido ao pré-tratamento, seguido de digestão enzimática, a fim de separar a lignina e hemicellulose do material e quebrar a celulose para a glicose. A glicose extraída foi então fermentada com levedura para produzir etanol. O papelão mostrou-se uma matéria-prima superior ao milho, pois produziu mais que o dobro da concentração de etanol na solução.

Nos Estados Unidos, a grande maioria do bioetanol é produzida a partir do milho. Embora a produção de etanol a partir do milho seja intensiva em energia, é menos complexa do que a produção de etanol a partir da biomassa celulósica.

Para se afastar das matérias-primas do milho, o rendimento da biomassa celulósica deve ser melhor do que o do milho. Neste exemplo, a farinha de milho e o milho foram comparados utilizando-se o mesmo procedimento mostrado anteriormente.

A farinha de milho produziu uma concentração maior de etanol do que o milho stover, mostrando que o milho é uma matéria-prima ligeiramente melhor do que os próprios talos de milho. No entanto, os talos de milho e outras matérias-primas celulósicas são mais abundantes e baratos e podem fornecer uma alternativa viável.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE aos biocombustíveis. Agora você deve entender a produção de etanol a partir de matérias-primas vegetais, e os desafios associados ao processo. Obrigado por assistir!

Results

O % etanol na solução será exibido na tela do tablet portátil utilizando o software relacionado à marca do sensor de etanol utilizado(Figura 2).

Resultados representativos do percentual de etanol produzido por diversas matérias-primas podem ser vistos na Tabela 1.

Matéria-prima	Etanol produzido
Serragem	0.70%
Talos de milho	0.60%
Papelão	1.67%
Switchgrass	0.37%
Controle	0.11%

Mesa 1. Resultados representativos do percentual de etanol produzido por várias matérias-primas.

Applications and Summary

A Lei de Independência e Segurança Energética de 2007 estabeleceu em lei um padrão de combustível renovável. Ele criou uma fase de volumes de combustível renovável começando em 9 bilhões de galões em 2008 e terminando em 36 bilhões de galões em 2022. Desses 36 bilhões, esperava-se que 16 bilhões disso viessem de materiais celulósicos. Para 2014, a proposta original era de 18,15 bilhões de litros de combustível renovável, 1,75 bilhão do que vinha do material celulósico. Infelizmente, com base no volume de etanol celulósico que é viável de ser produzido atualmente, esse número teve que ser reduzido para 17 milhões de litros, de acordo com uma recente proposta da EPA. ¹ Melhorar o processo de criação de etanol a partir de material celulósico é atualmente uma área muito quente de pesquisa. Neste experimento, os alunos estarão emulando as práticas científicas que os cientistas dos principais laboratórios de pesquisa estão seguindo.

Uma variedade de materiais de matéria-prima de biomassa pode ser usada para produzir etanol celulósico para transporte. O Escritório de Tecnologias de Bioenergia do Departamento de Energia dos EUA está focado no desenvolvimento de matéria-prima celulósica a partir de material vegetal não-alimentar e tecnologias relacionadas que permitirão uma conversão economicamente viável dessa biomassa para o transporte de combustível. Eles estão investigando fontes de biomassa que vão desde resíduos agrícolas, culturas energéticas herbáceas e materiais florestais até resíduos de materiais e algas. Nesta atividade laboratorial, os alunos podem variar a matéria-prima que usam e comparar a quantidade de etanol que resulta. As possibilidades incluem milho, gramíneas, folhas, papelão, jornal, papel, flores, etc.

Um obstáculo para a produção em larga escala de etanol celulósico é a natureza cara (tanto em termos de dinheiro quanto de energia) do processo de pré-tratamento. Muita pesquisa está sendo feita sobre a redução desses custos e facilitar a quebra do material celulósico. As empresas enziméticas estão gastando muito tempo e dinheiro desenvolvendo novas enzimas para aumentar o rendimento do etanol. Nesta atividade laboratorial, os alunos podem variar as enzimas que utilizam e comparar a quantidade de etanol que resulta. Uma variedade de enzimas cellulase pode ser comprada de empresas químicas que vendem para escolas, como cellulase de Aspergillus niger ou cellulase de Trichoderma virde. Ou enzimas proprietárias podem ser compradas de empresas especializadas de enzimas, porém estas são caras. Outras enzimas podem ser usadas, como amilase, para comparar sua capacidade de produzir etanol a partir de material celulósico com o das celulas.

Outra área emergente de pesquisa é melhorar a capacidade da levedura de converter biomassa celulósica em etanol. Lignocellulose evoluiu nas plantas para proporcionar estabilidade. Isso se deve ao cruzamento entre celulose e hemicellulose e as ligações de éster em lignina. É necessário separar a celulose da lignina e, em seguida, tratar a celulose para quebrá-la em um monossacarídeo. Além disso, a hemicellulose tem uma alta porcentagem de pentoses como a xilose, que é mais difícil de fermentar do que uma hexose como a glicose. ⁴

References

The Energy Independence and Security Act of 2007. United States Congress, Washington DC. January 4, (2007).
Balat, M., Balat, H., Oz, C. Progress in bioethanol processing. Progress in Energy and Combustion Science. 34 (2008).
Ragauskas, A.J., Williams, C.K., Davison, B.H., Britovsek, G., Cairney, J., Eckert, C.A., Frederick Jr, W.J., Hallett, J.P., Leak, D.J., Liotta, C.L., Mielenz, J.R., Murphy, R., Templer, R., Tschaplinski, T. The Path Forward for Biofuels and Biomaterials. Science. 311 484 (2006).
Demirbas, A. Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from Biomass. Energy Source. 27 327-337 (2005).

Transcript

Biofuels are fuels that are derived from biological matter, such as plants. Biofuels serve as an alternative to fossil fuels, as they can be sourced from crops in many parts of the world. Additionally, they are cleaner burning, thereby reducing greenhouse gas emissions.

One of the most widely used biofuels is ethanol derived from plant biomass, typically sugar cane and corn. In the US, the majority of ethanol biofuel is produced from corn.

The use of corn crops as a feedstock is controversial, as corn is energy intensive to grow, uses a large quantity of fertilizers, and its use as a feedstock removes a large quantity of corn from the food supply, especially feed for livestock. As a result, the use of other plant materials, or lignocellulosic materials, such as grass, leaves, paper, and non-edible parts of crops is increasing.

This video will cover the basics of deriving ethanol from lignocellulosic material, and demonstrate the production of ethanol from lignocellulosic feedstocks in the laboratory.

Lignocellulosic biomass refers to plant matter with woody cell walls. This type of plant matter is one of the most abundant raw materials available, as it is frequently a waste product of agriculture and manufacturing.

The cell walls are composed of the highly crosslinked polymer, lignin, and two complex carbohydrates, hemicellulose, and cellulose. Cellulose is the primary source of fermentable sugars, such as glucose, but it must be first separated from the lignin and hemicellulose components.

The first step in processing of the lignocellulosic material is to finely grind the dry plant matter into a powder. The ground feedstock then undergoes pretreatment to break down the lignin and hemicellulose barrier in the cell wall, and enable access to the cellulose.

Next, the cellulose is treated with hydrolytic enzymes, such as cellulase and hemicellulase. The enzymatic hydrolysis breaks down cellulose into glucose. Finally, the glucose is fermented with yeast to produce ethanol.

The following experiment demonstrates this step-wise method of producing ethanol from cellulosic biomass through the removal of lignin and hemicellulose, followed by the enzymatic treatment of cellulose, and the fermentation of glucose to produce ethanol.

In this experiment, ethanol will be produced from corn stover, the leaves and stalks from corn plants. Using a ball mill grinder, grind the feedstock into a fine powder, and ensure that no large pieces remain.

Weigh 1 g of feedstock, place it into a 50-mL centrifuge tube, and label it. Label a second tube as the control sample, and do not add any feedstock. To pretreat the samples, set up a 500-mL beaker with approximately 400 mL of water, and bring it to a gentle boil.

Add 25 mL of distilled water to the two prepared centrifuge tubes and cap them loosely. Swirl the tubes to mix. Place the tubes in the boiling water, and ensure that the water from the bath does not leak into the tubes. Allow them to boil for 30 min, then remove and let them cool to room temperature.

Once the tubes have cooled, add 1 mL of cellulase enzyme to both tubes. Place the tubes in an incubator for 24 h. After 24 h, remove the tubes and allow them to cool to room temperature. Ethanol is produced from the digested cellulosic material through fermentation by yeast. To begin this process, add 1 g of active yeast to each of the centrifuge tubes, and swirl to mix.

Place an airlock on the centrifuge tubes. The airlock allows the carbon dioxide that is generated during the fermentation to escape so pressure does not build up in the tube. Place the centrifuge tubes in a rack, and place in an incubator at 37 °C. Once fermentation is complete, use an ethanol sensor to measure the ethanol concentration in the control and sample tubes.

To make biofuels a competitive energy source, certain questions about the structure and performance of the feedstocks must be answered.

It is important to understand the distribution of lignin in various plants, so its removal can be performed efficiently. In this example, the lignin distribution in plant cell walls was analyzed by slicing thin layers from a plant stem. The thin slices were then imaged using confocal microscopy with 532 nm laser light to create three-dimensional images of the plant stem.

Lignin content was determined using Raman spectroscopy. By combining the confocal images and the Raman spectra, a three-dimensional map of lignin distribution was generated.

In order to maximize the amount of bioethanol derived from plant feedstocks, the types of feedstocks must be compared. In this example, ethanol was produced from cardboard, and compared to corn stover.The cardboard was prepared as shown previously, where the ground cardboard was subjected to pretreatment, followed by enzymatic digestion in order to separate lignin and hemicellulose from the material and break down the cellulose to glucose. The extracted glucose was then fermented with yeast to produce ethanol. Cardboard proved to be a superior feedstock to corn stover, as it produced more than double the concentration of ethanol in solution.

In the United States, the vast majority of bioethanol is produced from corn. While the production of ethanol from corn is energy intensive, it is less complex than the production of ethanol from cellulosic biomass.

In order to transition away from corn feedstocks, the yield from cellulosic biomass must be better than that of corn. In this example, cornmeal and corn stover were compared using the same procedure as shown previously.

Cornmeal produced a higher concentration of ethanol than corn stover, showing that corn is a slightly better feedstock than the corn stalks themselves. However, corn stalks and other cellulosic feedstocks, are more plentiful and inexpensive and may provide a viable alternative.

You’ve just watched JoVE’s Introduction to Biofuels. You should now understand the production of ethanol from plant feedstocks, and the challenges associated with the process. Thanks for watching!

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