Testes para alimentos geneticamente modificados

1. Extração de DNA de amostras de alimentos

1. Adicione 500 μL de matriz de mistura PCR comprada a cada um dos 2 tubos de tampa de parafuso usando uma tubulação de transferência ou 200-1.000 μL de micropipette de volume ajustável. Pipeta para cima e para baixo com a tubulação entre cada alíquota para misturar uniformemente a matriz PCR.
2. Rotule um tubo de tampa de parafuso "não-OGM" e o outro "teste".
3. Pese 0,5 g de alimentos não transgênicos certificados e coloque-o na argamassa.
4. Adicione 2,5 mL de água destilada e moa com pilão por 2 minutos para formar um chorume.
5. Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo com pilão até que o chorume fique liso o suficiente para pipetar.
6. Pipet 50 μL de chorume moído para o tubo de tampa de parafuso contendo 500 μL de pré-mistura PCR rotulado como "não-OGM" usando a marca de 50-μL em uma tubulação graduada. Tubo de recapitulação.
7. Repita as etapas 1.3-1.6 para preparar a amostra de alimentos de teste.
8. Pipet 50 μL de chorume de alimento de ensaio moído para o tubo de tampa de parafuso rotulado "teste". Tubo de recapitulação.
9. Vórtice os alimentos não transgênicos e tubos pcr de teste por 1 min e coloque tubos em banho de água de 95 °C por 5 min. Se não houver vórtice disponível, aperte o tubo várias vezes para misturar antes de colocar no banho de água.
10. Coloque tubos em uma centrífuga por 5 minutos. Uma pelota sólida deve se formar na parte inferior do tubo. Se a pelota não for formada após 5 min, centrífuga novamente por intervalos de 2 minutos até que a pelota se forme.
11. Os tubos podem ser usados imediatamente para PCR ou armazenados em uma geladeira por até 1 semana.

2. Configuração de reações do PCR

1. Tubos PCR número 1-6 e inicial. Os números devem corresponder aos seguintes conteúdos do tubo listados na Tabela 1.
2. Coloque cada tubo PCR rotulado em um suporte de microtubo com tampas abertas.
3. Usando uma dica fresca para cada adição, adicione 20 μL do primer indicado na Tabela 1 a cada tubo PCR. Tubos de tampa.
4. Utilizando uma ponta fresca para cada tubo, adicione 20 μL da amostra de DNA indicada na Tabela 1 a cada tubo PCR, certificando-se de pipeta apenas do supernatante e evitando a pelota sólida na parte inferior dos tubos.
5. Depois que cada amostra de DNA for pipetada no tubo PCR correspondente, use pipeta para misturar DNA e primer, pipetando suavemente para cima e para baixo; tubos de recapitulação.
6. Coloque tubos PCR no cicloviário térmico e programe o ciclo dor para:
   Denaturação inicial: 1 ciclo a 94 °C por 2 min.
   Amplificação: 40 ciclos a 94 °C para 1 min (desnaturação), 59 °C para 1 min (ressarição) e 72 °C para 2 min (extensão).
   Extensão Final: 1 ciclo a 72 °C por 10 min.
   Por dentro de: 4 °C por tempo indeterminado.

3. 3% Preparação de Gel Agarose

1. Usando fita de laboratório ou mascaramento, fitar com segurança as extremidades abertas da bandeja de gel. Certifique-se de que a fita está selada nas bordas da bandeja para evitar que agarose derretida vaze.
2. Pesar 3 g de agarose em um frasco erlenmeyer de 250 mL ou maior.
3. Adicione 100 mL de tampão TAE 1x (comprado ou preparado a partir do concentrado).
4. Usando uma placa magnética quente com uma barra de mexida, aqueça o béquer até que a agarose esteja completamente dissolvida no tampão e a solução esteja fervendo e fique clara. Alternativamente, um forno micro-ondas pode ser usado colocando béquer no forno e aquecendo por intervalos de 30 s, usando uma haste de mesclagem para misturar a cada 10 s, repetindo até que a mistura esteja fervendo e se deixe claro.
5. Inverta um frasco de Erlenmeyer de 50 mL na abertura do frasco de 250 mL para atuar como um refluxo, impedindo que a solução agarose evapore.
6. Deixe a solução agarose esfriar a 60 °C e despeje 30-50 mL em cada bandeja de gel colada.
7. Coloque um pente de gel no primeiro par de entalhes para criar poços de gel.
8. Deixe o gel esfriar completamente antes de remover a fita e pentear. O gel se solidificará e passará de claro para nublado quando pronto, aproximadamente 10-20 min.

4. Eletroforese de Produtos PCR

1. Coloque um gel de 3% de agarose pré-feito em uma bandeja de gel ou use uma bandeja de gel que tenha sido usada para lançar um gel de 3% de agarose derramado.
2. Deslize a bandeja de gel para a câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo (preto).
3. Despeje 1x tampão TAE na câmara, o suficiente para ter 2 mm de tampão acima da parte superior da bandeja de gel.
4. Obtenha tubos PCR do cicloviário térmico e coloque no suporte de microtubo.
5. Usando uma dica de pipeta fresca cada vez, adicione 10 μL de corante de carregamento Laranja G (LD) comprado em cada amostra e misture bem.
6. Carregar 20 μl da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel na ordem indicada(Tabela 2).
7. Executar eletroforese de gel por 30 min a 100 V.
8. Remova a bandeja de gel da câmara e o gel de slides para remover da bandeja. Coloque gel em uma bandeja de coloração.
9. Mergulhe gel na mancha de gel de DNA comprada por 5 min, cuidadosamente tremendo bandeja para ajudar a distribuir a mancha por todo o gel.
10. Transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira (40-55 °C) por aproximadamente 10 s.
11. Destain lavando 3x em água morna da torneira por 6 min cada com agitação suave para melhores resultados. Se necessário, continue se deseminhando em água morna até que o contraste desejado seja alcançado.

Número do tubo	Cartilha	Amostra de DNA
1	Primer de planta de 20 μL (verde)	DNA de controle alimentar não transgênico de 20 μL
2	Primer 20 μL GMO (vermelho)	DNA de controle alimentar não transgênico de 20 μL
3	Primer de planta de 20 μL (verde)	20 μL Teste dna alimentar
4	Primer 20 μL GMO (vermelho)	20 μL Teste dna alimentar
5	Primer de planta de 20 μL (verde)	DNA de controle positivo 20 μL GMO
6	Primer 20 μL GMO (vermelho)	DNA de controle positivo 20 μL GMO

Mesa 1. Lista dos números de tubos apropriados, primers e amostras de DNA.

Bem 1	Amostra 1 Controle alimentar não Transgênico com primers de plantas 20 μL.
Bem 2	Amostra 2 Controle alimentar não transgênico com primers OGM 20 μL.
Bem 3	Amostra 3 Testar alimentos com primers de plantas 20 μL.
Bem 4	Amostra 4 Alimentos de teste com primers OGM 20 μL.
Bem 5	Amostra 5 DNA positivo OGM com primers de plantas 20 μL.
Bem 6	Amostra 6 DNA positivo de OGM com primers OGM 20 μL.
Bem 7	Régua de peso molecular PCR 20 μL.
Bem 8	Deixe vazio.

Mesa 2. A ordem apropriada para carregar 20 μL da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel.