1.6: Testes para alimentos geneticamente modificados

1. Extração de DNA de amostras de alimentos

1. Adicione 500 μL de matriz de mistura PCR comprada a cada um dos 2 tubos de tampa de parafuso usando uma tubulação de transferência ou 200-1.000 μL de micropipette de volume ajustável. Pipeta para cima e para baixo com a tubulação entre cada alíquota para misturar uniformemente a matriz PCR.
2. Rotule um tubo de tampa de parafuso "não-OGM" e o outro "teste".
3. Pese 0,5 g de alimentos não transgênicos certificados e coloque-o na argamassa.
4. Adicione 2,5 mL de água destilada e moa com pilão por 2 minutos para formar um chorume.
5. Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo com pilão até que o chorume fique liso o suficiente para pipetar.
6. Pipet 50 μL de chorume moído para o tubo de tampa de parafuso contendo 500 μL de pré-mistura PCR rotulado como "não-OGM" usando a marca de 50-μL em uma tubulação graduada. Tubo de recapitulação.
7. Repita as etapas 1.3-1.6 para preparar a amostra de alimentos de teste.
8. Pipet 50 μL de chorume de alimento de ensaio moído para o tubo de tampa de parafuso rotulado "teste". Tubo de recapitulação.
9. Vórtice os alimentos não transgênicos e tubos pcr de teste por 1 min e coloque tubos em banho de água de 95 °C por 5 min. Se não houver vórtice disponível, aperte o tubo várias vezes para misturar antes de colocar no banho de água.
10. Coloque tubos em uma centrífuga por 5 minutos. Uma pelota sólida deve se formar na parte inferior do tubo. Se a pelota não for formada após 5 min, centrífuga novamente por intervalos de 2 minutos até que a pelota se forme.
11. Os tubos podem ser usados imediatamente para PCR ou armazenados em uma geladeira por até 1 semana.

2. Configuração de reações do PCR

1. Tubos PCR número 1-6 e inicial. Os números devem corresponder aos seguintes conteúdos do tubo listados na Tabela 1.
2. Coloque cada tubo PCR rotulado em um suporte de microtubo com tampas abertas.
3. Usando uma dica fresca para cada adição, adicione 20 μL do primer indicado na Tabela 1 a cada tubo PCR. Tubos de tampa.
4. Utilizando uma ponta fresca para cada tubo, adicione 20 μL da amostra de DNA indicada na Tabela 1 a cada tubo PCR, certificando-se de pipeta apenas do supernatante e evitando a pelota sólida na parte inferior dos tubos.
5. Depois que cada amostra de DNA for pipetada no tubo PCR correspondente, use pipeta para misturar DNA e primer, pipetando suavemente para cima e para baixo; tubos de recapitulação.
6. Coloque tubos PCR no cicloviário térmico e programe o ciclo dor para:
   Denaturação inicial: 1 ciclo a 94 °C por 2 min.
   Amplificação: 40 ciclos a 94 °C para 1 min (desnaturação), 59 °C para 1 min (ressarição) e 72 °C para 2 min (extensão).
   Extensão Final: 1 ciclo a 72 °C por 10 min.
   Por dentro de: 4 °C por tempo indeterminado.

3. 3% Preparação de Gel Agarose

1. Usando fita de laboratório ou mascaramento, fitar com segurança as extremidades abertas da bandeja de gel. Certifique-se de que a fita está selada nas bordas da bandeja para evitar que agarose derretida vaze.
2. Pesar 3 g de agarose em um frasco erlenmeyer de 250 mL ou maior.
3. Adicione 100 mL de tampão TAE 1x (comprado ou preparado a partir do concentrado).
4. Usando uma placa magnética quente com uma barra de mexida, aqueça o béquer até que a agarose esteja completamente dissolvida no tampão e a solução esteja fervendo e fique clara. Alternativamente, um forno micro-ondas pode ser usado colocando béquer no forno e aquecendo por intervalos de 30 s, usando uma haste de mesclagem para misturar a cada 10 s, repetindo até que a mistura esteja fervendo e se deixe claro.
5. Inverta um frasco de Erlenmeyer de 50 mL na abertura do frasco de 250 mL para atuar como um refluxo, impedindo que a solução agarose evapore.
6. Deixe a solução agarose esfriar a 60 °C e despeje 30-50 mL em cada bandeja de gel colada.
7. Coloque um pente de gel no primeiro par de entalhes para criar poços de gel.
8. Deixe o gel esfriar completamente antes de remover a fita e pentear. O gel se solidificará e passará de claro para nublado quando pronto, aproximadamente 10-20 min.

4. Eletroforese de Produtos PCR

1. Coloque um gel de 3% de agarose pré-feito em uma bandeja de gel ou use uma bandeja de gel que tenha sido usada para lançar um gel de 3% de agarose derramado.
2. Deslize a bandeja de gel para a câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo (preto).
3. Despeje 1x tampão TAE na câmara, o suficiente para ter 2 mm de tampão acima da parte superior da bandeja de gel.
4. Obtenha tubos PCR do cicloviário térmico e coloque no suporte de microtubo.
5. Usando uma dica de pipeta fresca cada vez, adicione 10 μL de corante de carregamento Laranja G (LD) comprado em cada amostra e misture bem.
6. Carregar 20 μl da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel na ordem indicada(Tabela 2).
7. Executar eletroforese de gel por 30 min a 100 V.
8. Remova a bandeja de gel da câmara e o gel de slides para remover da bandeja. Coloque gel em uma bandeja de coloração.
9. Mergulhe gel na mancha de gel de DNA comprada por 5 min, cuidadosamente tremendo bandeja para ajudar a distribuir a mancha por todo o gel.
10. Transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira (40-55 °C) por aproximadamente 10 s.
11. Destain lavando 3x em água morna da torneira por 6 min cada com agitação suave para melhores resultados. Se necessário, continue se deseminhando em água morna até que o contraste desejado seja alcançado.

Mesa 1. Lista dos números de tubos apropriados, primers e amostras de DNA.

Mesa 2. A ordem apropriada para carregar 20 μL da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel.

Os alimentos geneticamente modificados são produtos que contêm um ingrediente ou ingredientes cujo ADN foi especificamente alterado. A presença dessas modificações pode ser detectada usando uma técnica chamada reação em cadeia da polimerase.

A modificação genética de alimentos tem sido uma questão controversa devido a preocupações debatidas sobre saúde e segurança ambiental. A capacidade de detectar DNA geneticamente alterado em amostras de alimentos de interesse permite a tomada de decisões informadas sobre a segurança e os perigos potenciais do uso de organismos geneticamente modificados, ou OGM, no fornecimento de alimentos.

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é usada para amplificar o DNA alimentar para determinar a presença ou ausência de sequências geneticamente modificadas. A eletroforese em gel então puxa o DNA amplificado através de uma matriz de gel de agarose e separa bandas de DNA de diferentes tamanhos que correspondem a marcadores modificados ou não modificados. Estes são então comparados com bandas de controle de alimentos conhecidos por conter OGM, ou conhecidos por serem livres de modificações.

Este vídeo ilustrará os princípios por trás da detecção de DNA geneticamente modificado em amostras de alimentos, como extrair DNA e amplificar marcadores usados no processo de modificação genética e como a presença ou ausência de OGM em amostras de alimentos pode ser estabelecida.

A reação em cadeia da polimerase identifica sequências de DNA que foram inseridas no alimento geneticamente modificado. O DNA é uma molécula relativamente estável, portanto, fragmentos de DNA viáveis adequados para amplificação podem ser isolados até mesmo de produtos altamente processados, como salgadinhos de milho ou hambúrgueres de vegetais. Um pequeno número de sequências regulatórias de DNA é usado para controlar a expressão de genes inseridos, de modo que essas sequências estão presentes na maioria das culturas GM. Este procedimento identifica dois dos mais comumente usados, o gene promotor 35S e o gene terminador da nopalina-sintase. A sequência 35S é um promotor forte e, quando ligada a um gene inserido, conduz níveis altos e constantes de expressão. O terminador da nopalina-sintase é incluído para interromper a transcrição do gene inserido no ponto final desejado.

A PCR envolve ciclos repetitivos de aquecimento e resfriamento em um termociclador, uma máquina que controla rigidamente a temperatura dos tubos de reação de PCR. Aquecendo a amostra a 94? C faz com que as fitas de DNA desnaturem e se separem. Resfriamento rápido entre 45 e 65 ? C permite que os primers recozerem as fitas de DNA separadas. Finalmente, reaquecendo para 72? C permite que a enzima Taq polimerase estenda os primers e complete a duplicação da região alvo.

O primer vegetal comprado é adicionado a cada amostra e será amplificado em amostras contendo DNA vegetal. Os modelos positivos de OGM para 35S e NOS são usados para fornecer um controle positivo para OGMs. Um não-OGM certificado é usado como controle negativo. Se qualquer uma dessas reações de controle mostrar bandas inesperadas, os resultados das amostras de teste não são confiáveis.

O DNA amplificado é executado através de um gel de agarose por eletroforese. Os produtos de PCR são misturados com um corante e carregados em poços. O DNA é carregado negativamente e, quando carregado no gel na extremidade do cátodo da câmara, se moverá em direção à extremidade do ânodo quando a corrente for aplicada. Fragmentos de DNA maiores não podem se mover tão facilmente através da matriz de gel, então ficarão mais próximos do cátodo, enquanto sequências menores se movem em direção à extremidade do ânodo, resultando na separação de DNA de tamanhos diferentes em bandas distintas.

Após a eletroforese, a coloração em gel ajuda a visualizar as bandas de DNA separadas.

Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da detecção de OGM e do uso de PCR e eletroforese para identificação de OGM, vamos dar uma olhada em como isso pode ser realizado em laboratório.

Uma vez identificados os produtos alimentícios de interesse, a análise pode começar. Para extrair o DNA, pegue dois tubos de tampa de rosca limpos e em cada um deles transfira 500 ? L de reagente de isolamento de DNA adquirido, certificando-se de pipetar a mistura para cima e para baixo entre as alíquotas para misturar uniformemente o reagente. Rotule um dos tubos como "não OGM" e o outro como "Teste".

Em seguida, pese 0,5 g de alimentos não transgênicos certificados e coloque em um pilão limpo. Adicione 2,5 mL de água destilada e triture com o pilão por 2 min para formar uma pasta. Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo a pasta até que fique lisa o suficiente para pipetar.

Pipeta 50 ? L da pasta não-OGM conhecida para o tubo de tampa de rosca marcado como "não-OGM" contendo o reagente de isolamento de DNA. Agora adicione 50 ? L da pasta da amostra de alimento de teste para o tubo de tampa de rosca marcado como "Teste". Vortex os dois tubos contendo as amostras de alimentos e o reagente de DNA por 1 min. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria a 95 ? C por 5 min. Por fim, coloque os tubos em uma centrífuga por 5 min. Após o exame, um pellet sólido deve ser formado no fundo do tubo. Se um pellet não for formado após 5 min, centrifugue novamente por intervalos de 2 min até formar um pellet. As amostras agora podem ser usadas imediatamente para PCR ou armazenadas em uma geladeira por até 1 semana.

Primeiro, o número seis tubos de PCR. Esses números corresponderão ao conteúdo do tubo listado na Tabela. Coloque cada um dos tubos de PCR rotulados em um suporte de microtubo com as tampas abertas.

Usando uma nova ponta para cada adição, adicione 20 ? L indicado na Tabela para cada tubo de PCR. Em seguida, adicione 20 ? L das amostras de ADN indicadas no quadro para cada tubo de PCR. Pipete para cima e para baixo para misturar. Para amostras peletizadas, certifique-se de pipetar apenas do sobrenadante e evite o pellet sólido no fundo dos tubos. Por fim, coloque os tubos de PCR em um termociclador e programe-o para percorrer as etapas de aquecimento e resfriamento indicadas na tabela.

Coloque um gel de agarose a 3% na câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo. Adicione tampão TAE na câmara para cobrir 2 mm acima da bandeja de gel. Colete os tubos de PCR do termociclador e coloque-os em um suporte de microtubo. Usando uma ponta de pipeta nova de cada vez, adicione 10 ? L de DNA comprado carregando corante para cada amostra e misture bem.

Usando uma ponta nova de cada vez, carregue os poços do gel de agarose com 20 ? L de régua de peso molecular em um poço, e 20 ? L de cada amostra em poços subsequentes, conforme indicado nesta tabela. Defina a câmara de eletroforese para funcionar a 100 V por 30 min.

Quando o gel terminar de funcionar, desconecte cuidadosamente a câmara de gel, remova a bandeja e deslize o gel para dentro de uma bandeja de coloração. Mergulhe o gel na mancha de gel 100x comprada por 5 min, sacudindo a bandeja suavemente para distribuir a mancha. Depois de manchado, transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira por aproximadamente 10 s. Destain lavando três vezes em água morna da torneira por 3 min cada, cada uma com agitação suave para obter melhores resultados. Se necessário, continue a descoloração em água morna até atingir o contraste desejado.

A presença ou ausência de uma banda de 200 pb na faixa 4 indica se o alimento de teste contém OGM. Os primers de plantas determinam se o DNA da planta foi extraído com sucesso da amostra. O controle de alimentos não transgênicos é um indicador de resultados falsos positivos, caso ocorram. Se o controle de alimentos não transgênicos for positivo, significa que o PCR foi contaminado em algum momento. O controle de modelo positivo para OGM é um indicador de falsos negativos. Se o controle do modelo positivo para OGM não amplificar, há um problema com a reação de PCR e um resultado negativo para OGM do alimento de teste não é confiável.

Os géis podem ser colocados em um papel branco ou amarelo para fornecer um fundo contrastante para destacar as bandas de DNA, ou o aumento do contraste pode ser obtido usando uma caixa de luz UV.

A capacidade de testar alimentos ou produtos para ingredientes geneticamente modificados é pertinente a uma série de aplicações científicas ou regulamentares.

Há algumas evidências de que o DNA transgênico de culturas geneticamente modificadas pode se tornar introgressado nos genomas de populações de culturas selvagens. Por exemplo, os polinizadores podem facilitar essa transferência fertilizando plantas do tipo selvagem com pólen de uma fonte geneticamente modificada. Isso é uma preocupação, pois os impactos da disseminação desses genes inseridos nos ecossistemas como um todo não são bem compreendidos. O teste de PCR de populações selvagens pode fornecer dados sobre a disseminação potencial ou contenção bem-sucedida de inserções genéticas.

A falta de rotulagem ou rotulagem incorreta de ingredientes geneticamente modificados pode ser uma preocupação do consumidor. Isso pode ser devido à preferência de consumo do consumidor ou à potencial introdução de alérgenos durante o processo de GM, embora este último seja controverso. Em alguns países, os ingredientes geneticamente modificados devem ser listados nas embalagens dos alimentos. Os conselhos reguladores desses países podem usar o teste de PCR para verificar a precisão da rotulagem dos alimentos.

Onde a modificação genética introduzida em uma cultura confere resistência a pesticidas, alguns estudos levantaram preocupações sobre a produção de "superervas daninhas". Essencialmente, podem ser qualquer planta não inicialmente alvo de modificação que obtenha resistência ao pesticida por meio de mecanismos como introgressão ou hibridização. Essas plantas podem então se espalhar com mais sucesso e ser mais difíceis de controlar do que aquelas sem a inserção. O teste de PCR para modificação genética pode ajudar a destacar e rastrear essas populações potenciais para determinar se essa disseminação pode ser problemática.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE ao Teste de alimentos OGM. Agora você deve entender os princípios por trás da identificação de alimentos geneticamente modificados usando PCR, como extrair e amplificar o DNA dos alimentos e como determinar se sua amostra de alimento foi geneticamente modificada. Obrigado por assistir!