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Testes para alimentos geneticamente modificados

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Testing For Genetically Modified Foods

1.3: Using GIS to Investigate Urban Forestry

1.15: Analysis of Earthworm Populations in Soil

89,487 Views

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12:45 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratórios de Margaret Workman e Kimberly Frye – Universidade Depaul

A modificação genética dos alimentos tem sido um tema controverso devido às preocupações debatidas sobre saúde e segurança ambiental. Este experimento demonstra a compreensão técnica de como o DNA alimentar é geneticamente identificado, permitindo a tomada de decisão educada sobre a segurança e os perigos potenciais do uso de organismos geneticamente modificados (OGM) em suprimentos alimentares.

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é usada para amplificar o DNA alimentar para testar a presença de DNA geneticamente modificado em produtos alimentícios. A presença de bandas específicas de DNA é detectada usando eletroforese de gel para extrair DNA de alimentos extraídos através de um gel de 3% de agarose, uma concentração densa o suficiente para separar as faixas de DNA contendo o DNA geneticamente modificado. Vários controles são usados no procedimento de eletroforese para garantir que o DNA seja extraído com sucesso de alimentos de teste (primer de plantas), e para fornecer exemplos conhecidos de DNA geneticamente modificado (DNA geneticamente modificado) e DNA não geneticamente modificado (controle alimentar não-OGM certificado adquirido).

Principles

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) identifica sequências de DNA que foram inseridas na planta GM. Em contraste com as proteínas, o DNA é uma molécula relativamente estável, portanto fragmentos de DNA podem ser isolados de bens altamente processados e estão suficientemente intactos para serem amplificados pelo PCR. Os engenheiros genéticos usam apenas um pequeno número de sequências regulatórias (sequências de promotores e terminadores) para controlar a expressão dos genes inseridos, e por isso essas sequências são comuns à maioria das culturas GM. As duas sequências identificadas neste procedimento são duas das sequências regulatórias mais comuns, o gene promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) e o gene terminator nopaline synthase (NOS) da Agrobacterium tumefaciens.

O PCR envolve ciclos repetitivos, cada um consistindo de desnaturação de modelos, ressarem-se e extensão do primer ressarcido pela polimerase de DNA Taq. Uma vez que o DNA é extraído dos alimentos, um cicloviário térmico é usado para manipular rapidamente a temperatura, causando os estágios dos ciclos pcr.

O estágio de desnaturação ocorre quando as amostras são rapidamente aquecidas a 94 °C, fazendo com que os fios de DNA se separem. O resfriamento rápido a 59 °C permite que os primers se aqueçam aos fios de DNA separados, depois reaqueçam até 72 °C para que a polimerase de DNA Taq amplie os primers, fazendo cópias completas de cada fio de DNA e completando um ciclo térmico.

O DNA amplificado pode então ser executado através de um gel de agarose com eletroforese para separar o DNA em bandas visíveis para identificação do gene promotor 35S e do exterminador do NOS. O DNA amplificado é carregado em poços em uma extremidade do gel, usando um corante de carregamento comprado que ajuda a pesar a amostra para evitar a dissolução no buffer circundante. O corante de carregamento também fornece um visual, de modo que o movimento do DNA pode ser visto durante a eletroforese na “frente” do corante. O processo de eletroforese funciona usando uma corrente elétrica separada em extremidades de cátodo e ânodo. O DNA é carregado no gel na extremidade mais próxima do lado do cátodo da câmara, e a carga negativa de DNA é atraída para a extremidade ânodo da câmara e é puxada através da ágarose. Sequências maiores de DNA (aumento do número de pares de base) não podem se mover tão facilmente através da ágarose e se separarão cedo, enquanto as sequências menores são capazes de viajar mais para baixo do gel em direção ao fim do ânodo.

Um processo de coloração ajuda na vinculação ao DNA, a fim de adicionar contraste entre o gel de fundo e as margens do DNA para melhor visualização dos resultados. Usando locais conhecidos fornecidos para os diferentes tamanhos de sequências de DNA cada gel de teste pode ser analisado para a presença ou ausência dos genes promotores 35S e NOS terminator.

Os controles são usados para garantir que o DNA seja extraído corretamente e para fornecer uma comparação com as amostras de alimentos de teste. O primer da planta comprado é adicionado a cada amostra para fornecer ácidos nucleicos comuns a todas as plantas. Isso permite uma verificação de controle de qualidade no processo de extração de DNA, pois qualquer DNA vegetal extraído deve ser estendido com este primer durante o PCR e também deve ser visto no gel após a eletroforese estar completa. Primer comprado para os genes 35S e NOS são usados como um controle positivo para fornecer bandas de DNA no gel para modificação genética. Se o controle do modelo OGM positivo não se amplificar, há um problema com a reação do PCR e um resultado GMO negativo do alimento de teste não é confiável. Um produto alimentar não transgênico certificado também é comprado e usado como controle negativo para mostrar como é a separação do DNA quando nenhum material geneticamente modificado está presente.

Procedure

1. Extração de DNA de amostras de alimentos

Adicione 500 μL de matriz de mistura PCR comprada a cada um dos 2 tubos de tampa de parafuso usando uma tubulação de transferência ou 200-1.000 μL de micropipette de volume ajustável. Pipeta para cima e para baixo com a tubulação entre cada alíquota para misturar uniformemente a matriz PCR.
Rotule um tubo de tampa de parafuso “não-OGM” e o outro “teste”.
Pese 0,5 g de alimentos não transgênicos certificados e coloque-o na argamassa.
Adicione 2,5 mL de água destilada e moa com pilão por 2 minutos para formar um chorume.
Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo com pilão até que o chorume fique liso o suficiente para pipetar.
Pipet 50 μL de chorume moído para o tubo de tampa de parafuso contendo 500 μL de pré-mistura PCR rotulado como “não-OGM” usando a marca de 50-μL em uma tubulação graduada. Tubo de recapitulação.
Repita as etapas 1.3-1.6 para preparar a amostra de alimentos de teste.
Pipet 50 μL de chorume de alimento de ensaio moído para o tubo de tampa de parafuso rotulado “teste”. Tubo de recapitulação.
Vórtice os alimentos não transgênicos e tubos pcr de teste por 1 min e coloque tubos em banho de água de 95 °C por 5 min. Se não houver vórtice disponível, aperte o tubo várias vezes para misturar antes de colocar no banho de água.
Coloque tubos em uma centrífuga por 5 minutos. Uma pelota sólida deve se formar na parte inferior do tubo. Se a pelota não for formada após 5 min, centrífuga novamente por intervalos de 2 minutos até que a pelota se forme.
Os tubos podem ser usados imediatamente para PCR ou armazenados em uma geladeira por até 1 semana.

2. Configuração de reações do PCR

Tubos PCR número 1-6 e inicial. Os números devem corresponder aos seguintes conteúdos do tubo listados na Tabela 1.
Coloque cada tubo PCR rotulado em um suporte de microtubo com tampas abertas.
Usando uma dica fresca para cada adição, adicione 20 μL do primer indicado na Tabela 1 a cada tubo PCR. Tubos de tampa.
Utilizando uma ponta fresca para cada tubo, adicione 20 μL da amostra de DNA indicada na Tabela 1 a cada tubo PCR, certificando-se de pipeta apenas do supernatante e evitando a pelota sólida na parte inferior dos tubos.
Depois que cada amostra de DNA for pipetada no tubo PCR correspondente, use pipeta para misturar DNA e primer, pipetando suavemente para cima e para baixo; tubos de recapitulação.
Coloque tubos PCR no cicloviário térmico e programe o ciclo dor para:
Denaturação inicial: 1 ciclo a 94 °C por 2 min.
Amplificação: 40 ciclos a 94 °C para 1 min (desnaturação), 59 °C para 1 min (ressarição) e 72 °C para 2 min (extensão).
Extensão Final: 1 ciclo a 72 °C por 10 min.
Por dentro de: 4 °C por tempo indeterminado.

3. 3% Preparação de Gel Agarose

Usando fita de laboratório ou mascaramento, fitar com segurança as extremidades abertas da bandeja de gel. Certifique-se de que a fita está selada nas bordas da bandeja para evitar que agarose derretida vaze.
Pesar 3 g de agarose em um frasco erlenmeyer de 250 mL ou maior.
Adicione 100 mL de tampão TAE 1x (comprado ou preparado a partir do concentrado).
Usando uma placa magnética quente com uma barra de mexida, aqueça o béquer até que a agarose esteja completamente dissolvida no tampão e a solução esteja fervendo e fique clara. Alternativamente, um forno micro-ondas pode ser usado colocando béquer no forno e aquecendo por intervalos de 30 s, usando uma haste de mesclagem para misturar a cada 10 s, repetindo até que a mistura esteja fervendo e se deixe claro.
Inverta um frasco de Erlenmeyer de 50 mL na abertura do frasco de 250 mL para atuar como um refluxo, impedindo que a solução agarose evapore.
Deixe a solução agarose esfriar a 60 °C e despeje 30-50 mL em cada bandeja de gel colada.
Coloque um pente de gel no primeiro par de entalhes para criar poços de gel.
Deixe o gel esfriar completamente antes de remover a fita e pentear. O gel se solidificará e passará de claro para nublado quando pronto, aproximadamente 10-20 min.

4. Eletroforese de Produtos PCR

Coloque um gel de 3% de agarose pré-feito em uma bandeja de gel ou use uma bandeja de gel que tenha sido usada para lançar um gel de 3% de agarose derramado.
Deslize a bandeja de gel para a câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo (preto).
Despeje 1x tampão TAE na câmara, o suficiente para ter 2 mm de tampão acima da parte superior da bandeja de gel.
Obtenha tubos PCR do cicloviário térmico e coloque no suporte de microtubo.
Usando uma dica de pipeta fresca cada vez, adicione 10 μL de corante de carregamento Laranja G (LD) comprado em cada amostra e misture bem.
Carregar 20 μl da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel na ordem indicada(Tabela 2).
Executar eletroforese de gel por 30 min a 100 V.
Remova a bandeja de gel da câmara e o gel de slides para remover da bandeja. Coloque gel em uma bandeja de coloração.
Mergulhe gel na mancha de gel de DNA comprada por 5 min, cuidadosamente tremendo bandeja para ajudar a distribuir a mancha por todo o gel.
Transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira (40-55 °C) por aproximadamente 10 s.
Destain lavando 3x em água morna da torneira por 6 min cada com agitação suave para melhores resultados. Se necessário, continue se deseminhando em água morna até que o contraste desejado seja alcançado.

Número do tubo	Cartilha	Amostra de DNA
1	Primer de planta de 20 μL (verde)	DNA de controle alimentar não transgênico de 20 μL
2	Primer 20 μL GMO (vermelho)	DNA de controle alimentar não transgênico de 20 μL
3	Primer de planta de 20 μL (verde)	20 μL Teste dna alimentar
4	Primer 20 μL GMO (vermelho)	20 μL Teste dna alimentar
5	Primer de planta de 20 μL (verde)	DNA de controle positivo 20 μL GMO
6	Primer 20 μL GMO (vermelho)	DNA de controle positivo 20 μL GMO

Mesa 1. Lista dos números de tubos apropriados, primers e amostras de DNA.

Bem 1	Amostra 1 Controle alimentar não Transgênico com primers de plantas 20 μL.
Bem 2	Amostra 2 Controle alimentar não transgênico com primers OGM 20 μL.
Bem 3	Amostra 3 Testar alimentos com primers de plantas 20 μL.
Bem 4	Amostra 4 Alimentos de teste com primers OGM 20 μL.
Bem 5	Amostra 5 DNA positivo OGM com primers de plantas 20 μL.
Bem 6	Amostra 6 DNA positivo de OGM com primers OGM 20 μL.
Bem 7	Régua de peso molecular PCR 20 μL.
Bem 8	Deixe vazio.

Mesa 2. A ordem apropriada para carregar 20 μL da régua de peso molecular e 20 μL de cada amostra no gel.

Alimentos geneticamente modificados são produtos que contêm um ingrediente ou ingredientes cujo DNA foi especificamente alterado. A presença dessas modificações pode ser detectada usando uma técnica chamada reação em cadeia de polimerase.

A modificação genética dos alimentos tem sido um tema controverso devido às preocupações debatidas sobre saúde e segurança ambiental. A capacidade de detectar DNA geneticamente alterado em amostras de interesse de alimentos permite a tomada de decisões educadas sobre a segurança e os perigos potenciais do uso de organismos geneticamente modificados, ou OGM’s, em suprimentos alimentares.

A reação em cadeia de polimerase, ou PCR, é usada para amplificar o DNA alimentar para determinar a presença ou ausência de sequências geneticamente modificadas. A eletroforese gel então puxa o DNA amplificado através de uma matriz de gel agarose e separa bandas de DNA de diferentes tamanhos que correspondem a marcadores modificados ou não modificados. Estes são então comparados com faixas de controle de alimentos conhecidos por conter OGM, ou conhecidos por serem livres de modificações.

Este vídeo ilustrará os princípios por trás da detecção de DNA geneticamente modificado a partir de amostras de alimentos, como extrair DNA e amplificar marcadores usados no processo de modificação genética, e como a presença ou ausência de OGM’s em amostras de alimentos pode ser estabelecida.

A reação em cadeia de polimerase identifica sequências de DNA que foram inseridas no alimento geneticamente modificado. O DNA é uma molécula relativamente estável, então fragmentos de DNA viáveis adequados para amplificação podem ser isolados mesmo de produtos altamente processados, como chips de milho ou hambúrgueres vegetais.
Um pequeno número de sequências de DNA regulatórios são usadas para controlar a expressão de genes inseridos, de modo que essas sequências estão presentes na maioria das culturas GM. Este procedimento identifica dois dos mais comumente usados, o gene promotor 35S e o gene exterminador de synthase nopaline. A sequência 35S é um promotor forte, e quando ligado a um gene inserido irá conduzir constantes, altos níveis de expressão. O exterminador de synthase nopaline está incluído para interromper a transcrição do gene inserido no ponto final desejado.

O PCR envolve ciclos repetitivos de aquecimento e resfriamento em um cicloviário térmico, uma máquina que controla firmemente a temperatura dos tubos de reação PCR. O aquecimento da amostra para 94 °C faz com que os fios de DNA se desnaturam e separem. O resfriamento rápido entre 45 e 65 °C permite que os primers se aquevam com os fios de DNA separados. Por fim, o reaquecimento para 72 °C permite que a enzima polímerase Taq amplie os primers e a duplicação completa da região alvo.

O primer da planta comprado é adicionado a cada amostra, e irá amplificar em amostras contendo DNA vegetal. Modelos positivos de OGM para 35S e NOS são usados para fornecer um controle positivo para OGM. Um não-OGM certificado é usado como um controle negativo. Se alguma dessas reações de controle mostrar bandas inesperadas, os resultados das amostras de teste não são confiáveis.

DNA amplificado é executado através de um gel de agarose por eletroforese. Os produtos PCR são misturados com um corante e carregados em poços. O DNA é carregado negativamente, e quando carregado no gel na extremidade do cátodo da câmara se moverá em direção ao fim do ânodo quando a corrente é aplicada. Fragmentos de DNA maiores não podem se mover tão facilmente através da matriz de gel, então permanecerão mais perto do cátodo, enquanto sequências menores se movem em direção ao fim do ânodo, resultando na separação do DNA de tamanho diferente em bandas distintas.

Após a eletroforese, a coloração de gel ajuda a visualizar bandas de DNA separadas.

Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da detecção de OGM e do uso de PCR e eletroforese para identificação de OGM, vamos dar uma olhada em como isso pode ser realizado em laboratório.

Uma vez identificados os produtos alimentícios de interesse, a análise pode começar. Para extrair o DNA, pegue dois tubos de tampa de rosca limpos, e em cada uma dessas transferências 500 μL de reagente de isolamento de DNA comprado, certificando-se de pipeta a mistura entre as alíquotas para misturar uniformemente o reagente. Rotular um dos tubos como “não-OGM”, e o outro “Teste”.

Em seguida, pese 0,5 g de alimentos não Transgênicos certificados, e coloque em uma argamassa limpa. Adicione 2,5 mL de água destilada e triture com o pilão por 2 minutos para formar um chorume. Adicione mais 2,5 mL de água destilada e continue moendo o chorume até ficar liso o suficiente para pipeta.

Pipeta 50 μL do conhecido chorume não-OGM para o tubo de tampa de rosca rotulado “não-OGM” contendo o reagente de isolamento de DNA. Agora adicione 50 μL da amostra de alimentos de ensaio ao tubo de tampa do parafuso marcado como “Teste”. Vórtice os dois tubos contendo as amostras de alimentos e reagente de DNA por 1 min. Em seguida, coloque os tubos em um banho de água a 95 °C por 5 min. Por fim, coloque os tubos em uma centrífuga por 5 minutos. Após o exame, uma pelota sólida deve ser formada na parte inferior do tubo. Se uma pelota não for formada após 5 min, centrífuga novamente por intervalos de 2 minutos até que uma pelota se forme. As amostras agora podem ser usadas imediatamente para PCR, ou armazenadas em uma geladeira por até 1 semana.

Primeiro, tubos PCR número seis. Esses números corresponderão ao conteúdo do tubo listado na Tabela. Coloque cada um dos tubos PCR rotulados em um suporte de microtubo com tampas abertas.

Usando uma dica fresca para cada adição, adicione 20 μL de primer indicado na Tabela a cada tubo PCR. Em seguida, adicione 20 μL das amostras de DNA indicadas na Tabela a cada tubo PCR. Pipeta para cima e para baixo para misturar. Para amostras pelleted, certifique-se de pipeta apenas a partir do sobrenante, e evite a pelota sólida na parte inferior dos tubos. Por fim, coloque os tubos PCR em um ciclo de tempo térmico e programe-o para pedalar através das etapas de aquecimento e resfriamento indicadas na tabela.

Coloque um gel de 3% de agarose na câmara de eletroforese com os poços mais próximos da extremidade do cátodo. Adicione o tampão TAE na câmara para cobrir 2 mm acima da bandeja de gel. Colete os tubos PCR do termociclador e coloque-os em um suporte de microtubo. Usando uma dica de pipeta fresca cada vez, adicione 10 μL de corante de carregamento de DNA comprado a cada amostra e misture bem.

Usando uma ponta fresca cada vez, carregue os poços do gel de agarose com 20 μL de régua de peso molecular em um poço, e 20 μL de cada amostra em poços subsequentes, como indicado nesta tabela. Coloque a câmara de eletroforese para funcionar a 100 V por 30 minutos.

Uma vez que o gel tenha terminado de funcionar, desligue cuidadosamente a câmara de gel, remova a bandeja e deslize o gel em uma bandeja de coloração. Mergulhe o gel na mancha de gel de 100x comprada por 5 min agitando a bandeja suavemente para distribuir a mancha. Uma vez manchado, transfira o gel para um recipiente de lavagem e enxágue com água da torneira por aproximadamente 10 s. Destan lavando três vezes em água quente da torneira por 3 minutos cada, cada um com agitação suave para melhores resultados. Se necessário, continue se deseminhando em água morna até que o contraste desejado seja alcançado.

A presença ou ausência de uma banda de 200 bp na faixa 4 indica se o alimento de teste contém OGM. Os primers da planta determinam se o DNA da planta foi extraído com sucesso da amostra. O controle alimentar não transgênico é um indicador de resultados falsos positivos, caso ocorram. Se o controle alimentar não transgênico sair como positivo, significa que o PCR foi contaminado em algum momento. O controle de modelos OGM positivo é um indicador de falsos negativos. Se o controle do modelo OGM positivo não se amplificar, há um problema com a reação do PCR e um resultado GMO negativo do alimento de teste não é confiável.

Os géis podem ser colocados em um papel branco ou amarelo para fornecer um fundo contrastante para destacar faixas de DNA, ou o contraste aumentado pode ser alcançado usando uma caixa de luz UV.

A capacidade de testar alimentos ou produtos para ingredientes geneticamente modificados é pertinente a uma série de aplicações científicas ou regulatórias.

Há algumas evidências de que o DNA transgênico de culturas geneticamente modificadas pode se tornar introgressed nos genomas das populações de culturas selvagens. Por exemplo, polinizadores podem facilitar essa transferência fertilizando plantas do tipo selvagem com pólen de uma fonte geneticamente modificada. Essa é uma preocupação, pois os impactos da disseminação desses genes inseridos nos ecossistemas como um todo não são bem compreendidos. Testes de PCR de populações selvagens podem fornecer dados sobre a potencial propagação, ou contenção bem sucedida, de inserções genéticas.

A falta de rotulagem ou rotulagem incorreta de ingredientes geneticamente modificados pode ser uma preocupação do consumidor. Isso pode ser devido à preferência de consumo do consumidor, ou à possível introdução de alérgenos durante o processo gm, embora este último seja controverso. Em alguns países, ingredientes geneticamente modificados são necessários para serem listados na embalagem de alimentos. Os conselhos reguladores nesses países podem usar testes de PCR para verificar a precisão da rotulagem de alimentos.

Quando a modificação genética introduzida em uma cultura confere resistência a pesticidas, alguns estudos têm levantado preocupações sobre a produção de “super-plantas”. Essencialmente, estas podem ser qualquer planta não inicialmente visada para modificação que obtém a resistência ao pesticida através de mecanismos como introgressão ou hibridização. Essas plantas podem então ser capazes de se espalhar com mais sucesso, e ser mais difíceis de controlar do que aquelas sem a inserção. Testes de PCR para modificação genética podem ajudar a destacar e rastrear tais populações potenciais para determinar se essa propagação pode ser problemática.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE em Testes para Alimentos OGM. Agora você deve entender os princípios por trás da identificação de alimentos geneticamente modificados usando PCR, como extrair e amplificar DNA de alimentos, e como determinar se sua amostra de alimentos foi geneticamente modificada. Obrigado por assistir!

Results

Após a desininagem, os géis podem ser analisados olhando para as rotas de alimentação de teste (Tabela 3) para determinar se as bandas de DNA para os genes 35S promoter e NOS terminator estão presentes nos locais conhecidos no gel. Colocar o gel em uma caixa de luz UV pode ajudar a fornecer contraste aumentado(Figura 1). Alternativamente, os géis podem ser colocados em papel branco ou amarelo para fornecer um fundo contrastante para destacar as faixas de DNA(Figura 2).

Figura 1. Um gel detido mostrando faixas separadas de DNA. Gel agarose após eletroforese de gel agarose na caixa de luz UV.

Figura 2. Diagrama de locais conhecidos para o promotor 35S e DNA exterminador nos. A presença ou ausência de uma banda de 200 bps na faixa 5 indica se o alimento de teste contém ou não OGMs.

Faixa 1: Alimentos não Transgênicos com primers de plantas	455 bp
Faixa 2: Alimentos não Transgênicos com primers OGM	Nenhuma banda
Pista 3: Testar alimentos com primers de plantas	455 bp
Pista 4: Testar alimentos com primers OGM	200 bp ou nenhuma banda
Pista 5: Modelo ogm positivo com primers de plantas	455 bp
Faixa 6: Modelo ogm positivo com primers OMO	200 bp
Pista 7: Régua de peso molecular PCR	1.000, 700, 500, 200, 100 bp

Mesa 3. Tamanhos de banda de amostra pcr (pares de base (bp)).

Applications and Summary

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é usada para amplificar o DNA, permitindo uma ampla gama de testes de laboratório de DNA. Uma área de testes agora possível com PCR é identificar OGMs por meio de testes para presença ou ausência das sequências de DNA utilizadas na modificação genética das culturas alimentares. Tipicamente, uma cultura é geneticamente modificada para conferir uma vantagem contra os impedimentos naturais aos rendimentos ideais, por exemplo, pragas(Figura 3),doenças, condições de seca(Figura 4), etc. Como a vantagem é obtida pela inserção de material genético de uma espécie diferente no próprio DNA da planta, potenciais riscos à saúde humana e ambientais foram identificados com o uso de OGM. Uma preocupação ambiental é a capacidade do DNA geneticamente modificado de ser trocado involuntariamente através de processos de polinização, o que poderia levar à entrada de DNA geneticamente modificado nos genomas das culturas destinadas a serem vendidas como não-OGM.

Figura 3. Larvas de besouro colorado, folhas devoradoras de uma batata.

Figura 4. Milho destruído pela seca.

Transcript

Genetically modified foods are products which contain an ingredient or ingredients whose DNA has been specifically altered. Presence of these modifications can be detected using a technique called the polymerase chain reaction.

Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated concerns over health and environmental safety. The ability to detect genetically altered DNA in food samples of interest allows for educated decision-making about the safety and potential dangers of using genetically modified organisms, or GMO’s, in food supplies.

The polymerase chain reaction, or PCR, is used to amplify food DNA to determine the presence or absence of genetically modified sequences. Gel electrophoresis then pulls the amplified DNA through an agarose gel matrix and separates DNA bands of different sizes that correspond to modified or non-modified markers. These are then compared to control bands from foods known to contain GMO’s, or known to be modification free.

This video will illustrate the principles behind detecting genetically modified DNA from food samples, how to extract DNA and amplify markers used in the genetic modification process, and how the presence or absence of GMO’s in food samples can be established.

Polymerase chain reaction identifies sequences of DNA that have been inserted into the genetically modified food. DNA is a relatively stable molecule, so viable DNA fragments suitable for amplification can be isolated even from highly processed goods, like corn chips or vegetable burgers. A small number of regulatory DNA sequences are used to control the expression of inserted genes, so these sequences are present in the majority of GM crops. This procedure identifies two of the most commonly used, the 35S promoter gene and the nopaline synthase terminator gene. The 35S sequence is a strong promoter, and when attached to an inserted gene will drive constant, high levels of expression. The nopaline synthase terminator is included to stop transcription of the inserted gene at the desired endpoint.

PCR involves repetitive heating and cooling cycles in a thermal cycler, a machine that tightly controls the temperature of PCR reaction tubes. Heating the sample to 94 °C causes DNA strands to denature and separate. Rapid cooling to between 45 and 65 °C allows primers to anneal to the separated DNA strands. Finally, reheating to 72 °C allows the Taq polymerase enzyme to extend the primers and complete duplication of the target region.

Purchased plant primer is added to each sample, and will amplify in samples containing plant DNA. GMO positive templates for 35S and NOS are used to provide a positive control for GMOs. A certified non-GMO is used as a negative control. If any of these control reactions show unexpected bands, the results of test samples cannot be trusted.

Amplified DNA is run through an agarose gel by electrophoresis. PCR products are mixed with a dye and loaded into wells. DNA is negatively charged, and when loaded into the gel at the cathode end of the chamber will move toward the anode end when current is applied. Larger DNA fragments cannot move as easily through the gel matrix so will stay closer to the cathode, while smaller sequences move toward the anode end, resulting in separation of differently sized DNA into distinct bands.

After electrophoresis, gel staining helps visualize separated DNA bands.

Now that we are familiar with the principles behind GMO detection and the use of PCR and electrophoresis for GMO identification, let’s take a look at how this can be carried out in the laboratory.

Once the food products of interest have been identified, analysis can begin. To extract the DNA, take two clean screwcap tubes, and into each of these transfer 500 μL of purchased DNA isolation reagent, making sure to pipette the mix up and down between aliquots to evenly mix the reagent. Label one of the tubes “non-GMO”, and the other “Test”.

Next, weigh out 0.5 g of certified non-GMO food, and place into a clean mortar. Add 2.5 mL of distilled water, and grind with the pestle for 2 min to form a slurry. Add another 2.5 mL distilled water and continue grinding the slurry until it becomes smooth enough to pipette.

Pipette 50 μL of the known non-GMO slurry to the “non-GMO” labeled screwcap tube containing the DNA isolation reagent. Now add 50 μL of the test food sample slurry to the screwcap tube marked “Test”. Vortex the two tubes containing the food samples and DNA reagent for 1 min. Next, place the tubes in a water bath at 95 °C for 5 min. Finally, place the tubes in a centrifuge for 5 min. Upon examination, a solid pellet should be formed at the bottom of the tube. If a pellet is not formed after 5 min, centrifuge again for 2-min intervals until a pellet forms. Samples can now be used immediately for PCR, or stored in a refrigerator for up to 1 week.

First, number six PCR tubes. These numbers will correspond to the tube contents listed in the Table. Place each of the labeled PCR tubes in a microtube holder with caps open.

Using a fresh tip for each addition, add 20 μL primer indicated in the Table to each PCR tube. Next, add 20 μL of the DNA samples indicated in the Table to each PCR tube. Pipette up and down to mix. For pelleted samples, be sure to pipette only from the supernatant, and avoid the solid pellet at the bottom of the tubes. Finally, place the PCR tubes into a thermal cycler and program it to cycle through the heating and cooling steps indicated in the table.

Place a 3% agarose gel into the electrophoresis chamber with the wells closest to the cathode end. Add TAE buffer into the chamber to cover 2 mm above the gel tray. Collect the PCR tubes from the thermocycler and place them in a microtube holder. Using a fresh pipette tip each time, add 10 μL of purchased DNA loading dye to each sample and mix well.

Using a fresh tip each time, load the wells of the agarose gel with 20 μL of molecular weight ruler into one well, and 20 μL of each sample into subsequent wells, as indicated in this table. Set the electrophoresis chamber to run at 100 V for 30 min.

Once the gel has finished running, carefully unplug the gel chamber, remove the tray, and slide the gel into a staining tray. Immerse the gel in purchased 100x gel stain for 5 min shaking the tray gently to distribute the stain. Once stained, transfer the gel into a washing container and rinse with tap water for approximately 10 s. Destain by washing three times in warm tap water for 3 min each, each with gentle shaking for best results. If necessary, continue destaining in warm water until the desired contrast is reached.

The presence or absence of a 200 bp band in lane 4 indicates whether the test food contains GMOs. The plant primers determine whether plant DNA was successfully extracted from the sample. The non-GMO food control is an indicator of false positive results, should they occur. If the non-GMO food control comes out as positive, it means the PCR was contaminated at some point. The GMO-positive template control is an indicator of false negatives. If the GMO-positive template control does not amplify, there is a problem with the PCR reaction and a GMO-negative result from the test food can’t be trusted.

Gels can be placed on a white or yellow paper to provide contrasting background to highlight DNA bands, or increased contrast can be achieved using a UV light box.

The ability to test foodstuffs or products for genetically modified ingredients is pertinent to a number of scientific or regulatory applications.

There is some evidence that transgenic DNA from genetically modified crops can become introgressed into the genomes of wild crop populations. For example, pollinators may facilitate this transfer by fertilizing wild-type plants with pollen from a genetically modified source. This is a concern, as the impacts of the spread of these inserted genes on ecosystems as a whole are not well understood. PCR testing of wild populations can provide data on the potential spread, or successful containment, of genetic inserts.

Lack of labeling, or incorrect labeling of genetically modified ingredients can be a consumer concern. This may be due to the consumer’s preference of consumption, or potential introduction of allergens during the GM process, though the latter is controversial. In some countries, genetically modified ingredients are required to be listed on food packaging. Regulatory boards in such countries may use PCR testing to check the accuracy of food labeling.

Where the genetic modification introduced to a crop confers pesticide resistance, some studies have raised concerns about the production of “super-weeds”. Essentially, these can be any plant not initially targeted for modification that obtains the resistance to pesticide through mechanisms such as introgression or hybridization. These plants may then be able to spread more successfully, and be harder to control than those without the insert. PCR testing for genetic modification can help to highlight and track such potential populations to determine if this spread could prove problematic.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Testing for GMO Foods. You should now understand the principles behind identifying genetically modified foods using PCR, how to extract and amplify DNA from food, and how to determine if your food sample has been genetically modified. Thanks for watching!

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